Методическая статья

Количественный и временной контроль кислорода микроокружения в Единой Иле уровня

DOI:

10.3791/50616

⸱

17 ноября 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan-Dearborn, 2Department of Surgery/Transplant, University of Illinois at Chicago, 3Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрофлюидных контроль кислорода дает больше, чем просто удобство и скорость в течение гипоксии камер для биологических экспериментов. Особенно, когда осуществляется путем диффузии через мембрану, Микрожидкостных кислород может обеспечить одновременное жидкости и газовой фазы модуляции на микроуровне уровне. Этот метод позволяет динамические мульти-параметрические эксперименты важны для изучения островок патофизиологии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одновременное оксигенации и мониторинг глюкозы стимул-секреции факторов связи в одном техники имеет решающее значение для моделирования патофизиологические состояния островков гипоксии, особенно в трансплантации средах. Стандартные гипоксические методики камерные не может модулировать как стимуляции в то же время и не предоставляет мониторинг в реальном времени глюкозы стимул-секреции факторов связи. Для решения этих трудностей, мы применили многослойную микрофлюидных технику, чтобы интегрировать как водные и газовой фазы модуляции с помощью диффузионной мембраны. Это создает бутерброд стимуляции вокруг microscaled островков внутри прозрачного полидиметилсилоксана (PDMS) устройства, что позволяет контролировать вышеупомянутых факторов связь через флуоресцентной микроскопии. Кроме того, ввод газа регулируется с помощью пары микродиспенсерами, обеспечивая количественные, суб-минутные модуляции кислорода между 0-21%. Это прерывистый гипоксия применена к исследованию новое явление островат предварительная. Кроме того, на вооружении мультимодальных микроскопии, мы были в состоянии смотреть на подробной кальция и динамики канала К АТР в эти гипоксии событий. Мы предполагаем микрофлюидных гипоксии, особенно это одновременное технику двойного фазы, как ценный инструмент в изучении островки, а также многие бывшие естественных условиях ткани.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамический гипоксия играет важную роль в биологии, специально для трансплантации островковых клеток

Динамический гипоксия является важным физиологическим а также патофизиологические параметр во многих биологических тканей. Изменение кислорода, например, является мощным сигналом развития ангиогенеза. Кроме того, пространственные и временные закономерности в гипоксии модулировать HIF1-альфа и играть роли в таких болезней, как рак поджелудочной железы. Гипоксия также смешанным фактором, влияющим на островковых результаты пересадки. В последнее время во времени колебания гипоксии или прерывистой гипоксии (IH) продемонстрировали преимущества в "предварительной подготовки" островках 1. Тем не менее, как статические, так и переходные эффекты гипоксии на островок физиологии до сих пор не понятны или учились, в первую очередь из-за отсутствия соответствующих инструментов для управления микросреду островок в.

Островки хорошо васкуляризации в естественных условиях

Панкреатических островков являются 50-400 56; м сфероидальные агрегаты эндокринных клеток, в том числе бета-клеток и альфа-клеток, которые отвечают за гомеостазе глюкозы. Когда островки подвергаются стимуляции глюкозы в крови, поглощения и гликолиза приводит к продукции АТФ, что открывает АТФ-чувствительные калиевые (K ATP) каналы и результаты в притока кальция, который вызывает экзоцитоз гранул инсулина. Кислород важно управлять этим сильно метаболический процесс и секреция инсулина в значительной мере определяется динамикой кровотока и доставки кислорода в дополнение к градиентов глюкозы. Островки легко выполнить эту реакцию глюкозы к инсулину в естественных условиях, так как они очень перфузии в поджелудочной железе, каждый в пределах одной длины клеток из капиллярной судна. Тем не менее, густая сеть intraislet капилляров удаляют коллагеназы во островок изоляции 2,3. Следовательно, оба кислорода и питательных материалы ограничены к периметру 100 мкм из-за диффузионных ограничений.

