Методическая статья

Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток

DOI:

10.3791/50618

⸱

15 октября 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем микрофлюидных чип для анализа одного клеток. Это позволяет количественное внутриклеточных белков, ферментов, кофакторов и вторичных мессенджеров посредством люминесцентных анализов или иммунологических.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем микрофлюидных устройство, которое позволяет количественное определение внутриклеточных биомолекул в нескольких отдельных клеток параллельно. С этой целью клетки пассивно ловушке в середине микрокамеры. После активации уровнем управления, клетка изолирован от окружающей объема в небольшой камере. Окружающий объем может быть обменен, не влияя на изолированную клетку. Однако, после короткого открытия и закрытия камеры, решение в камере могут быть заменены в течение нескольких сотен миллисекунд. Благодаря обратимости палат, клетки могут быть подвержены различные решения последовательно в весьма контролируемым образом, например, для инкубации, стирки, и наконец, лизиса клеток. В плотно закрытых микрокамеры позволить удержание лизата, минимизировать и контролировать разбавление после лизиса клеток. С лизис и анализ происходят в том же месте, высокая чувствительность сохраняется, потому что не далее дilution или потеря анализируемых происходит во время транспортировки. Дизайн микрокамера поэтому позволяет надежную и воспроизводимую анализ очень небольшом количестве копий внутриклеточных молекул (attomoles, zeptomoles), освобожденных из отдельных клеток. Кроме того, многие микрокамеры могут быть организованы в формате массива, позволяя анализ многих клетках сразу, учитывая, что подходящие оптические приборы используются для мониторинга. Мы уже использовали платформу для доказательства правильности концепции исследований для анализа внутриклеточных белков, ферментов, кофакторов и вторичных посредников в либо относительной или абсолютной количественной форме.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие исследования в прошлом показали клетки к клетке различия в большой популяции клеток 1-3, в частности сигнализации обрабатывает 4 или суммы внутриклеточных биомолекул, таких как белки 5,6, метаболиты, и кофакторов 7,8. Эти неоднородности считаются принципиально важно для адаптации клеток и эволюции 9, но также играют ключевую роль в появлении и лечения заболеваний, таких как рак 10-13. Таким образом, исследования на уровне одноклеточного имеют большой интерес в биологической и фармакологических исследований, особенно если эти исследования показывают различные клеточные реакции после лечения биологически активных химических веществ.

В последние годы многие аналитические платформы были разработаны облегчить анализ отдельных живых клеток или химический состав содержимого ячейки. В то время как люминесцентные сортировка клеток (FACS) является золотым улAndard для очень высокой пропускной анализа отдельных живых клеток, способ может не использоваться для количественного определения внутриклеточных или секретируемых соединений. Появление микрофлюидных платформ пообещал новые аналитические стратегии позиционирования, лечения и наблюдения отдельных клеток. Вехой в микрофлюидики была достигнута с интеграцией гибких PDMS клапанов, реализуемых Quake с сотрудниками 14,15. Эти клапаны полезны, так как они могут изолировать регионы на чипе, например разделения двух культур 16. Кроме того, они особенно применимо для анализа одного клеток и, следовательно, способствовать снижению аналита проблемы разрежения. Мощность этого подхода для анализа одноклеточных был недавно продемонстрировано Хансен и его коллеги, которые проанализировали экспрессию генов из сотен отдельных клеток в параллельном 17.

При ориентации белков и метаболитов, анализ очень сложно в связи с отсутствием подходящих аМетоды mplification, большое количество различных соединений, присутствующих и их вариаций в химической природы. Кроме того, большинство внутриклеточных биомолекул как ожидается, будет присутствовать в небольших количествах копирования в порядка нескольких десятков тысяч 18, следовательно, аналитический метод используется должны иметь высокую чувствительность. Более мощные анализы, такие как иммунологических и энзим-связанного иммунологических (ELISA) трудно интегрироваться в микрожидкостных устройств, так как они требуют несколько стирки и инкубационных этапа, а также поверхности иммобилизации.

Из-за этих проблем, это не удивительно, что только несколько примеров сообщалось где белки или метаболиты были количественно на уровне одной клетки. Например, исследования по секреции люминесцентных соединений были зарегистрированы 19,20. В последнее время реализация с ELISA был представлен для анализа секретируемых (нефлуоресцирующих) белков из культуры клеток (клеток ТНР-1) 21 и один (яmmune) клетки 10. Ориентация внутриклеточные белки, Ши и соавт. Разработали микрожидкостных устройств, что облегчает идентификацию внутриклеточных белков для анализа сигнальных путей в опухолевых клетках с помощью иммуноанализа 11. Однако только относительные количества белков были определены и амплификация не был использован, чтобы увеличить сигнал для низкое содержание белков.

