Методическая статья

Трехмерный конфокальный анализ микроглии/макрофагальных маркеров поляризации при экспериментальной травме головного мозга

DOI:

10.3791/50605

⸱

4 сентября 2013 г.

 ,  , 
1Department of Neuroscience, IRCCS - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен способ получить новое представление о сложности воспалительной реакции мозга. Мы описываем протоколы, основанные на иммунофлуоресценции, с последующим трехмерным конфокальным анализом для изучения паттерна коэкспрессии маркеров фенотипа микроглии/макрофагов в мышиной модели фокальной ишемии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После инсульта головного мозга микроглии/макрофаги (М/М) претерпевают быструю активацию с драматическими морфологическими и фенотипическими изменениями, которые включают экспрессию новых поверхностных антигенов и выработку медиаторов, которые накапливают и поддерживают воспалительную реакцию. Новые данные указывают на то, что М/М являются высокопластичными клетками, которые могут принимать классическую провоспалительную (М1) или альтернативную противовоспалительную (М2) активацию после острой черепно-мозговой травмы. Тем не менее, полная характеристика экспрессии маркеров М/М фенотипа, их колокализации и временной эволюции в поврежденном мозге до сих пор отсутствует.

Протоколы иммунофлуоресценции, специфически окрашивающие соответствующие маркеры активации M/M, могут быть выполнены в ишемизированном мозге. Здесь мы представляем протоколы, основанные на иммунофлуоресценции, с последующим трехмерным конфокальным анализом в качестве мощного подхода к исследованию характера локализации и коэкспрессии маркеров фенотипа M/M, таких как CD11b, CD68, Ym1, в мышиной модели фокальной ишемии, вызванной постоянной окклюзией средней мозговой артерии (pMCAO). Двумерный анализ окрашенного участка показывает, что каждый маркер связан с определенной морфологией М/М и имеет заданную локализацию в ишемическом поражении. Паттерны коэкспрессии маркеров фенотипа M/M могут быть оценены с помощью трехмерной конфокальной визуализации в области ишемии. Изображения могут быть получены в определенном объеме (ось Z 10 мкм и шаг 0,23 мкм, что соответствует объему 180 x 135 x 10 мкм) в режиме последовательного сканирования для минимизации эффектов просачивания и предотвращения перекрытия длин волн. Затем изображения обрабатываются для получения трехмерных визуализаций с помощью программного обеспечения Imiris. Твердотельный вид трехмерных визуализаций позволяет определить экспрессию маркеров в кластерах ячеек. Мы показываем, что М/М обладают способностью дифференцироваться в сторону множества фенотипов, в зависимости от локализации в месте поражения и времени после травмы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После острой черепно-мозговой травмы микроглия быстро активируется и претерпевает драматические морфологические и фенотипические изменения1-3. Эта внутренняя реакция связана с рекрутированием макрофагов, рожденных кровью, которые мигрируют в поврежденную паренхиму мозга4,5. Роль микроглии и макрофагов, которые антигенно неразличимы (далее именуемые М/М) при повреждении головного мозга, все еще обсуждается. Все большее число исследований указывает на то, что, подобно тому, что описано для периферических макрофагов, микроглия и макрофаги, рекрутируемые мозгом, могут принимать различные фенотипы, крайности которых соответствуют классическому провоспалительному токсическому (М1) или противовоспалительному защитному (М2) фенотипу. Различные состояния активации, включая секрецию про- или противовоспалительных факторов, высвобождение нейротрофических молекул и лизосомальную активность, характеризуются специфическим паттерном фенотипических маркеров, экспрессия которых зависит от временной эволюции окружающей среды. Характеристика этих М/М фенотипов в поврежденном мозге все еще скудна. Мы использовали хорошо зарекомендовавшую себя мышиную модель pMCAo для анализа экспрессии и эволюции M/M после инсульта. Представленные здесь протоколы, основанные на иммунофлюоресценции, направлены на получение информации о появлении специфических маркеров фенотипа М/М, их локализации и клеточной коэкспрессии в области ишемии. Мы исследовали несколько молекул, связанных с различным состоянием активации или фенотипом, а именно CD11b, поверхностный маркер, экспрессируемый лейкоцитами, и широко используемый маркер M/M активации/рекрутмента6-8, CD68, маркер лизосом6,7 и Ym1, секреторный белок, экспрессируемый альтернативно активированными (M2) макрофагами и связанный с восстановлением и восстановлением функции9-10.

