Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток

Summary

В этой статье мы представляем микрофлюидных чип для анализа одного клеток. Это позволяет количественное внутриклеточных белков, ферментов, кофакторов и вторичных мессенджеров посредством люминесцентных анализов или иммунологических.

Abstract

Мы представляем микрофлюидных устройство, которое позволяет количественное определение внутриклеточных биомолекул в нескольких отдельных клеток параллельно. С этой целью клетки пассивно ловушке в середине микрокамеры. После активации уровнем управления, клетка изолирован от окружающей объема в небольшой камере. Окружающий объем может быть обменен, не влияя на изолированную клетку. Однако, после короткого открытия и закрытия камеры, решение в камере могут быть заменены в течение нескольких сотен миллисекунд. Благодаря обратимости палат, клетки могут быть подвержены различные решения последовательно в весьма контролируемым образом, например, для инкубации, стирки, и наконец, лизиса клеток. В плотно закрытых микрокамеры позволить удержание лизата, минимизировать и контролировать разбавление после лизиса клеток. С лизис и анализ происходят в том же месте, высокая чувствительность сохраняется, потому что не далее дilution или потеря анализируемых происходит во время транспортировки. Дизайн микрокамера поэтому позволяет надежную и воспроизводимую анализ очень небольшом количестве копий внутриклеточных молекул (attomoles, zeptomoles), освобожденных из отдельных клеток. Кроме того, многие микрокамеры могут быть организованы в формате массива, позволяя анализ многих клетках сразу, учитывая, что подходящие оптические приборы используются для мониторинга. Мы уже использовали платформу для доказательства правильности концепции исследований для анализа внутриклеточных белков, ферментов, кофакторов и вторичных посредников в либо относительной или абсолютной количественной форме.

Introduction

Многие исследования в прошлом показали клетки к клетке различия в большой популяции клеток ^1-3, в частности сигнализации обрабатывает ⁴ или суммы внутриклеточных биомолекул, таких как белки ^5,6, метаболиты, и кофакторов ^7,8. Эти неоднородности считаются принципиально важно для адаптации клеток и эволюции ^9, но также играют ключевую роль в появлении и лечения заболеваний, таких как рак ^10-13. Таким образом, исследования на уровне одноклеточного имеют большой интерес в биологической и фармакологических исследований, особенно если эти исследования показывают различные клеточные реакции после лечения биоло....

Protocol

1. СУ-8 Мастер Изготовление

Подготовьте обе мастер форм для каналов (жидкостных и контроля, для схемы и размеры см. рисунок 2) со следующими протокола, но с разными шаблонов масок. Процесс показан на фиг.3а.

1. Начать нагреванием 4 дюйма кремниевой пластины в течение 10 мин при 180 ° С Загрузите обезвоженную пластины на спин-машины для нанесения покрытий и использовать следующий протокол для спин-покрытия СУ-8 2015:
   1. Спин пластины при 100 оборотах в минуту в течение 20 сек (открытой крышкой спин-машины для нанесения покрытий, обойтись SU-8 во время этого шага, закрывают крышкой после выдачи).....

Results

Наша платформа способна анализировать различные внутриклеточные а также секретируемые молекулы, присутствующие в или произведенный одиночных клеток. Здесь мы хотели бы представить различные примеры исследований, чтобы подчеркнуть разнообразие возможных анализов. Приведем пример для секретируемого фермента (фиг.5А), а также внутриклеточного фермента (фиг.5В) и белка (фиг. 5c и г). Дополнительные примеры, такие, как кофакторов или малых молекул, пожалуйст.......

Discussion

Microfluidics технология открыла новые и увлекательные возможности для анализа одноклеточных. В частности, возможность ловушку и обездвижить отдельные участки при микрофлюидных инструментов позволило систематические короткие и долгосрочные исследования о свойствах и ответ одноклеточных. Кроме того, инкапсуляции клеток в высокочастотных микрокапель, генерируемых на микрочипе, позволило единичных исследований секреции клетки, которые не могут быть выполнены с помощью обычных устройств цитометрии. Подход микрокапелькой, од.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<СИЛЬНО>РЕАГЕНТЫ:
Название реагента	Номер компании	каталогу	Комментарии (необязательно)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Нетвон, Массачусетс)	n.a.1H,1H,2H,2H-перфтордецил-диметилхлор-силан
	ABCR (Карлсруэ, Германия)	AB103608
4-метилумбеллиферил &бета;-D-N,N′-диацетилхитобиогидрат	Sigma Aldrich	M9763
Ацетон Merck	VWR (Дармштадт, Германия)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Висбаден, Германия)	n.a.AZ
726 разработчик	AZ Electronic Materials (Висбаден, Германия)	n.a.
Бычий сывороточный альбумин	Sigma Aldrich	A-4503
Бычий сывороточный альбумин, биотин	Sigma Aldrich	A-8549
Буфер для диссоциации клеток	Invitrogen	13151-014
Гексаметилдисилазан (HDMS) Sigma	Aldrich	40215
Соляная кислота	Fluka	84422
Изопропанол	Merck VWR (Дармштадт, Германия)	109634
Магния хлорид гексагидрат	Fluka	63068
MR проявитель 600	Microresist technology GmbH (Берлин, Германия)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG привитый	SuSoS, (Dü bendorf, Швейцария)	n.a.PLL-g-PEG
привитый биотин	SuSoS, (Dü Бендорф, Швейцария)	н.а.Калия
	хлорид Fluka	60132
Белок G, биотин	Sigma Fine Chemicals	41624
Силиконовая пластина	Si-Mat (Kaufering, Германия)	n.a.Sylgard
184 Силиконовый эластомер Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(гидроксиметил)-аминометан	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Material Название	Номер компании	Каталожный номер	Комментарии (опционально)
0.22 µ m Фильтр для шприца PES	TRP	99722
1/1,5 мм перфоратор для биопсии	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 & микро; m	Partec	04-004-2325
Центрифуга Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Hotplate
HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Швейцария	н.а.MA-6
выравниватель маски	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M	микроскоп Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Эссекс, Великобритания	n.a
Плазменный очиститель PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
Coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Spin
Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Швейцария	n.a.Step
профилировщик Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Шприцевой
насос neMESYS	Cetoni	n.a.