Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стереотаксические Микроинъекции Вирусные векторы, экспрессирующие Cre рекомбиназы для изучения роли генов-мишеней в Кокаин Условные предпочтения Место

18.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50600

⸱

30 июля 2013 г.

 , 
1Graduate Program in Neuroscience, Weill Cornell Graduate School of Biomedical Sciences, 2Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, Weill Cornell Medical College

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья описывает, как microinject вирусных векторов в мозг мыши, а затем проверить в кондиционированной парадигму предпочтения места, которое включает в себя приобретение, исчезновение и восстановление фазы.

Аннотация

Microinjecting рекомбинантных вирусных adenoassociated (rAAV) векторов, экспрессирующих Cre рекомбиназу в различных регионах мозга мыши выборочно нокаутом интерес генов позволяет усилить временно-и регионально-специфический контроль делеция гена, по сравнению с существующими методами. В то время как условная делеция также может быть достигнуто в результате скрещивания мышей, экспрессирующих рекомбиназы Cre под контролем промоторов гена мышей, несущих ген floxed, стереотаксической микроинъекции обеспечивающим направление дискретных областей мозга на экспериментатор определенное время точек интереса. В контексте кокаина кондиционером предпочтение месте, кокаин и другие поведенческие парадигмы, такие как самоуправление или психомоторное сенсибилизации, что может включать в себя вывод, исчезновения и / или восстановления фаз, эта технология особенно полезна в изучении уникального вклада генов-мишеней, чтобы эти отдельные фазах поведенческих моделей, вызванных употреблением кокаина пластичности. В частности,Этот метод позволяет для селективного удаления генов-мишеней во время дискретные фазы поведения, чтобы проверить их вклад в поведение во времени. В конечном счете, это понимание позволяет более целевой терапии, которые являются лучшими в состоянии решать самые мощные факторы риска, которые представляют себя во время каждой фазы аддиктивного поведения.

Введение

Кокаин является весьма укрепления психостимулятор. После неоднократного воздействия, несколько молекулярной и клеточной адаптации происходят в награду-соответствующими схемами мозга, которые, как полагают, приведет к компульсивным наркотиков поведение, побуждая высокой частотой рецидивов, которые представляют серьезную клиническую проблему 1. Кокаин оказывает эти длительные поведенческие эффекты, регулируя экспрессию генов. Для изучения адаптации, которые возникают из-за хронического употребления кокаина, доклинических моделях грызунов широко используются. Одной из таких моделей является кондиционером место предпочтения (CPP) парадигмы. Эта модель включает в себя разработку узнали связь между ранее нейтральную среду и полезный свойств кокаина. После нескольких пар кокаина с конкретной камеры, животным позволяют свободно исследовать кокаин-парных и без кокаина среди парных и если они предпочитают наркотиков парного отделения, они, как говорят, приобрел, вызванных употреблением кокаина НОАКэлектронной предпочтения. Кроме того, после периода обучения исчезновения, эта парадигма может быть использована для изучения конкретных условий восстановления кокаина помощью.

По сравнению с другими поведенческих моделей привыкание поведение как, например, психомоторного аллерген, который используется для изучения долгосрочного кокаин-индуцированное поведенческие и молекулярные пластичность 2,3 и самоуправления (SA), который, как полагают, чтобы более точно имитировать привыкание -подобное поведение у людей, парадигма CPP является простой процедурой для изучения кокаина контекстная обучения 4. CPP протоколов может быть удобно расширена, чтобы включить исчезновение и восстановление фазы, подобно SA, которые позволяют исследование механизмов, лежащих в основе тяга наркотиков и рецидив 5-7 и которые, как полагают резюмировать аспекты того, что происходит в человеческом наркотиков поведение и лекарственное средство - и кий-индуцированной рецидива 8-10.

Один механизм, который лежит в основекокаин-индуцированное поведенческой пластичности, характерного для каждой из отдельных фаз СРР, включая приобретение, исчезновения, и восстановление, активация уникальный подписи экспрессии генов в различных областях головного мозга. Чтобы непосредственно проверить, какие гены в награду-соответствующих регионах мозга посредником, вызванных употреблением кокаина поведенческие изменения, полезно, чтобы иметь возможность манипулировать ими избирательно в регионально-специфическим образом. Одним из способов достижения этой цели является microinject рекомбинантных вирусных adenoassociated (rAAV) векторов, которые выражают Cre рекомбиназу использованием стереотаксической хирургии, в различных областях мозга мышей, которые имеют гены-мишени в окружении сайтов LoxP (floxed мышей). Этот метод позволяет очень точные временные и региональные управления, когда и где гены абляции, в обоих деления и без деления нейронов, не вызывая иммунный ответ 11-13. Такой уровень контроля является важным преимуществом по сравнению с традиционными CRE-LoxP технология разведения мышей floxed Wй мышей, экспрессирующих рекомбиназы Cre под контролем эндогенного промотора гена, в то время и распределение делеции гена может быть более жестко регулируется. Кроме того, вирусный вектор-опосредованного нокаут гена обходит потенциал развития компенсационные эффекты, которые могут происходить с использованием традиционных стратегий нокаутом.

