Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

14.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50588

⸱

13 сентября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Chemical Biology and Signal Transduction, The Rockefeller University

В этой статье

Краткое содержание

Мы генетически кодирования искусственную аминокислоту, р-азидо-L-фенилаланина в различных целевых позиций в GPCRs и показать универсальность азидогруппы в различных приложениях. Они включают в себя целевой фотосшивки технологии для выявления остатков в лиганд-связывающего кармана GPCR и по конкретным участкам bioorthogonal модификацию GPCRs с пептид-эпитопной меткой или флуоресцентного зонда.

Аннотация

Для облегчения структурные и динамические исследования G-белками рецепторы (GPCR) комплексы сигнализации, необходимы новые подходы ввести информативные зондов или наклейки в выраженных рецепторов, которые не нарушают функции рецептора. Мы использовали технологию подавления кодон янтарный генетически-кодирования искусственную аминокислоту, п-азидо-L-фенилаланин (AZF) в различных целевых позиций в GPCRs гетерологично выраженных в клетках млекопитающих. Универсальность азидогруппы иллюстрируется здесь в различных приложениях для изучения GPCRs на родном клеточной среде или под моющих солюбилизированных условиях. Во-первых, демонстрируют на основе клеток целевой фотосшивки технологию для идентификации остатков в лиганд-связывающего кармана GPCR где лиганд малые молекулы меченный тритием сшивают с генетически закодированного азидо аминокислоты. Затем мы продемонстрировать конкретным участкам модификацию GPCRs по bioorthogonal Штаудингера Bertozzi перевязки реакцийТион, что цели азидогруппы использованием производных фосфина. Мы обсуждаем общую стратегию для целевой пептид-эпитопной мечения выраженных мембранных белков в-культуры и ее обнаружения с помощью цельноклеточная подхода, основанного ELISA. Наконец, мы покажем, что AZF-GPCRs могут быть выборочно помечены флуоресцентных зондов. Методики, рассмотренные в целом, в том, что они в принципе может быть применен к любой аминокислотной позиции в любой выражена GPCR чтобы опросить активные комплексы сигнализации.

Введение

Heptahelical G-белком рецепторы (GPCR) содержат суперсемейство очень динамичных мембранных белков, которые обеспечивают важные и разнообразные внеклеточные сигналы. В классической парадигмы, активация рецептора в сочетании с лиганд-индуцированной конформационных изменений. 1, 2 Последние достижения в области структурной биологии GPCRs оказали значительную представление о молекулярных механизмах трансмембранного сигнализации. 3-5 Однако, чтобы понять с большей химической точностью в функциональный механизм и структурная динамика сигнализации GPCR, инструментарий подходов требуется включить информативные молекулярные и химические исследования, чтобы допросить активные комплексы сигнализации.

С этой целью, мы адаптировали метод к сайт-специфически ввести не-или минимально возмущающие зонды в выраженных рецепторов на основе неестественной аминокислоты (UAA) мутагенеза с использованием янтаря кодон технологией подавления ранее пионером Шульц и сoworkers. 6 Мы оптимизировали методологию мутагенеза UAA для достижения выражение высокодоходным и системы мутагенеза для белков, таких как GPCRs, которые трудно выразить в другие, чем клетки млекопитающих наиболее гетерологичные системы. Использование ортогональной инженерии супрессорной тРНК и развивались аминоацил-тРНК синтетазы пару для конкретного UAA, мы сайт-специфически введены УААН в выраженных целевых GPCRs. Успешное включение УААН, п-ацетил-L-фенилаланин (ACF), п-бензоил-L-фенилаланин (БЗФ) и п-азидо-L-фенилаланин (AZF) была продемонстрирована в наших модельных GPCRs - родопсина и человеческий CC хемокинов, CCR5. 7, 8

В принципе, UAA могут быть генетически закодированы в любой позиции внутри белковой последовательности, и это свойство является бесценным биохимический инструмент, поскольку позволяет одним кодонов сканирование целевой GPCR. Мы сосредоточимся именно на универсальность UAA, AZF, которая имеет реактивный Aziсделать группировку. В дополнение к действующей в качестве уникального инфракрасного (ИК) датчика, 8, 9 AZF также может служить в качестве Фотоактивируемые сшивающего агента путем взаимодействия с соседними первичных аминов или алифатических атомов водорода. Кроме того, биологически инертным азидо-группа может участвовать в качестве селективного химического ручкой в ​​bioorthogonal реакций маркировки. Здесь мы представляем примеры, иллюстрирующие полезные применения конкретных участков включения AZF в GPCRs, таких как целевой фотосшиванию ловушку в рецептор-лиганд, и модификации GPCRs по bioorthogonal эпитопной пометки и люминесцентных стратегий маркировки.