Когда два маркера экспрессируются одной клеткой, но в разных субклеточных компартментах, сама по себе колокализация может быть не очень информативной. В этом случае анализ коэкспрессии может быть выполнен с использованием одноплоскостного вида и трехмерной визуализации. Здесь мы описываем протокол для получения тщательного трехмерного анализа коэкспрессии маркеров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Иммунофлюоресценция

Следующий протокол выполняется на корональных криосекциях мозга, полученных от транскардиально перфузиированных мышей (20 мл PBS, 0,1 моль/литр, pH 7,4, затем 50 мл охлажденного параформальдегида 4% в PBS). После перфузии мозг осторожно удаляют и переносят до 30% сахарозы в PBS при 4 °C на ночь для криозащиты. Затем мозг быстро замораживают погружением в изопентан при температуре -45 °C на 3 минуты, а затем запечатывают в флаконы и хранят при -70 °C до использования. Корональные криоссекции головного мозга (20 мкм) разрезают серийно и подвергают иммунофлюоресцентному протоколу 11, 6.

Доведите все реагенты и образцы до комнатной температуры перед использованием. Обратите внимание, что представленные рабочие разведения антител и сыворотки получены в результате испытаний, проведенных с целью получения наилучших результатов. При использовании различных антител и сыворотки протокол должен быть валидирован.

Обратите внимание, что поскольку первичные антитела против CD11b и против CD68 вырабатываются у крыс, чтобы избежать перекрестного сигнала от анти-крысиного Alexa 546, мы использовали сильное разведение анти-CD11b с последующим усилением флуоресцентного сигнала с помощью набора TSA (Cy5 Tyramide). Мы установили оптимальное рабочее разведение анти-CD11b, выполнив описанный протокол, за исключением шага 1.17, и используя, по меньшей мере, 7 различных разведений анти-CD11b, как показано в таблице 1. В результате было выбрано значение 1:30 000 в качестве единственного разбавления, обеспечивающего: 1) видимый сигнал с Cy5 на длине волны возбуждения 646 нм; 2) отсутствует сигнал с Alexa 546 на длине волны возбуждения 532 нм. Таким образом, флуоресцентный сигнал Alexa 546 избирательно связан с экспрессией CD68.

Оптимальные разведения антител против CD11b и анти-CD68 могут варьироваться в зависимости от типа ткани и должны быть определены до начала протокола совместного мечения.