шаг "> Современные методы имеют ограниченный успех в воссоздании островок микросреду

Родные динамики кислорода и глюкозы воссоздания островок, ключевой для моделирования физиологических и патофизиологических условий, трудно достичь с помощью стандартных гипоксии камер, которые требуют сложного поток и не имеют постоянного мониторинга функций островков. Кроме того, трансплантации терапии для диабета типа I подвергать изолированные островки к гипоксии в печеночную воротную систему 4, который имеет значительно более низкую рО 2 (<2%, 5-15 мм рт.ст.) по сравнению с физиологическим поджелудочной железы (5,6%, 40 мм рт.ст.). Постпересадки, что трансплантаты островковых клеток взять две недели или больше, чтобы быть реваскуляризации. Было показано, что гипоксическая воздействие ухудшает глюкозо-инсулин соединительный механизм островок в. Среди стимул-секреции соединительные факторов, сигнальных кальция, митохондриальные потенциалов и инсулина кинетики может быть легко контролируется с использованием микрофлюидики. Наш предыдущий микрофлюидных техника продемонстрировала эту ремониторинга аль-время с точным модуляции водной микросреды вокруг одного островка 5,6. Однако количественная оценка гипоксического обесценение островок в тупике из-за отсутствия одновременной стимуляции и мониторинга методов. Таким образом, комбинируя микрофлюидных контроль кислорода и мониторинга островков может улучшить островковых исследования гипоксии.

Microfluidics может воссоздать и модулировать водный и кислородный микросреду

Стандартная техника для тканей и культура гипоксии исследований было основано на гипоксии камер. В общем, гипоксические камеры обеспечивают одно-концентрации кислорода со временем уравновешивания в ~ 10-30 мин, несовместимых с минутным масштабных динамической гипоксии. Два недавних исследования использовали небольшие пользовательские камеры для периодического воздействия гипоксии на всей мышей, с противоречивыми результатами по индуцированной глюкозой инсулинового ответа 7,8. Имейте в виду, что в целом уровень животного, respired кислород непосредственно не переходпланируется островок капилляр рО 2, в связи с управления в дыхательную систему. Кроме того, эти исследования не имеют стандартизированные уровни кислорода, и они не обеспечивают меры в реальном времени на тканевом уровне островков.

С другой стороны, кислород микрофлюидики может превзойти эти ограничения, контролируя кислород газа через сети каналов. Кроме того, микрофлюидики совместим с живого изображения при модуляции кислорода, подвиг в настоящий момент невозможно со стандартными гипоксии камер. Ряд этих новых микрофлюидики подходы использовать газопроницаемость полидиметилсилоксана распустить концентрации кислорода в микроканалов, которые текут качестве носителя клеток-мишеней 9-14. Эти устройства также интегрированы несколько дискретных концентрации кислорода, флуоресценция на основе кислородных датчиков, и даже химическую поколение кислорода на-чипе.

Жидкие сольватационные основе микрофлюидики иметь трудное время поддержания стабильных, непрерывные градиенты, как ят зависит от конвективного перемешивания, который чувствителен к течь условия. Для сравнения, метод мы используем здесь фокусируется на уменьшении путь диффузии доставки кислорода. Сольватация и расхода газа сдвига устраняются непосредственно диффузии кислорода через мембрану засеянного клетками или островковых тканей. Это устраняет лишние микрофлюидики необходимые для управления сольватацию и предотвращает ненужное напряжение сдвига к островков, которые само по себе может вызвать высвобождение инсулина. Эта платформа была использована для демонстрации активных форм кислорода (АФК) до регулирования в обоих гипероксических и гипоксии экстремальных значений (2-97% O 2) в клеточной культуре 1,15. Из-за прямой доставки кислорода и удаления сдвигового течения, наша диффузии-платформа обеспечивает оптимальное микрофлюидных решение для изучения островок гипоксии.