В дополнение к кокаину CPP, который описан здесь, микроинъекции rAAV-Cre в мозг мышей floxed оценить роль определенных генов могут быть применены повсеместно поведенческие парадигмы, которые включают отдельные фазы, в том числе самоуправления и психомоторных сенсибилизации. Например, наша лаборатория использовала rAAV Cre-технологии для изучения роли Ca V 1.2 L-типа Ca 2 + каналов в психомоторном кокаина сенсибилизации 14. В частности, rAAV-Cre было микроинъекции в прилежащем ядре (NAC) мышей с геном, кодирующим Ca объем 1,2 floxed, чтобы продемонстрировать, что Ca объем 1,2, действующих в этом регионе выступает посредником выражение фазы психомоторного сенсибилизации 14,15. Тем не менее, rAAV-Cre стратегия не может быть использован, если мышей с floxed интерес ген не существуют, как это было нашему опыту для оценки роли Са версии 1.3 L-типа Ca 2 +-каналов в психомоторных сенсибилизации. Таким образом, ограничение использования rAAV-Cre представляет себя, если условная мышей не существует для конкретного гена. Тем не менее, rAAVs которые выражают миРНК может быть использована для целевых генов нокдаун, как мы сделали, чтобы изучить роль Ca V 1.3 каналов 14,15.

Microinjecting rAAV-Cre в дискретных областях мозга floxed мышей и затем проверить их в парадигме CPP позволяет по расследованию конкретных генов, которые обеспечивают различные фазы привыкания поведение как и где они действуют. Использование этой парадигмы помог в нашем понимании того, как повторное введение кокаина в сущности захватывает брAINS награда схема вызывает неадекватные изменения в молекулярных сигнальных путей и экспрессии генов, которые приводят к зависимым состоянии 1,16,17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры проводятся в соответствии с Weill Cornell Medical College Уходу за животными и использованию комитета правил.

1. Подготовка и настройка для стереотаксической Доставка вирусных векторов

  1. Если в векселе, стерильный тампон, или руки, носить стерильные перчатки загрязненных вступления в контакт с нестерильной поверхностью, отказать или повторной стерилизации инструмента с использованием горячего стерилизатор шарик, отказаться от тампона или изменить новые стерильные перчатки.
  2. Наведите мышь клетке с постельными принадлежностями на нагревательный блок, чтобы нагреть для послеоперационного восстановления.
  3. Настройка электрическая бритва для бритья головы и этанола и йода для стерилизации кожи головы.
  4. Протрите ухо баров и удержания рта из stereotax с 70% этанола.
  5. Использование 5 мкл шприца Гамильтона, составлять 5 мкл вирусного вектора (1 х 10 6 вирусных частиц / мкл) и создана в держатель шприца на stereotax.
  6. Микроволновая печь грелку или включить электрическую накладка нае место на stereotax. Накрыть чистой абсорбирующей прокладки, чтобы уменьшить риск ожогов. Монитор мыши температуры тела (между 97-99.5 ° F) часто в течение процедуры.
  7. Введите мыши (весом 22-35 г) со смесью кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (20 мг / кг). После того, как мыши под наркозом, кончик хвоста щепотку, чтобы проверить рефлексы мыши и отметить любое движение или ответа для того, чтобы адекватно мышь под наркозом.
  8. Бритье головы между ушами и глазами.
  9. Очистите бритая голова с чередующимися этанола и йода стерильные аппликаторы хлопка.
  10. Передача мышь с подогревом накладка на stereotax.