Фотоактивируемые реагенты были использованы для изучения биологических систем с 1960 года. 10 В этот период, обилие рецептор-лиганд экспериментов сшивания были зарегистрированы для изучения GPCR комплексы, большинство из которых связано с использованием фотоаффинное лигандов. 11, 12 Однако эти приложений технически ограничено, так как они Requirэ синтез лигандов, несущих сшивания группу. 13-15 Кроме того, с сшивателя фрагмента в лиганда, это сложно определить местоположение пантографа на GPCR. Сайт-специфически введения фотосшивки группы, как УААН в белки с использованием кодонов желтым технологии подавления является ценным продвижение. 16, 17 Мы разработали методику фотосшивки, чтобы определить интерфейс на связывание с рецептором, который участвует в формировании рецептор-лиганд в живых клеток путем введения фотолабильных групп в GPCRs. 18, 19 Здесь мы описываем экспериментальный протокол и способ анализа данных для применения этого целевого технологии фотосшивки идентифицировать сайт связывания лиганда с малой молекулой, меченного тритием маравирок, на CCR5. Этот способ использует преимущества точного количественного определения радиоактивного ручкой на лигандом, в дополнение к сохранению родной химическую структуру лиганда.

Методы флуоресценции основе поддерживать точное понимание структурной основе активации рецептора непосредственно зондирования конформационное состояние рецептора. 20, 21 Однако, методы, обладающие гибкостью ввести флуоресцентные метки в GPCRs сайт-специфически ограничены. Мы заинтересованы в привлечении bioorthogonal стратегии химической модификации для облегчения обнаружения одиночных молекул (SMD) из GPCR сигнализации комплексов. 22 азидогруппу могут участвовать в bioorthogonal химии, таких как Штаудингера Bertozzi перевязки, 23, 24 меди без деформации раскрученной азида- алкин циклоприсоединение (SpAAC) 25 и медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединение (CuAAC). 26 Мы сосредоточимся на перевязки реакции Штаудингера Bertozzi который включает в себя специфическую реакцию между азида и фосфина. Показано, использование двух различных производных фосфин, конъюгированный с эпитопом пептида FLAG (пептид) или флуоресцентной меткой(Флуоресцеина) для достижения конкретного участка модификацию GPCRs.

Мы ранее Оптимизированы условия по конкретным участкам маркировки родопсина AZF варианты с использованием рентгеновской кристаллическую структуру и динамическое моделирование выбрать целевые сайты, которые растворителя подвергается. 27, 28 Мы также проиллюстрировал возможности для достижения фона без маркировки на Staudinger- Bertozzi лигирование. 29 Покажем здесь общей процедуре, используемой для достижения флуоресцентного мечения моющей-солюбилизированного рецептора, который иммобилизован на иммуноаффинной матрицы, а затем визуализировали с помощью флуоресценции в геле. Кроме того, мы демонстрируем полезное расширение на этой маркировки стратегии выявления позиции поддающиеся маркировки на рецептором неизвестной структуры, CCR5. Это осуществляется с помощью целевой мечения стратегию пептид-антигенной детерминанты, которая опирается на bioorthogonal модификации вариантов AZF-ХВГФ в формате полу-высокой пропускной основе клеток. 30 ЭтоМетод основан на использовании свойств обнаружения многоступенчатой ​​из клеточной поверхности ELISA для контроля маркировки события.