Мультимодальные стимулирование и контроль

Распространение на основе микрофлюидики также приносит дополнительные выгоды, если она адаптирована для изучения островковых миcrophysiology. При использовании мембраны в качестве диффузионного барьера, жидкость может быть выделен из кислорода модуляции, позволяя управления водного стимуляции глюкозы независимо от гипоксии стимуляции. Это создает сэндвич-как одновременное стимулирование, что пространственно пин-точек поставки в островках. Кроме того, как газ временно модулированного с помощью компьютеризированных microinjectors, можно модулировать концентрации кислорода от 21-0% цифровой с переходным время меньше, чем 60 сек. Динамические элементы управления кислорода и микросреды глюкозы в микроскоп позволяет в режиме реального времени мультимодальные протокол, который не был бы возможным или чрезвычайно громоздким, используя стандартные гипоксические камеры. С помощью этого устройства, сигнализация кальция (Фура-AM), митохондриальные потенциалов (родамина 123), и инсулина кинетика (ELISA) были проверены, чтобы обеспечить полное представление о динамических характеристик глюкозо-инсулин под гипоксии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка мыши Islets

  1. Проанализируйте мышей C57BL / 6 и изолировать островки на коллагеназой и Ficoll плотности разделения градиента. (См. статьи Юпитера ссылки в 2,3).
  2. Инкубировать островков в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 20 мМ HEPES в чашках Петри (37 ° C, 5% CO 2). После изоляции, культура островков в течение 24 часов до использования в экспериментах. Используйте островки в течение 1-2 дней, чтобы обеспечить устойчивые результаты.

2. Создание Микрофлюидных Платформа

  1. Генерирование микроструктуры геометрии на прозрачность фотошаблонов для каждого слоя устройства: 1) впускные и выпускные, 2) Глюкоза Микрожидкостных слоя с perifusion камеры (8 мм диаметр х 3 мм, 150 мкл), 3) 200 мкм мембрана с лунок (диаметр 500 мкм, 100 мкм в глубину), и 4) микрофлюидных слои газа.
  2. Для изготовления слой входе и выходе, залить дегазированный предварительно смешанные PDMS, чтобывысота 1,5 мм в пустой чашке Петри и лечения при 80 ° С в течение 2 часов. Удар диаметром 2 мм ввода / из портов.
  3. Для изготовления микрожидкостных слой глюкозы, спина два 350 мкм слои SU8-2150 образуют единый 700 мкм слой на 4 в кремниевой пластине.
    1. Expose ультрафиолетовый свет через соответствующий фотошаблонов для передачи микроканальную шаблон на SU8 после разработки, производя высокий мастер 700 мкм.
    2. Налейте дегазируют предварительно смешанные PDMS на этой мастера на высоту 3 мм и вылечить при 80 ° С в течение 2 часов. Вырезать это PDMS формировать с лезвием бритвы.
    3. Удар диаметром 2 мм портов ввода / вывода, а также 8 мм камеру диаметра.
  4. Чтобы изготовить 200 мкм мембрану с лунок, спина SU8-2100 до 100 мкм. Применить же УФ-литографии передать образцы микролуночные на этого высокого мастера 100 мкм.
    1. Спин дегазируют, предварительно смешанные PDMS на этой мастера при 900 оборотах в минуту в течение 30 сек и вылечить при 80 ° С в течение 10 мин. Спипа второй слой поверх первого, используя те же условия, в результате чего мкм PDMS мембраны 200, содержащего шаблоны микролуночные.
    2. Удар 2 мм портов ввода / вывода диаметра, через эту мембрану
  5. Чтобы изготовить газа микрофлюидных слой, спина SU8-2100 до 100 мкм. Применить же УФ-литографии для передачи газа микрофлюидных узоры на этого высокого мастера 100 мкм.
    1. Налейте дегазируют предварительно смешанные PDMS на этой мастера на высоту 1,5 мм и вылечить при 80 ° С в течение 2 часов. Разрежьте PDMS формировать с лезвием бритвы.
    2. Удар 2 мМ портов ввода / вывода диаметра через этот слой
  6. Для связывания нескольких слоев, подготовить их путем очистки скотчем, обнажая в коронном дуги, а затем выравнивание вручную в следующем порядке.
    1. Бонд мембрану на нижний слой газа с микролунки вверх.
    2. Бонд Микрожидкостных глюкозы в верхней части микропланшетным мембраны.
    3. Бонд входе и выходе слоя Oн самый верх, инкапсуляции весь узел.
    4. Усиление св зывание добавлением 1 кг массы сверху и обжига при 100 ° С в течение 3 часов.
  7. Герметичные проверить заполненную устройства путем загрузки воды в водный слой, а затем погружение все устройство под водой. Затем воздушный поток через слой газа с пустой шприц.
  8. Стерилизовать утечек устройств с 70% этанола через водный слой затем промойте их PBS буфера, в котором устройство не хранится при температуре 4 ° С до использования.