  1. Дважды промойте криосекцию мозга PBS.
  2. Инкубируйте криосекции в течение 5 мин в PBS, содержащем 1% H2O2 (этап необходим, так как флуоресцентная амплификация требует инкубации с пероксидазой хрена, стрептавидином-HRP, см. шаг 1.12).
  3. Промыть криосекции 2 раза с PBS.
  4. Инкубировать криосекции в течение 60 мин в PBS, содержащем 10% NGS и 0,3% тритона.
  5. Инкубируйте криосекции при 4 °C в течение ночи в PBS, содержащем первичный анти-CD11b Ab Rat [1:30,000], 10% NGS и 0,3% тритона.
  6. Промыть криоучастки 2x (5 мин) PBS.
  7. Инкубировать криосекции в течение 60 мин в PBS, содержащем биотинилированный вторичный анти-Rat Ab [1:200] и 1% NGS.
  8. Промыть криосекции 2 раза с PBS.
  9. Промыть криорезы тротилом (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 М TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
  10. Инкубировать криосекции в течение 1,5 ч в TNB (Tris-HCl-NaCl-блокирующий буфер: 0,1 М TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% блокирующий реагент из соответствующего набора (см. таблицу реактивов)).
  11. Промойте криосекцию 3 раза тротилом.
  12. Инкубируйте криосекции в TNB, содержащей стрептавидин-HRP [1:100].
  13. Промыть криосекции 3 раза тротилом.
  14. Инкубируйте криосекции в течение 8 минут в разбавителе амплификации, содержащем тирамид цианина 5 [1:300].
  15. Промойте криосекции 3 раза с PBS.
  16. Инкубируйте криосекции в течение 60 минут в PBS, содержащем 10% NGS и 0,1% тритона.
  17. Инкубируйте криоссекции при 4 °C в течение ночи в PBS, содержащем первичный анти-CD68 Ab Rat [1:200], 3% NGS и 0,3% тритона.
  18. Промойте криосекции 3 раза с PBS.
  19. Инкубировать криосекции в течение 60 мин в PBS, содержащем фторконъюгированный вторичный Ab Alexa 546 anti-Rat [1:500] и 1% NGS.
  20. Промойте криосекции 3 раза с PBS.
  21. Инкубировать криосекции в течение 10 мин в PBS, содержащем Hoechst 1 мкг/мл.
  22. Промойте криосекции 3 раза с PBS.
  23. Монтируйте криосекции в Prolong Gold.

2. Получение трехмерных изображений с помощью конфокальной микроскопии

Здесь использовался микроскоп IX81, оснащенный конфокальным сканирующим блоком FV500 с 3 лазерными линиями: Ar-Kr (488 нм), He-Ne красный (646 нм) и He-Ne зеленый (532 нм) и УФ-диодом.

  1. Выбор возбуждающих лазеров зависит от длин волн возбуждаемых флуоресцентных красителей (He-Ne красный для Cy5, CD11b; He-Ne зеленый для Alexa546, CD68 и УФ-диод для Hoechst, ядра).
  2. Выберите наилучшую комбинацию дихроичных зеркал для сбора светового сигнала.
  3. Установите разрешение изображения не менее 800 x 600 пикселей.
  4. Определите интересующую область с помощью эпифлуоресценции и постепенно увеличивайте увеличение до 40-кратного объектива.
  5. Переключитесь на метод лазерной сканирующей микроскопии (LSM).
  6. Выполняйте повторяющиеся сканирования для регулировки фотоумножителя (ФЭУ) и усиления для каждого канала. Лазеры могут быть включены по отдельности для облегчения настройки. Держите коэффициент усиления как можно ниже, чтобы избежать нежелательных неспецифических сигналов.
  7. При выполнении повторяющегося сканирования перемещайте регулятор фокусировки, чтобы определить нижнюю и верхнюю крайние точки оси Z (общая длина оси Z = 10 мкм).
  8. Остановите повторное сканирование.
  9. Определите размер шага. Оно должно быть максимально приближено к размеру пикселя (0,225 мкм) для получения стандартного соотношения размеров 1:1 по оси z.
  10. Активируйте фильтр Калмана не менее 2 раз.
  11. Активируйте режим последовательного сканирования, чтобы избежать эффектов просвечивания.
  12. Пройдите половину пути по оси Z и запустите последовательное сканирование по оси xy. Проверьте настройку ФЭУ и усиление (хорошее соотношение сигнал/шум). Если это не устраивает, повторите шаг 2.6.
  13. Запустите сбор xyz.
  14. Экспортируйте данные в виде файла multitiff. Каждый файл multitiff обычно содержит 3 цветовых канала (синий, зеленый и красный) и 44 фокальные плоскости.