В последнее время мы смогли объединить одноклеточного улавливания микроустройство с флуоресценции анализов 8 и иммунологических 22 (рис. 1). Клетки пассивно в ловушке microsized барьерами структур, которые позволяют питания и (быстрый) обмен среды и другие химические реагенты без движения клеток. Кольцеобразный клапан вокруг каждой ловушки позволяет изолировать клетки в очень малом объеме ("микрокамеры"). Этот клапан приводится в действие сразу же после введения клеток лизис (hypoosmolar) буфер, онсть предотвращения внутриклеточные молекулы или секретируемые молекулы диффундируют прочь. Самое главное, из-за небольшого размера тома (625 PL) большой разбавление молекул не происходит. Кроме того, поскольку лизис и анализ выполняется в то же самое положение в чипе, нет никакой потери аналитов из-за транспортировки. Дизайн чипа описано здесь состоит из 8 чередующихся рядов либо 7 или 8 микрокамеры, на общую сумму 60 микрокамеры. Камеры приводятся в строках, так что перекрестное загрязнение вдоль линии, исключается.

Платформа может быть использован в сочетании с флуоресцентные анализы, а также иммунологических анализах (рис. 1d). В последнем случае мы разработали протоколы для иммобилизации антител, которые совместимы с производством чипа и процесса сборки. Поэтому платформа открывает путь для чувствительных, надежных и поддающихся количественному анализов на одном уровне клетки. До сих пор мы использовали устройство для анализа Intracellular и выделяемые ферменты (относительно количественного ферментативными анализов), внутриклеточные кофакторов, белки и малые молекулы (абсолютного количественного по конечной точки анализов или ELISA). В дальнейшем, мы опишем процесс изготовления чипов с помощью многослойной мягкой литографии и протоколов для паттерна антител с помощью микроконтактной печати и химии поверхности. Кроме того, некоторые примеры использования чипа и операций даны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. СУ-8 Мастер Изготовление

Подготовьте обе мастер форм для каналов (жидкостных и контроля, для схемы и размеры см. рисунок 2) со следующими протокола, но с разными шаблонов масок. Процесс показан на фиг.3а.

  1. Начать нагреванием 4 дюйма кремниевой пластины в течение 10 мин при 180 ° С Загрузите обезвоженную пластины на спин-машины для нанесения покрытий и использовать следующий протокол для спин-покрытия СУ-8 2015:
    1. Спин пластины при 100 оборотах в минуту в течение 20 сек (открытой крышкой спин-машины для нанесения покрытий, обойтись SU-8 во время этого шага, закрывают крышкой после выдачи).
    2. Спин пластины при 500 оборотах в минуту в течение 10 сек (это будет распространяться противостоять по всей пластине).
    3. Спин пластины при 1750 оборотах в минуту в течение 30 сек (определяет высоту резиста до 20 мкм).
  2. Удалить сопротивление от края пластины с ацетоном (использовать тампон), как это будет в противном случае прилипают к плите на следующей стадии. Передача пластины ахotplate при 95 ° С и тепла в течение 4 мин. После softbake, подвергать сопротивляться через фотошаблон, приклеенный к Sodalime стекло в маске выравнивателя с ультрафиолетовым светом (150 мДж / см 2, измеренной при 365 нм).
  3. После экспозиции, нагревать пластину снова при 95 ° С в течение 5 мин на электрической плитке. Охладите пластины до комнатной температуры, а затем погрузите его в ванну с СУ-8 разработчиком в течение 4 мин. Осторожно встряхните, чтобы удалить Неэкспонированную СУ-8. Вымойте пластину с чистой комнаты класса изопропанола и сушить азотом. Проверка под микроскопом если развитие было успешным (особенно клеток ловушки). Если ячейка ловушки полностью разработана, отражение кремниевой пластины должны быть видны. При необходимости разрабатывать пластину снова в течение нескольких минут.
  4. Выпекать пластину в печи в течение 2 часов при 180 ° С, чтобы удалить все остатки растворителя. Проверьте высоту каналов с шагом профилирования. Если высота отличается от заданной высоты, повторить этот протокол, начиная с шагом 1,1 с новой пластины иизменить спин-скорость (шаг 1.1.3). Завершение изготовление мастер-формы путем silanizing пластину с 1Н, 1Н, 2Н, 2Н-Perfluorodecyl-dimethylchloro-силана в эксикаторе в течение ночи.