3. Microdispenser установки

  1. Получить 2 микродозаторов 5 В и 20 В источника постоянного тока, а также цифровой платы ввода / вывода для построения смешивание кислорода и настройку доставки.
    1. Подключите управляющие кабели микродиспенсерами "к прилагаемому динамиками.
    2. Подключите драйверы с цифровой платы ввода / вывода в портах, соответствующих LabVIEW управления.
    3. Подключите блок питания 5 В и 20 В до соответствующих контактов на диске универец.
    4. Подключите цифровых входов / выходов к ноутбуку выполнять LabVIEW коды газового контроля (приложение).
  2. Подключите один microdispenser в азот, а другой для сжатого воздуха, и с 5% СО 2. Установите оба газов до 2 фунтов на квадратный дюйм. Подключите выходы дозаторы 'в Т-образном перекрестке перед входом в микрожидкостных устройств.
  3. Используя устройство утечки проверенные, характеризуют переходную характеристику модуляции кислорода на велосипеде в микродиспенсерами между 5-21% кислорода, в то время как измерения растворенного кислорода в воде с датчиком оптического волокна кислорода (см. список оборудования и репрезентативные результаты).

4. Настройка на микроскопии

  1. Установите устройство к нагретой этапе на инвертированный микроскоп.
  2. Подключите 0% и 21% O 2 газов к устройству и калибровки с датчиком кислорода.
  3. Подключите выходной порт из микрофлюидики глюкозы в коллектор фракций.
  4. Подготовка бикарбонат Кребс звонкабуфер (КРФ): 129 мм NaCl, 5 мМ NaHCO 3, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 1 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 1,2 ммоль MgSO 4 · 7H 2 O, 10 мМ HEPES рН 7,35-7,40 , 2 мМ базального уровня глюкозы и 5% FBS.
  5. Приготовьте два буферных растворов, содержащих 2 мм и 14 мМ глюкозы соответственно в 50 мл конические пробирки купались в 37 ° С водяной бане.
  6. Подключите перистальтического насоса для рисования буфер при 250 мкл / мин в трубке. Перед входом в микрожидкостных устройств потока трубки над плитой 37 ° C.
  7. Чтобы окрасить островки, добавить Фура-2 утра в ДМСО и Rh123 в 100% этаноле до 2 мл KRB достичь концентрации окончательные красителя 5 мкм и 2,5 мкм, соответственно.
  8. Встреча островки с 10 мкл пипетки и инкубировать в красителей в течение 30 мин при 37 ° С
  9. Загрузить около 20 островков в устройство через входное отверстие микроканальной глюкозы. Направьте островки в камеру на грунтовки буфер из розетки обратно в тна входе он.
  10. Заливать островки в буфере в течение 10 мин, чтобы смыть избыток краски.