2. Стереотаксические Микроинъекции вирусных векторов

  1. Носите стерильные перчатки всей операции. Если перчатки загрязнены в любой момент, нажав нестерильных поверхностей, меняйте перчатки.
  2. Нулевой бар зуба и весов ухо бар.
  3. Установить зубов в зубном бар.
  4. Винт в морду. Если шевелить усами или ходния отмечено в любое время, управлять ф бустерной дозы (~ 0,05 см) смеси кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (20 мг / кг).
  5. Винт на ухо баров.
  6. Смажьте глаза PuraLube.
  7. Разрезать кожу головы, чтобы сразу за уши с помощью скальпеля.
  8. Место бульдог клипы на углах кожу головы, чтобы очистить кожу от черепа. Брегмы и лямбда должна быть хорошо видна.
  9. Убедитесь, что шов от темени к лямбда выровненную. Если шов кривым повторно выверить позиционирование головки.
  10. Убедитесь, что все настройки stereotax обнуляются.
  11. Положите кончик иглы в место на темени.
  12. Измерьте все координаты для обоих брегмы и лямбда. Это включает в себя спинной / вентральной, медиальной / боковые и передние / задние координат.
  13. Регулировка подголовника до вентральной координат брегмы и лямбда не находятся в пределах 0,02 мм друг от друга.
  14. Как только выровнена, от темени идут медиально к медиальной / боковая (M / L) координатах. Удостоверитьсялевую и правую стороны выровнены в пределах 0,02 мм друг от друга.
  15. Повторное центр иглы на темени и оттуда двигаться в переднем / заднем (A / P) направление в нужное переднего / заднего координат.
  16. При необходимости угол иглы в одном направлении и убедитесь, что stereotax заблокирована. Перейти на левый M / L координаты (+ / - 1,52)
  17. Измерить вентральной положение верхней части черепа для использования в качестве справочного материала после скважина пробурена.
  18. Дрель скважины помощью стерильного сверла в нужном координат. Убедитесь, что игла может ввести непрерывное через череп.
  19. Опустите иглу в нужное вентральной координат.
  20. Как только будет достигнута координат, DIP 0,015 мм ниже в течение ~ 10 секунд, чтобы создать небольшой карман для вирусного вектора.
  21. Введите желаемого объема вирусный вектор со скоростью ~ 0,1 мкл / мин. Подождите 3 минуты для вирусного вектора диффундировать полностью. Поднимите кончик иглы 0,015 мм и ждать еще 2 мин.
  22. Опустите иглу (если делать инъекции угловой) в противоположном направлении. Опять же, записи вентральной позиции в качестве ссылки для верхней части черепа.
  23. Повторите те же шаги, на первой стороне для введения вирусного вектора на противоположной стороне (если это двусторонний инъекций).
  24. Применение костного воска оба отверстия для уплотнения их с помощью деревянных конец стерильной аппликатор хлопка.
  25. Шовный кожу головы.
  26. Применить блока нерва к раненым области.
  27. Удалить мышь от stereotax и место в клетке на нагревается нагревательный блок для восстановления в течение 45 мин.
  28. Следить за признаками боли, включая: снижение общей активности или беспокойство, снижение потребление пищи и воды или повышенной вокализации. Бупренорфин (0,05 - 0,2 мг / кг) можно вводить два раза в день в течение недели, если это необходимо для боли. Приемлемые альтернативы включают: меперидин (20-60 мг / кг), пентазоцин (10 мг / кг), Нальбуфин (4-8 мг / кг).

