Количественный и временной контроль кислорода микроокружения в Единой Иле уровня

Summary

Микрофлюидных контроль кислорода дает больше, чем просто удобство и скорость в течение гипоксии камер для биологических экспериментов. Особенно, когда осуществляется путем диффузии через мембрану, Микрожидкостных кислород может обеспечить одновременное жидкости и газовой фазы модуляции на микроуровне уровне. Этот метод позволяет динамические мульти-параметрические эксперименты важны для изучения островок патофизиологии.

Abstract

Одновременное оксигенации и мониторинг глюкозы стимул-секреции факторов связи в одном техники имеет решающее значение для моделирования патофизиологические состояния островков гипоксии, особенно в трансплантации средах. Стандартные гипоксические методики камерные не может модулировать как стимуляции в то же время и не предоставляет мониторинг в реальном времени глюкозы стимул-секреции факторов связи. Для решения этих трудностей, мы применили многослойную микрофлюидных технику, чтобы интегрировать как водные и газовой фазы модуляции с помощью диффузионной мембраны. Это создает бутерброд стимуляции вокруг microscaled островков внутри прозрачного полидиметилсилоксана (PDMS) устройства, что позволяет контролировать вышеупомянутых факторов связь через флуоресцентной микроскопии. Кроме того, ввод газа регулируется с помощью пары микродиспенсерами, обеспечивая количественные, суб-минутные модуляции кислорода между 0-21%. Это прерывистый гипоксия применена к исследованию новое явление островат предварительная. Кроме того, на вооружении мультимодальных микроскопии, мы были в состоянии смотреть на подробной кальция и динамики канала К _АТР в эти гипоксии событий. Мы предполагаем микрофлюидных гипоксии, особенно это одновременное технику двойного фазы, как ценный инструмент в изучении островки, а также многие бывшие естественных условиях ткани.

Introduction

Динамический гипоксия играет важную роль в биологии, специально для трансплантации островковых клеток

Динамический гипоксия является важным физиологическим а также патофизиологические параметр во многих биологических тканей. Изменение кислорода, например, является мощным сигналом развития ангиогенеза. Кроме того, пространственные и временные закономерности в гипоксии модулировать HIF1-альфа и играть роли в таких болезней, как рак поджелудочной железы. Гипоксия также смешанным фактором, влияющим на островковых результаты пересадки. В последнее время во времени колебания гипоксии или прерывистой гипоксии (IH) продемонстрировали преимущества в ....

Protocol

1. Подготовка мыши Islets

1. Проанализируйте мышей C57BL / 6 и изолировать островки на коллагеназой и Ficoll плотности разделения градиента. (См. статьи Юпитера ссылки в ^2,3).
2. Инкубировать островков в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 20 мМ HEPES в чашках Петри (37 ° C, 5% CO _2). После изоляции, культура островков в течение 24 часов до использования в экспериментах. Используйте островки в течение 1-2 дней, чтобы обеспечить устойчивые результаты.

2. Создание Микрофлюидных Платформа

1. Генерирование микроструктуры геометрии на прозрачность фотошаблонов....

Results

Центральное место в этой технике островок гипоксии является способность модулировать водной и газовой фазы стимуляции в той же камере с микрофлюидный минут масштабных переходных процессов. Рисунок 1 является представителем результат а) двойной стимуляции и б) быстро модуляции, измеренные в островковых камеры. Водный модуляции, показано введение флуоресцеина в камеру, достигает равновесия в 3:57 минут после смешивания. Кроме того, кислород можно вышел из 5-21% с быстрыми переходными, что позволяет на вел.......

Discussion

Множественные модальности, интегрированные в эту технику островковой гипоксии, представляют собой несколько отмеченных здесь моментов для устранения неполадок. Во-первых, изолированные островки продолжают деградировать и распадаться в культуре из-за пищеварительных ферментов из ацинарных клеток. Таким образом, стандартизация экспериментов в течение 1-2 дней после выделения островков имеет решающее значение для получения стабильных результатов. Во-вторых, водный поток останавливался во время гипоксии и периодической гипок.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Spinner	Laurell	WS-400
SU8 MicroChem		SU8-2150/SU8-2100
Цифровая нагревательная пластина	PMC Dataplate	722A
Лампа УФ-отверждения	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Corona Wand	ETP	BD-20AC
Вакуумная камера	Bel-Art	420220000
Микродозаторы	The Lee Company	IKTX0322000A
5 В и 20 В постоянного тока Power	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Термометр	Omega Engineering, Inc.
Перистальтический насос	Gilson	Minipulse 2
Датчик кислорода	Ocean Optics	NeoFox
Сборник фракций	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ l
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп	Leica	DMI 4000B
50 мл Конические пробирки	Fisher Scientific
Fura-2 Флуоресцентный краситель	Молекулярные зонды, Life Technologies
Флуоресцентный краситель 123	Молекулярные зонды, Life Technologies
Питательные среды	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Глюкоза	Sigma-Aldrich
Бычья сыворотка альбумин	Sigma-Aldrich
30 в силиконовых трубках	Cole-Parmer		1/16 in x 1/8 in
1,5 мл Eppendorf Tubes	Fisher Scientific
Y-образные соединители	Cole-Parmer		Шприцевые соединители 1/16 дюйма и 4 мм
	Cole-Parmer		с внутренней резьбой Luer Plug 1/16 in
Прямые разъемы	Cole-Parmer		1/16 in
Угловой соединитель	Cole-Parmer		1/16 in