Методологии мы обсуждаем здесь носят общий характер и в принципе может быть применен к любой GPCR объединена с AZF помощью янтаря кодонов технологией подавления. В протоколах, представленных здесь мы подробно шаги, участвующие в млекопитающих выражения клеток рецепторов, включенных с УААН, таких как AZF использованием неестественный метод мутагенеза аминокислот и их последующие заявки для облегчения структурные и динамические исследования GPCRs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Сайт-специфическая генетическая Включение неприродных аминокислот в GPCRs

  1. Поддержание HEK293T клеток в DMEM (4,5 г / л глюкозы, 2 мМ глутамина) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы.
  2. Трансфекции клеток, выращенных в 60-80% слияния в 10-см пластины, используя Липофектамин Plus реагента.
    1. Для 750 мкл DMEM, добавить 10 мкл Плюс реагента, 3,5 мкг GPCR кДНК (pMT4. Rho или pcDNA 3.1. CCR5), содержащие янтарную стоп-кодон в желаемом положении, 3,5 мкг супрессора тРНК кДНК (pSVB.Yam) и 0,35 мкг мутантного амино-ацил тРНК синтетазы кДНК р-азидо-L-фенилаланина (pcDNA.RS). Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Также выполняют аналогичную трансфекции с использованием мас GPCR кДНК (не содержащий янтарную стоп-кодон), чтобы служить в качестве контроля. Добавить эту смесь к 750 мкл DMEM с 17 мкл Lipofectamine. После уравновешивания 15 мин при комнатной температуре, довестиОбщий объем до 4 мл.
    2. Аспирируйте СМИ на 10-см пластины, распространяются трансфекции смесь к клеткам, и вернуться к 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы. После 4-6 ч, дополнить клеток с 4 мл среды DMEM, содержащей 20% FBS и 1 мМ AZF.
  3. На следующий день, замените СМИ роста с DMEM, содержащей 10% FBS и 0,5 мМ AZF.
  4. Урожай клеток 48 ч после трансфекции, проанализировать выражение или перейти к фотосшивки или маркировки процедур, описанных в следующих разделах.
    1. Подтверждение экспрессии мутантного янтарного GPCR в присутствии UAA в ростовой среде. Мы делаем это, Западной иммуноблоттинге обнаружения. Lyse осадок клеток в 1% (вес / объем) додецил-β-D-мальтозид (DDM) в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl в течение 1 часа при 4 ° С. Центрифуга лизата при 16000 х г и решить супернатант в восстанавливающих условиях с помощью SDS-PAGE. Переход к PVDF мембрану и провести анализ иммуноблот для обнаружения экспрессии рецептора полнометражный помощью тыс.е 1D4 мАт (Национальный Cell Culture Center), который распознает эпитоп инженерии на С-конце рецептора. 31