5. Запуск Одновременная кислорода и глюкозы стимуляция

  1. Доставка импульс стимуляции глюкозы с 5 мин базовой линии, установленной KRB2, а затем 15 мин 14 мМ стимуляции, затем промыть в течение 15 мин в KRB2.
  2. Запись 340/380 нм длина волны возбуждения для Фура-2 и 534 эмиссии для Rh123.
  3. Произвести измерения нормального импульса (14 мм нормоксических) перед каждым экспериментом.
  4. Для модуляции кислорода (гипоксия / прерывистый гипоксия), применяются только буфера потока во время стимуляции и стадий промывки и без потока в других шагов, чтобы свести к минимуму конвективные возмущения.
  5. Сбор сточных вод от розетки глюкозы в минутными интервалами 1 для ELISA инсулина анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Центральное место в этой технике островок гипоксии является способность модулировать водной и газовой фазы стимуляции в той же камере с микрофлюидный минут масштабных переходных процессов. Рисунок 1 является представителем результат а) двойной стимуляции и б) быстро модуляции, измеренные в островковых камеры. Водный модуляции, показано введение флуоресцеина в камеру, достигает равновесия в 3:57 минут после смешивания. Кроме того, кислород можно вышел из 5-21% с быстрыми переходными, что позволяет на вел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Множественные модальности, интегрированные в эту технику островковой гипоксии, представляют собой несколько отмеченных здесь моментов для устранения неполадок. Во-первых, изолированные островки продолжают деградировать и распадаться в культуре из-за пищеварительных ферментов из ацинарных клеток. Таким образом, стандартизация экспериментов в течение 1-2 дней после выделения островков имеет решающее значение для получения стабильных результатов. Во-вторых, водный поток останавливался во время гипоксии и периодической гипок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE) и Чикагским диабетическим проектом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagent/Material
SpinnerLaurellWS-400
SU8 MicroChemSU8-2150/SU8-2100
Цифровая нагревательная пластинаPMC Dataplate722A
Лампа УФ-отвержденияOmniCureS1000
PMDSDow ChemicalSylgard 184
Corona WandETPBD-20AC
Вакуумная камераBel-Art420220000
МикродозаторыThe Lee CompanyIKTX0322000A
5 В и 20 В постоянного тока PowerRadio Shack
NI USBNational InstrumentNI USB-6501
ТермометрOmega Engineering, Inc.
Перистальтический насосGilsonMinipulse 2
Датчик кислородаOcean OpticsNeoFox
Сборник фракцийGilson203
PippetteFisher ScientificFinnpipette II 100μ l
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскопLeicaDMI 4000B
50 мл Конические пробиркиFisher Scientific
Fura-2 Флуоресцентный красительМолекулярные зонды, Life Technologies
Флуоресцентный краситель 123Молекулярные зонды, Life Technologies
Питательные средыSigma-AldrichRPMI-1640
HEPESSigma-Aldrich
ГлюкозаSigma-Aldrich
Бычья сыворотка альбуминSigma-Aldrich
30 в силиконовых трубкахCole-Parmer1/16 in x 1/8 in
1,5 мл Eppendorf TubesFisher Scientific
Y-образные соединителиCole-ParmerШприцевые соединители 1/16 дюйма и 4 мм
Cole-Parmerс внутренней резьбой Luer Plug 1/16 in
Прямые разъемыCole-Parmer1/16 in
Угловой соединительCole-Parmer1/16 in

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
  2. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125(2009).
  3. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343(2009).
  4. Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  5. Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649(2010).
  6. Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
  7. Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
  8. Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
  9. Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
  10. Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
  11. Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
  12. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
  13. Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
  14. Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
  15. Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Microfluidic HypoxiaOxygen ModulationIslet IsolationFluorescence MicroscopyPDMS DeviceGas Permeable MembraneCalcium DynamicsKATP ChannelIntermittent HypoxiaGlucose Stimulus

Похожие статьи