2. Мастер по изготовлению для микроконтактной печати

  1. Для того чтобы подготовить мастер-формы для микроконтактной печати, обезвоживают кремниевой пластины в течение 10 мин при 180 ° С Спин-Coat 1 мл HDMS на этот пластины при 7500 оборотах в минуту в течение 30 сек (сопротивляться придерживается лучше к силанизированного поверхности). Спин-пальто 2 мл AZ1518 позитивного резиста с этим протоколом:
    1. Статический дозировки резиста на пластины.
    2. Спин пластины в течение 5 сек при 500 оборотах в минуту.
    3. Спин пластины в течение 60 сек при 4000 оборотах в минуту.
  2. После 50 сек softbake при 100 ° С на электрической плитке, подвергать противостоять воздействию УФ-света (21 мДж / см 2 при 365 нм) через фотошаблон и на маске выравнивателя. Разработка сопротивляться в ванну с AZ 726 75 сек. Промойте разработанную подложку с DI-воды и выдувного гР.Ю. азотом. Удаление остаточного растворителя при нагревании пластины при 115 ° С в течение 50 сек. Silanize пластину под вакуумом в течение ночи.

3. Изготовление Микрожидкостных Chip

Конструкция устройства двухслойной используется для этих экспериментов. Два слоя готовят отдельно и соединены друг с другом до того, как чип, наконец, соединенный на предметное стекло (рис. 3б). Этот шаг описывает получение слоев PDMS и PDMS на печать для печати микроконтактной.

  1. Подготовка 10:01 смесь PDMS и отвердителя. Подготовьте около 80 г PDMS в общей сложности (с помощью наших проектов, то это приведет к 10 фишек). Смешайте обе части энергично и дегазации PDMS, пока смесь не пузырь бесплатно (~ 30 мин).
  2. Поместите пластину с контрольной слоя внутри чашки Петри и прикрепить ее на дно. Далее, заливают ~ 50 г ПДМС сверху и поставить пластину, по крайней мере, 2 ч в сушильном шкафу при 80 ° С, чтобы обеспечить полноеотверждение PDMS. Повторите ту же процедуру для микроконтактная печати пластины, для этого ~ 20 г PDMS необходим.
  3. Спин-Coat PDMS на пластине с жидкостного слоя при скорости вращения 2000 оборотов в минуту, чтобы сформировать приблизительно 40 мкм с высоким PDMS слой. Вылечить PDMS в печи в течение по крайней мере 1 час при 80 ° С
  4. Когда обе части вылечить, удалить уровень управления от пластины и нарезать на кусочки с лезвием бритвы. Удар присоединительные отверстия давление с помощью 1 мм биопсии панчер. Для хранения, рекомендуется положить кусочек ленты по этим каналам.
  5. Для склеивания двух слоев, возьмите спин-покрытием пластин и верхнюю часть и поместить их в плазменном очистителя 23. После плазменной обработки, быстро выровнять обе части под микроскопом с большим рабочим расстоянием. Добавить некоторые запасные PDMS вокруг размещенных лучших частей. Этот шаг не является обязательным, однако это облегчает удаление из PDMS от пластины. Поместите пластину в печи при 80 ° С в течение по крайней мере 1 часа.
  6. Используйте скальпель, чтобы тщательно удалить PDMS от пластины и сократить микрочипов. Пробивки отверстий доступа для жидкостных соединений с 1,5 мм биопсии перфоратором.
  7. Чип PDMS теперь завершена и могут быть сохранены в течение нескольких месяцев. Необязательно: Если чип используется с резервуаром, вырезать верхнюю часть пипетки 200 мкл и использовать некоторые запасные, полу-вылечить PDMS приклеить ее на первое место. Поместите микросхему в печи снова при 80 ° С в течение по крайней мере 1 часа.

4. Укладка в стекло

Для использования устройства для прямых ферментативных анализов, единственный шаг требуется после склеивания является блокирование поверхностей. Для этого протокола, перейдите к А. Однако использовать микрофлюидных чип для иммунологических или ИФА, пожалуйста, обратитесь к протоколу B ограничить сайты связывания только в предметное стекло (т.е. для TIRF микроскопии или SPR). Если это ограничение не важно, обратитесь к А, но использовать биотинилированных конъюгатов в шаге 4.3 и перейдите к шагу 4.8в протоколе B, чтобы создать полнофункциональную поверхность.