3. Условные предпочтения Место: ПРИОБРЕТЕНИЕN, вымирание, и восстановление

  1. Место мышей в центральной камере трехкамерный место предпочтение аппарат (Med Associates, Inc, Сент-Олбанс, VT, USA) для 60 секунд периода привыкания гильотинные двери закрыты.
  2. После приучения, открытые двери гильотинного и позволяют мышам свободное исследование все 3 камеры для 1200 с, причем время, проведенное в каждой камере быть записаны с помощью программного обеспечения MedPC IV (Med Associates, Inc.)
  3. Назначить мышей кондиционирования камер на основе своего выступления во время предварительного теста. Использование предвзятым дизайна, пара медикаментов в течение последующих 3-х дней с отсек, в который был наименее предпочтительным в течение базового предварительного теста.
  4. В течение следующих 3 дней кондиционирования, вводят мышам с кокаином (10 мг / кг; IP) в ходе утреннего заседания и ограничить их в камере назначен на 1200 сек сразу после инъекции. Вернуться мышей, чтобы их дом клетках после сессии. Через 4 ч, вводят мышам физиологический раствор (0,01 мл / г.массы тела) и ограничить их к противоположной камере в течение 1200 сек дневной сессии.
  5. Чтобы проверить на приобретение, место мышей в центральной камере с гильотиной двери закрыты на период привыкания 60 сек. Открытые двери гильотинного и позволяют свободное исследование на 1200 сек, время, проведенное с во всех камерах записаны MedPC IV программное обеспечение (Med Associates, Inc.) Рассчитать предпочтения путем вычитания количества времени, проведенного в солевой камере парные от количества времени, проведенного в кокаин-парные камеры.
  6. Для тушения месте предпочтений, подвергать мышей с двумя 20 мин сессий свободное исследование ежедневно в том же устройстве, разделены по крайней мере 2 часа, начиная с 24 часов после проведения испытаний, для приобретения. Время, проведенное во всех камерах должны снова быть записаны и величины начальной CPP следует сравнению с каждым сеансом.
  7. Определить, является ли мышей потушили медикаментозный предпочтения определить, насколько предпочтение номинальнойОПРЕДЕЛЕННЫХ камере через два дня подряд вымирания значительно ниже, по сравнению с приобретением Оценка предпочтения.
  8. Восстановить мышей с грунтовым дозу кокаина (5 или 10 мг / кг; IP) и повторно подвергать аппарат позволяет свободное исследование и регистрация времени, затраченного в каждом отделении.
  9. Администрирование Euthasol решение эвтаназии (150 мг / кг). Транскардиально заливать мыши с 4% параформальдегида (PFA) и выполнить гистологическое исследование для подтверждения правильного размещения микроинъекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

CPP

После выполнения CPP микроинъецированных на мышах, следует убедиться, что когорта управления впрыском (rAAV-GFP) мышей, который обычно приобретается предпочтение наркотиков парные камеры (рис. 1А, 1Б). Мышей считается приобретшим предпочтение определенному камере, когда кокаин предпочтения (время, проведенное в парной кокаином камере минус время, проведенное в солевой камере парные) значительно выше, по сравнению с исходным предпочтение Оценка (рис. 1В, по сравнению...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Регионально-и временно-специфический ген абляции с помощью стереотаксической микроинъекции вирусных векторов в сочетании с CPP, которая включает исчезновение и восстановление фазы позволяет для исследования конкретного вклада генов в трех различных фазах привыкание-подобное поведение. В то время как условные нокаутом, которая достигается использованием традиционных CRE-LoxP система обеспечивает пространственно-временно запрещен гена абляция, стереотаксически microinjecting CRE-рекомбиназу на дискретные области мозга мыш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Анни Ли Бирн и Морин за помощь в создании расширенного протокола кондиционером предпочтение месте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кондиционированное место предпочтения активности камерыMed Associates, Inc., Сент-Олбанс, Вермонт, СШАMED-CPP-MS
Стереотаксическая система выравнивания для мышиDavid Kopf Instruments, Туджунга, Калифорния, СШАмодель 900
Гамильтон ШприцыHamilton Company, Рино, Невада, США7634-01
rAAV2-Cre-GFPVector BioLabs, Филадельфия, Пенсильвания, США7016
rAAV2-GFPVector BioLabs, Филадельфия, Пенсильвания, США7004

Ссылки

  1. Nestler, E. J. Molecular neurobiology of addiction. American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).
  2. Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction. British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).
  3. Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).
  4. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).
  5. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).
  6. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).
  7. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).
  8. Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients. Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).
  9. O'Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. A learning model of addiction. Research publications - Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).
  10. Stewart, J. Psychological and neural mechanisms of relapse. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).
  11. Bueler, H. Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy. Biological Chemistry. 380, (1999).
  12. Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system. Experimental Neurology. 144 (1), (1997).
  13. Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).
  14. Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels. Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).
  15. Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure. Channels. 6 (1), 11-17 (2012).
  16. Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction. NIDA Research Monograph. 125, (1993).
  17. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence. Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).
  18. Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice. Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).
  19. Li, X., Wolf, M. E. Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis. Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).
  20. Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5. BMC Neuroscience. 5, (2004).
  21. Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  22. Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders. Biotechniques. 39 (3), 9(2005).
  23. Pohl, M., Braz, J. Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions. European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).
  24. Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination. Virus Research. 65 (1), (1999).
  25. Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery. Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).
  26. Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).
  27. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression. Journal of Virology. 63 (9), (1989).
  28. Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), (1994).
  29. Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).
  30. Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Стереотаксические Микроинъекции Вирусные векторы, экспрессирующие Cre рекомбиназы для изучения роли генов-мишеней в Кокаин Условные предпочтения Место
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.