2. Отображение сайт связывания лиганда с помощью целевой фотосшивки

  1. 48 ч после трансфекции, аспирации носители из клеток и заменить 4 мл 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Возврат до 37 ° С в течение 15 мин.
  2. Ресуспендируют клеток с 1x PBS и передачи в трубки Сокол. Центрифуге при 1500 оборотах в минуту в течение 2 минут для осаждения клеток и аспирации супернатант.
  3. Ресуспендируют осадок клеток в 1X Хэнка забуференном солевом растворе, содержащем 20 мМ HEPES, рН 7,5, 0,2% БСА и тритием лиганда при концентрации насыщения связывания для требуемого периода времени и температуры, чтобы обеспечить рецептор-лиганд образование.
  4. Передача клеточной суспензии в 24-луночный или 96-луночный планшет для фотоактивации в AZF при 365 нм (например, использовать УФ-лампой) в течение 15 мин при 4 ° С. Maintaiн пластина на льду, чтобы избежать образец отопление и лизис клеток.
  5. Передача клеток в пробирку Эппендорфа, центрифуге для осаждения клеток, удалить супернатант и перейти к анализу. Гранулы можно хранить при -20 ° С для последующего использования.
  6. Ресуспендируют клеточный пеллет в буфере для лизиса, содержащего 1% (вес / объем) DDM, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 и ингибиторы протеаз. После 1-часовой инкубации при 4 ° С, центрифуге клеточного лизата течение 10 мин при 16000 х г и перенести супернатант в новую пробирку.
  7. Добавить 1D4 мАт-Sepharose 2B смолы к надосадочной жидкости и инкубируют в течение ночи при 4 ° С в immunopurify на GPCR с помощью инженерии С-концевой эпитоп 1D4 мАт. На следующий день Вымойте бисером несколько раз буфером для лизиса. Образцы элюируют 1% SDS при 37 ° С в течение 1 часа, встряхивая.
  8. Перенести часть элюента до 15 мл флакон, содержащий сцинтилляционной жидкости и рассчитывать на сцинтилляционном счетчике бета для определения количества специфического связывания меченого тритием лиганда к-йэ рецепторов.
  9. Решить оставшиеся 1D4 мАт очищенной элюент стандартными гель-электрофореза. Мы используем 4-12% геля SDS-страницы, а затем полусухого передачу в PVDF мембраны для иммуноблоттинга. Мы также переулок со стандартным белка лестнице, чтобы вести визуальное приближение молекулярного веса.
    1. Блокировать PVDF мембрану с помощью 5% молока в TBS буфере, содержащем 0,05% Твин-20. Зонд мембрану для подтверждения экспрессии рецептора полнометражный с 1D4 МКА последующим HRP-конъюгированного антитела против мышиного IgG вторичным антителом.
    2. Отнеситесь с усиленной хемилюминесценции (ECL) реагента и подвергать мембрану авторадиографии фильм визуализировать полосы.
  10. Разрежьте мембрану с лезвием бритвы, чтобы отделить каждый образец переулок, а затем резки в определенных маркеров молекулярной массы. Передача сегменты мембраны в пробирки, содержащие сцинтилляционной жидкости. Определения количества трития в каждом сегменте мембраны путем подсчета на бета-сцинтилл ционного счетчика.
  11. Определите положительныйphotocrosslink с обнаружением трития в кажущейся молекулярной массой, равной сумме, что из GPCR и лигандом.

3. Целевые Эпитоп Tagging и клеточной поверхности иммуноферментный анализ (ИФА)

  1. 24 часа в сутки после трансфекции, мыть клетки с 1 мл 1X PBS и Trypsinize 1 мл 0,25% трипсина в течение 3 мин. Дополнение с 9 мл DMEM, содержащей 10% FBS и 0,5 мМ AZF. Ресуспендируют клетки и подсчитать плотность клеток. Мы используем стандартный гемоцитометра.
  2. Предварительная обработка высокую связывания ясно, нижний-96-луночный планшет с 100 мл 0,01 мг / мл поли-D-лизина на лунку. Выдержите в течение 30 мин при комнатной температуре, мыть неоднократно с 1x PBS и воздушно-сухой.
  3. Тарелка 200 мкл трансфицированных клеток при плотности 6 × 10 4 - 8 х 10 4 клеток / лунку в 96-луночный планшет и вернуться к 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  4. На следующий день приготовить клетки для маркировки. Осторожно промыть три раза 100 мкл / лунку 1x PBS то удалять любые AZF содержащий питательной среды. Убедитесь, клетки остаются придерживался, например, с помощью ФБР, содержащим Са 2 + и Mg 2 +.
  5. Подготовка 50-200 мкмоль ФЛАГ-триарилфосфина маркировки реагента в 1x HBSS / PBS из запаса поддерживается на уровне 5-20 мм в PBS. Применить 60 мл в каждую лунку (в трех экземплярах для каждого мутанта янтарной) и вернуть до 37 ° С в течение 30 мин до 4 ч. Поддерживать набор скважин без лечения этикетки в 1x HBSS / PBS. Кроме того, включать контроль GPCR мас сравнить с вариантами AZF-GPCR.
  6. Промывают клетки 3 раза 100 мкл / лунку блокирующего буфера, BB (1X PBS, 0,5% BSA), чтобы удалить непрореагировавший этикетку полностью.
  7. Применить 100 мкл / лунку 4% параформальдегида (приготовленного из 16% складе в 1X PBS) к клеткам. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Промыть три раза BB.
  8. Выполните стандартный протокол клеточной поверхности ELISA для обнаружения надписью рецептор и экспрессии рецептора. Инкубировать с первичным антителом в течение 1,5 часа на льду с последующим вторичным ANtibody инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа.
    1. Добавить 100 мкл анти-FLAG M2 антитела (например, 1:2000 разбавления антител сделано в BB) для обнаружения FLAG пептида эпитоп FLAG-триарилфосфина маркировки реагента. Также зонд без ярлыка обработанных скважин в качестве отрицательного контроля. Добавить против CCR5 2D7 (мы используем разбавления 1:500) антитела к отдельным набором скважин для определения масс или клеточной поверхности выражение AZF-GPCR.
    2. Промывают клетки три раза BB, и инкубируют со 100 мкл HRP-конъюгированного антитела против мышиного IgG вторичного антитела (1:2000 разбавление).
    3. Тщательно промыть клетки в пять раз с BB. Добавить 50 мкл буфера обнаружения: Amplex Red, 20 мМ H 2 O 2, 1x PBS (соотношение 1:10:90) и инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Сбор спектральные данные по флуоресценции многолуночном ридере на λ экс = 530 и λ ет = 590.