Перед выполнением протокола А и В: Желательно, чтобы фильтровать все из использованных растворов белков перед введением их в чипе. Мусора и белковые агрегаты в противном случае могут блокировать клеточные ловушки, тем самым уменьшая количество камер, которые можно использовать для анализа. Для этой цели используйте небелковых блок адсорбции фильтра для фильтрации все решения до введения их в каналы.

Протокол (ферментативные анализы)

  1. Чтобы завершить микрожидкостных устройств, скрепления частей PDMS на предметное стекло. Чтобы сделать это, сначала чистить стекло с мылом, дистиллированной водой и этанолом. Высушите слайд с помощью потока азота. Очистите участие PDMS скотчем.
  2. Положите часть PDMS и очищенный предметное стекло в пылесос плазмы в течение 45 сек при 18 Вт Для обеспечения жесткой сцепление, поставить чип на горячей плите (100 ° C) в течение 5 мин.
  3. После склеивания, заполнения чип с фluids. Самый простой способ добиться этого заключается в использовании центробежной силы. Отрежьте нижнюю часть 200 мкл кончика пипетки. Для жидкостных каналов, заполнить их блокирующим раствором (бычий сывороточный альбумин (4% вес / объем) или поли-L-лизин) привитым полиэтиленгликолем (0,05% вес / объем) и поместить ее концы в бухтах. Заполните Уровень управления входы водой или с isosmotic раствора, например PBS. Поместите микросхему в центрифугу (800 мкг) в течение 5 мин. Каналы должны быть сейчас заполнены жидкостью полностью. Если нет, повторите этот шаг.
  4. Инкубируйте блокирующий раствор в течение не менее 30 мин при комнатной температуре. Промыть раствор из жидкости слоя с PBS, при скорости потока 10 мкл / мин с помощью шприца. Теперь устройство готово для сотовых экспериментов.

Протокол В (иммунологические)

Для полного обзора модификации поверхности со стадии 4,7 года, пожалуйста, обратитесь к таблице 1.

  1. Вcubate PDMS марки для микроконтактной печати с раствором BBSA / BSA (например 1-100). Через 30 мин очистки марки тщательно дистиллированной водой и высушить штамп в токе азота. Быстро поставить штампы на очищенную стекло (рис. 4).
  2. Проэкспонируйте стекло с печатью вместе с верхней части микрофлюидный чип в кислородной плазме в течение 45 с при максимальной мощности (18 Вт) в чистой плазмы. После плазменной обработки, снимите отметку и выровнять поверхность отпечатанного материала под микрокамеры устройства. Поместите микросхему в течение 30 мин на горячей плите при 50 ° С
  3. Чтобы блокировать оставшуюся поверхность, ввести стерильно отфильтрованной раствора БСА (4% (вес / объем) в PBS) в чип с центрифугой (см. шаг 4.2). Инкубировать в течение 1 часа и промывки раствор, из жидкости слоя с PBS (см. шаг 4.3). Чип можно использовать непосредственно или хранили в течение до 2 недель при 4 ° С во влажной коробки.
  4. Для полнофункциональной связывания Surfacе, ввести авидин (0,025% (вес / объем) в ФБР) в резервуар. Использование скорости потока 5 мкл / мин в течение 30 мин, чтобы вывести авидин раствора через проточные каналы. После промывки PBS в течение 10 мин. Промойте резервуар тщательно.
  5. После этого добавить белок G (0,0025% (вес / объем) в ФБР) и заподлицо течение еще 30 мин. Промыть PBS еще 10 мин после этого. Затем добавьте интерес антитело (0,0001% (вес / объем) в PBS) в течение 10 мин. Через 10 мин остановить поток в течение 15 мин, чтобы позволить связывания. Далее, промывают PBS в течение 10 мин.

5. Сотовые Эксперименты

Протокол записывается в общих чертах из-за множества возможных анализов. В качестве примера реагенты, необходимые для анализа токсичности G6PDH даны. Первоначальный клеток захвата КПД устройства составляет около 2,5%, т.е. 5 из 200 клеток будет в ловушке. Окончательное размещение сотовых ловушек сильно зависит от используемой клеточной линии, протокол о приостановленииклеточная линия и время клетки смываются через канал. Для клеток естественно произрастающих в виде суспензии (например, U937), отдельные клетки могут быть найдены в около 75% из палат после нескольких минут. Остальные камеры или не заполнены, или занимают две или более ячеек. В общем, размещение одноклеточных меньше для адгезивных клеточных линий. При использовании довольно мягкий протокол суспендирующий представленные здесь, процент снижается до примерно 30% (HEK, MLT клетки). Размещение одноклеточных может быть улучшена путем обработки трипсином клеток, но это также может изменить результаты экспериментов.