3. Трехмерное представление конфокальных захватов и трехмерного рендеринга

Загрузите файлы multitiff в программу Imaris и обработайте их следующим образом:

  1. Открытое программное обеспечение.
  2. Выберите вид за пределами поля.
  3. Загрузите файл multitiff.
  4. Выберите нужный цвет для каждого канала.
  5. Уберите шум из фона, увеличив минимальное значение на панели настройки дисплея. Настраивайте каждый канал индивидуально.
  6. Перейдите к виду раздела. Перемещайтесь по оси z в поисках колокализации (желтые пиксели).
  7. Щелкните по желтой области, чтобы увидеть, присутствует ли колокализация вдоль оси z (т.е. принадлежит ли она твердотельному объекту). Проекции по оси Z видны в правой и нижней части рисунка.
  8. Сделайте снимок.
  9. Вернитесь к превосходному виду.
  10. Обрезайте 3D, чтобы изолировать клетку или кластер клеток.
  11. Выберите один канал на панели настройки дисплея.
  12. Выберите построитель алгоритмов выхода/поверхностей. Шаги алгоритма:
    1. Выберите канал.
    2. Определите порог (используйте то же минимальное значение на панели настройки дисплея).
    3. Определите изменение размера.
    4. Определите сглаживание (best = 0.200).
    5. Определите внешний вид цвета.
    6. Конечный алгоритм.
  13. Повторите шаг 3.12 для каждого канала.
  14. Отмените выбор флуоресцентных каналов на панели настройки дисплея и выберите все три поверхности.
  15. Перемещайте громкость, чтобы найти наилучший вид.
  16. Сделайте снимок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пример результатов, полученных при проведении протоколов мечения и конфокальных сборов в ишемизированную область, проиллюстрирован на рисунках 1А и 1В. Двухмерный вид полученных изображений показывает, что через двадцать четыре часа после ишемии (А) лизосомальный маркер CD68 (зеленый) экспрессируется в гипертрофированных амебоидных клетках CD11b (красный), присутствующих в ишемизированном ядре. В пограничной зоне (В) CD11b-положительные клетки имеют круг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем здесь протоколы, основанные на иммунофлуоресценции с последующим трехмерным конфокальным анализом, в качестве мощного подхода к исследованию локализации и коэкспрессии маркеров фенотипа M/M в ишемической области (более подробный анализ см. в ссылке 6). Этот метод сочетает в себе специфическое окрашивание релевантного маркера М/М активации с трехмерной конфокальной визуализацией. Тонкая настройка антител, сыворотки и фторсопряженных рабочих разведений позволяет обеспечить оптимальное соотношение...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стефано Фумагалли является членом Фонда Монцино.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Materials
Rat Anti-mouse CD11bЛюбезно предоставлено доктором А. Дони, Istituto Clinico Humanitas, Милан, Италия
Rat Anti-mouse CD68 AbD SerotecMCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1 Stem Cell Technologies1404
H– chst 33342Life technologiesH21492
Мышиные антинейронные ядра (NeuN)CHEMICONMAB377
Биотинилированная козья антикрысиные антителаJackson Immuno Research112-065-143
TSA Cyanine 5 System Perkin ElmerNEL705A001KT
пролонгировать золото InvitrogenP36930
Anti-rat alexa 546InvitrogenA-11081
Anti-mouse Alexa 488InvitrogenA-21121
Anti-rabbit Alexa 594InvitrogenA-11037
Нормальная козья сывороткаVectors LaboratoriesS-1000
Tritin X-100SigmaT8787
Фосфат буферизованный физиологический растворSigmaP4417-100
Equipment
Cryostat CM1850Конфокальный микроскоп Leica
Olympus IX81 Программное обеспечение Olympus
AnalySISПрограммное обеспечение Olympus
Imaris 5.0Bitplane
Photoshop cs2Adobe Systems
GraphPad Prism версия 4.0ГрафПад Софтвер Инк.
Пакеты программного обеспечения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  2. Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
  3. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
  4. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
  5. Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
  6. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
  7. Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
  8. Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373(2007).
  9. Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943(2011).
  10. Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
  11. Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
  12. Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD11b CD68 Ym1MCAOImarisZ

Похожие статьи