4. Bioorthogonal Флуоресцентная маркировка на GPCR

  1. Lyse10 7 Собранные клетки, экспрессирующие вес или варианты AZF-Родопсин в 1 мл солюбилизации буфера, содержащего 1% (вес / объем) DM, 50 мМ HEPES или трис-HCl, рН 6,8, 100 мМ NaCl, 1 мМ CaCl 2 и ингибиторы протеазы за 1 ч при 4 ° С. Центрифуга клеточного лизата при 15000 х г в течение 10 мин и собирают фракцию супернатанта.
  2. Добавить 100 мкл 1D4-МАБ сефарозной 2B смолы захватить рецептор с помощью сконструированного С конца 1D4 эпитоп. Инкубировать в течение 12 часов при 4 ° С. Промыть смолы три раза с 0,1% (вес / объем) DDM в 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,3.
  3. Добавить 0,1 мМ флуоресцеином фосфина в общем объеме 0,3 - 0,5 мл на помеченной рецептор иммобилизован на иммуноаффинной матрицы (1D4-мАт сефарозы 2В). Инкубировать в течение 12 часов при комнатной температуре. Центрифуга и удалить супернатант. Вымойте смолы для удаления непрореагировавшего этикетку.
  4. Элюции меченого рецептора с 100 мл элюирующего буфера, содержащего 0,1% (вес / объем) DDM и 0,33 мг / мл нонапептид (С9 пептид против эпитопа 1D4)в 2 мМ фосфатного буфера, рН 6,0 путем инкубации на льду в течение 1 часа.
  5. Устранение меченых проб в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Вымойте гели кратко в PBS, а затем визуализировать маркировки AZF-GPCR по флуоресценции в геле. Например, использовать конфокальной флуоресцентной сканер с длиной волны лазера 488 нм для обнаружения рецептора модифицированный флуоресцеина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы использовали методику искусственную аминокислоту мутагенеза сайт-специфическое ввести молекулярных зондов в GPCR используя желтым кодон технологии подавления. Схема на рисунке 1 излагаются существенные шаги методологии и различные приложения включения универсальный UAA, п-азидо-L-фенилаланин (AZF), в GPCRs. Выражение AZF-GPCRs в клетках млекопитающих позволяет целевой фотосшиванию лигандов, а также целевые пептид-эпитопную тегов или люминесцентные модификации с GPCR через bioorthogo...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описываем здесь четкой методологии для конкретных участков включения реактивного зонда, AZF, в GPCRs и продемонстрировать три полезные применения этого инструмента для изучения структуры и динамики GPCRs. Наш метод на сайт-специфически включить УААН обходит фундаментальную проблему с альтернативной стратегии, основанной на химически маркировка 32, 33 или установке фотосшивающие 34 к одному доступной цистеина мутанта. Хотя, химические, которые нацелены на тиольных групп цистеина были использованы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим щедрую поддержку нескольких фондов и благотворительных доноров (см. SakmarLab.org).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Плазмида pSVB. Yam(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS для azF(Ye et al., 2009)
Плазмиды pMT4.Rho и pcDNA 3.1.CCR5Опционально содержат янтарный стоп-кодон (TAG) в нужном положении
HEK 293T клеткиАдгезивные клетки
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco10566 
Фосфатный буферный растворGibco14200 
Фетальная бычья сывороткаGemini Bio-products100-106 
Липофектамин плюсинвитрогенЛипофектамин: 18324-012
Плюс: 11514-015		 
p-azido-L-фенилаланинChem-Impex International6162 
 Table 1. Сайт-специфичное генетическое встраивание ненатуральных аминокислот в материалы GPCRs
Maxima ML-3500S UV-A лампаSpectronics CorporationazF активируется 365-нм светом
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco14065 
HEPESIrvine Scientific9319 
Бычий сывороточный альбуминRoche3117405001 
Меченный тритием лигандОт коллаборанта (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-додецил-β-D-мальтозидAnatraceD310LA 
1D4-сефарозная1D4 mAb иммобилизованная на CNBr-активированной сефарозе 2B смола
1% (w/v) додецилсульфата натрия (SDS)Fisher ScientificBP166 
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS гелиInvitrogenNP0322BOXSDS-PAGE выполнены на аппарате NuPAGE
Аппарат Trans-Blot SDBioradАппарат для полусухого переноса