В зависимости от молекулы-мишени, адсорбции или абсорбции в PDMS может повлиять на результаты. Адсорбция может быть уменьшена путем блокирования поверхности с БСА или PLL-п-ПЭГ. Поглощение вряд ли для большинства гидрофильных биомолекул, но это должны быть проверены на (малых) липофильных компонентов клетки.

  1. Подготовка клеток в зависимости от конкретного протокола (например, наркомания). Для суспензии клеток, клетки добавить непосредственно к микросхеме. Для клеевых клеточных линий, использовать фермент без диссоциации буфера для получения клеточной суспензии. Фильтр клеток перед введением их в чипе, чтобы уменьшить количество клеточных скоплений.
  2. Загрузить клеток на чип с помощью шприцевого насоса и прямого потока, а не вывести клеточной суспензии. Использование скорости потока 5 мкл / мин в течение подвеска клеточных линий и более высокие скорости потока 10-20 мкл / мин в течение адгезивных клеток с уменьшить неспецифическую прикрепление клеток на стенках канала.
  3. Когда ловушки заполнены, закройте камеры. Если многие клетки придерживаться неспецифически к поверхности, попытайтесь смыть их диссоциации клеток с буфером при скорости потока 10-30 мкл / мин.

Протокол (ферментативные анализы)

  1. Вывод лизирующего буфера через чип. В данном примере этот буфер hypoosmolar буфер с добавлением Tween 20 (10 мМ Трис-HCl, 10мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1% (объем / объем) Твин 20). Для лизиса, быстро открывать и закрывать камеры (т.е. 500 мс для скорости потока 10-50 мкл / мин 7,21). Для анализа G6PDH, добавьте 2 мМ глюкозо-6-фосфат, 0,5 мМ НАДФ, 0,5 Е / мл диафораза и 0,3 мм резазурин в буфере для лизиса. Начните мониторинг кинетическую реакцию сразу после лизиса.

Примечание: Выберите любой буфер, который подходит для анализа, однако помните, что сильные моющие средства (например, Triton, SDS) лизируют клетки немедленно и приведет к потере анализируемого вещества во время открытия камеры.

Протокол В (иммунологические)

Для краткого описания экспериментов ELISA клеток (скоростей потока, состояние камеры и т.д.), пожалуйста, обратитесь к таблице 1.