Immobilon polyvinyliden difluoride (PVDF) мембранаMilliporeIPVH00010 
Обезжиренное молокоFisher ScientificNC9934262 
Твин-20Олдрич274348 
Ecoscint ANational DiagnosticsLS-273Сцинтилляционная жидкость
Сцинтилляционные флаконыFisher Scientific333726 
LKB Wallac 1209 Rackbeta Счетчик жидкого сцинтилляцииPerkin ElmerСчетчик бета-сцинтилляции
Антиродопсин 1D4 mAbНациональный центр клеточных культурна заказ 
Пероксидаза хрена (HRP)-конъюгированная антимышиная IgGKPL, Inc.474-1806 
Хемилюминесцентная подложка SuperSignal West PicoThermo Scientific34080 
Пленка Hyblot CL AR DenvilleE3018 
 Таблица 2. Целевые фотосшивающие материалы
0,25% ТрипсинИнвитроген15050065 
ФЛАГ-триарилфосфинСигмаGPHOS1 
M2 FLAG mAbSigmaF1804 
anti-CCR5 2D7 mAbBD Biosciences555990 
Поли-D-лизинSigmaP6407 
96-луночный планшетCostar3601Прозрачное дно, с высоким связыванием EIA/RIA
Фосфатный буферный физиологический раствор (кальций, магний)Gibco14040 
16% параформальдегидEMS28908 
HRP-конъюгированнаяKPL, Inc.474-1516 
антикроличья компания IgGKPL, Inc.474-1516 
Amplex RedInvitrogenA12222 
Перекись водородаDE Healthcare Products97-93399 
Флуоресцентный многолуночный планшетный ридер CytoFluor IIPerseptive Biosystems 
 Table 3. Таргетное пептидное мечение эпитопов и материалы ИФА на клеточной поверхности
Флуоресцеин-фосфин(Huber et al., представлено в 2012 г.)
Нонапептид (пептид C9)AnaSpec62190Пептид, имитирующий 1D4-эпитоп NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-додецил-&бета;-D-мальтозидAnatraceD310LA 
1D4-сефарозная1D4 mAb иммобилизованная на CNBr-активированной сефарозе 2B смола
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS гелиInvitrogenNP0322BOXSDS-PAGE выполнена на аппарате NuPAGE
Конфокальный Typhoon 9400 флуоресцентный сканерGE Healthcareснят с производстваСканер с длиной волны 488 нм
<сильно>Таблица 4. флуоресцентные этикеточные материалы
смола смола ;

Ссылки

  1. Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
  2. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
  3. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  4. Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
  5. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  6. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
  7. Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
  8. Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
  9. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
  10. Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
  11. Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
  12. Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
  13. Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
  14. Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
  15. Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
  16. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
  17. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
  18. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
  19. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
  20. Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
  21. Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
  22. Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
  23. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  24. Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
  26. Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
  27. Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
  28. Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
  29. Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
  30. Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
  31. Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
  32. Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
  33. Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
  34. Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
  35. Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
  36. Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
  37. Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
  38. Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GPCR
Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.