  1. Для ELISA необходимо добавить нужную детектирующий реагент (например, вторичное антитело, меченого антигена) непосредственно в буфере для лизиса. Здесь добавил Tweeн 20 снижает неспецифической адсорбции. Лизиса клеток в соответствии со стадией 5,4. Выдержите смесь в течение 10-15 минут, чтобы позволить связывания (время инкубации в зависимости от используемого антигена и антитела).
  2. Антитела ферментные конъюгаты, что адсорбированные неспецифически в стенках канала может привести к конверсии реагента обнаружения уже внутри резервуара и каналов. Чтобы уменьшить проблемы с этим адсорбции, промойте постоянного ингибитор используемого фермента обнаружения через чип в течение времени инкубации (камеры закрыт, перед добавлением реагента обнаружения). Для HRP, используя 20 мМ HCl в воде, чтобы постоянно инактивации ферментов, адсорбированных неспецифически.
  3. После инкубационного периода, ввести детектирующий реагент (например Amplex Red и перекись водорода для HRP) на чипе. Откройте камер в ближайшее время еще раз, чтобы вымыть nonbound вторичного антитела в сторону и добавить реагент обнаружения. Начните сразу мониторинга кинетическую реакцию.
  4. Калибровка: Остановитеантитело против цели, представляющей интерес. Закрыть камеры. Подготовка различные концентрации анализируемого вещества в буфере или в клеточном лизате вне кристалла. Применить концентрацию на чип и быстро обмениваться объем внутри камеры (500 мс время размыкания). На этот раз открытие является достаточно коротким для того, чтобы никакие дополнительные накопления не происходит от анализируемого промывки, и только определенное число молекул из объема микрокамере обнаружены. Из известной концентрацией антигена внутри раствора и объема камеры (625 мкл), вычислить количество внутри камеры. После этого, перейдите к шагу 5.5 и введем группировку обнаружения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наша платформа способна анализировать различные внутриклеточные а также секретируемые молекулы, присутствующие в или произведенный одиночных клеток. Здесь мы хотели бы представить различные примеры исследований, чтобы подчеркнуть разнообразие возможных анализов. Приведем пример для секретируемого фермента (фиг.5А), а также внутриклеточного фермента (фиг.5В) и белка (фиг. 5c и г). Дополнительные примеры, такие, как кофакторов или малых молекул, пожалуйст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microfluidics технология открыла новые и увлекательные возможности для анализа одноклеточных. В частности, возможность ловушку и обездвижить отдельные участки при микрофлюидных инструментов позволило систематические короткие и долгосрочные исследования о свойствах и ответ одноклеточных. Кроме того, инкапсуляции клеток в высокочастотных микрокапель, генерируемых на микрочипе, позволило единичных исследований секреции клетки, которые не могут быть выполнены с помощью обычных устройств цитометрии. Подход микрокапелькой, од...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Тома Робинсона для корректуры рукописи, К. BÄRTSCHI и Х. Benz для строительства заказного системой контроля давления. Мы также хотели бы отметить использование чистое средство номер первый и световой микроскопии центра (LMC), как на ETH Zurich. Работа финансировалась Merck Serono и Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках 7-й Рамочной программы (ERC Starting Grant, проект №. 203428, nμLIPIDs).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<СИЛЬНО>РЕАГЕНТЫ:
Название реагентаНомер компаниикаталогуКомментарии (необязательно)
SU-8 2015MicroChem Corp. (Нетвон, Массачусетс)n.a.1H,1H,2H,2H-перфтордецил-диметилхлор-силан
ABCR (Карлсруэ, Германия)AB103608
4-метилумбеллиферил &бета;-D-N,N′-диацетилхитобиогидратSigma AldrichM9763
Ацетон MerckVWR (Дармштадт, Германия)100014
AvidinAppliChem (Axon Lab AG)A-2568
AZ 1518AZ Electronic Materials (Висбаден, Германия)n.a.AZ
726 разработчикAZ Electronic Materials (Висбаден, Германия)n.a.
Бычий сывороточный альбуминSigma AldrichA-4503
Бычий сывороточный альбумин, биотинSigma AldrichA-8549
Буфер для диссоциации клетокInvitrogen13151-014
Гексаметилдисилазан (HDMS) SigmaAldrich40215
Соляная кислотаFluka84422
ИзопропанолMerck VWR (Дармштадт, Германия)109634
Магния хлорид гексагидратFluka63068
MR проявитель 600Microresist technology GmbH (Берлин, Германия)n.a.PBS
Invitrogen10010-031
PLL-g-PEG привитыйSuSoS, (Dü bendorf, Швейцария)n.a.PLL-g-PEG
привитый биотинSuSoS, (Dü Бендорф, Швейцария)н.а.Калия
хлорид Fluka60132
Белок G, биотинSigma Fine Chemicals41624
Силиконовая пластинаSi-Mat (Kaufering, Германия)n.a.Sylgard
184 Силиконовый эластомер Kit (PDMS)Dow Corning39100000
Tris(гидроксиметил)-аминометанBiorad
Tween 20Biorad1706531
EQUIPMENT:
Material НазваниеНомер компанииКаталожный номерКомментарии (опционально)
0.22 µ m Фильтр для шприца PESTRP99722
1/1,5 мм перфоратор для биопсииMiltex, York PA33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 & микро; mPartec04-004-2325
Центрифуга Sigma 3-18KKuehnern.a.Hotplate
HP 160 III BMSawatec, Sax, Швейцариян.а.MA-6
выравниватель маскиKarl Suessn.a.Multizoom
AZ100Mмикроскоп Nikon Corporationn.a.Photomask
Microlitho, Эссекс, Великобританияn.a
Плазменный очиститель PDC-32GHarrickn.a.Spin
Coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITELaurelln.a.Spin
Modules SM 180 BMSawatec, Sax, Швейцарияn.a.Step
профилировщик Dektak XT AdvancedBrukern.a.Шприцевой
насос neMESYSCetonin.a.
по 1610716

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Microfluidic ChipSingle Cell AnalysisCell LysisFluorescence MicroscopyImmunoassay DetectionFluidic ControlPDMS FabricationChamber TrappingSolution ExchangeBiomolecule Quantification

Похожие статьи