Методическая статья

Компьютерный многоэлектродной патч-зажим система

DOI:

10.3791/50630

⸱

18 октября 2013 г.

 , 
1Laboratory of Neural Microcircuitry - Brain Mind Institute, Ecole Polytechnique Federale de Lausanne

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многоэлектродной патч-зажим записи представляют собой сложную задачу. Здесь мы показываем, как, за счет автоматизации многих экспериментальных шагов, можно ускорить процесс, ведущий к качественному улучшению производительности и числа записей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Техника патч-зажим является сегодня наиболее устоявшихся способ записи электрической активности от отдельных нейронов или их субклеточных отсеков. Тем не менее, достижение стабильно записи, даже от отдельных клеток, остается много времени процедура значительной сложностью. Автоматизация многих шагов в сочетании с эффективной отображения информации могут оказать большую помощь экспериментаторов в выполнении большего количества записей с большей надежностью и за меньшее время. Для достижения масштабных записи мы пришли к выводу наиболее эффективным подходом не полностью автоматизировать процесс, но для упрощения экспериментальные шаги и уменьшить шансы человеческой ошибки во время эффективно включения опыт экспериментатора и визуальную обратную связь. С учетом этих целей мы разработали с помощью компьютера системы, которая централизует все элементы управления, необходимые для многоэлектродной патч-зажим эксперимента в в одном интерфейсе, в Commercially доступные беспроводные геймпад, при выводе эксперимента, связанных с информационно-сигналы наведения на экране компьютера. Здесь мы опишем различные компоненты системы, которая позволила нам сократить время, необходимое для достижения конфигурацию записи и существенно увеличить шансы на успешное записи большого числа нейронов одновременно.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Емкость для записи и стимулировать несколько сайтов с точностью микрометра является чрезвычайно полезным для экспериментально достижения лучшего понимания нейронных систем. Многие методы были разработаны с этой целью, но ни один не позволяют разрешение submillivolt достигается с помощью техники патч-зажим, существенной для изучения подпороговых активность и индивидуальные постсинаптические потенциалы. Здесь мы рассмотрим развитие двенадцати электрода с помощью компьютера патч-зажим системы, направленной на одновременной записи и стимулирования большое количество отдельных клеток с достаточной точностью для изучения нейронной связи. В то время как многие другие приложения можно представить для такой системы, она поддается особенно хорошо изучению синаптической связи, учитывая, что число возможных соединений в группе нейронов возрастает пропорционально квадрату числа нейронов в вопросе. Таким образом, в то время как система с тремя электродами позволяет тестированияВозникновение до шести соединений и чаще всего записи ни одного, записи двенадцать нейронов позволяет тестирование возникновение до 132 соединений и часто наблюдая за один десяток (рис. 1). Наблюдение десятков соединений одновременно позволяет проанализировать организацию небольших сетей и вывести статистические свойства структуры сети, которые не могут быть проверены в противном случае 1. Кроме того, точное стимулирование многочисленных клеток также позволяет оценить количественно набора постсинаптических клеток 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка оборудования

  1. Управления манипуляторы с компьютера
    1. Подключите каждый контроллер окно Микроманипулятор к компьютеру через последовательные порты (RS-232).
    2. Реализация команды для позиционирования, запросов и настройки параметров для отправки через последовательный порт. Учитывая проблемы со скоростью и совместимости оборудования C / C + + рекомендуется в качестве языка программирования.
    3. Стандартизация опорного систему манипуляторов так что нуль ближайшее положение по отношению к двигателям и позитивное движение направлено от двигателей.
    4. Установите микроскоп на ее центральном положении 2 мм выше образца фокальной плоскости (координаты [0, 0, 2000]).
    5. Магазин, для каждого манипулятора, локальные координаты, которые позволяют кончик пипетки, которые должны соблюдаться в центре поля зрения микроскопа. Это начальный точкой отсчета для каждого электрода.
  2. Видеотехникативно локализуют электродов позиции. Это очень полезно, чтобы иметь возможность отслеживать положение каждого электрода во время эксперимента. Графическое представление является наиболее интуитивный из способов достичь этого. С этой целью системы отсчета каждого электрода и, что микроскопа должны быть согласованы. Простой способ достижения этой цели является:
    1. Доведите кончик электрода в центре поля зрения.
    2. Сохранить положение на каждой оси манипулятора и каждый оси микроскопа.
    3. Выполнение с осью х манипулятора относительно большое движения (1 мм).
    4. Найдите наконечник еще раз движется только микроскоп.
    5. Рассчитайте разницу в положении микроскопа, поскольку он был в прошлом измерить. Таковы прогнозы движения оси электрода на оси микроскопа.
    6. Повторите шаги 2.3 - 2.5 для Y и Z осей электрода манипулятора. Это позволяет матрица проекций на микроскопом осей, которые будут определены (<сильный> рис. 2) также называется косинус матрица:
      figure-protocol-1
    7. Переверните эту матрицу, чтобы сделать возможным для расчета движения, в трех измерениях, необходимые для электродной манипулятора для достижения заданной позиции в микроскоп системе координат:
      figure-protocol-2
    8. Использование начальную точку отсчета и косинус матрица определить положение каждого электрода в микроскоп координат.
    9. Дисплей графически, на основе микроскопа координирует, положение каждого электрода через регулярные промежутки времени. Мы решили использовать C / C + + рисунок библиотеки (GDI +), чтобы привлечь расположения электродов каждые 40 мс.
    10. Повторите этапы 1.2.1 - 1.2.7 каждый раз углы манипулятор изменены или если положение изменения нескольких миллиметров необходимы, например, когда тип электрода изменяется.
  3. Включить хранения Positioнс соответствующих функций в ткани, такие как клетки или анатомических ориентиров, в микроскоп координаты.
  4. Приобретать видео и наложения соответствующую информацию.
    1. Механически выровнять ось х движения микроскопом с горизонтальной осью микроскопа камеры.
    2. Установите на компьютере с Платы видеозахвата с видео в реальном времени и возможности наложения и комплект разработки программного обеспечения (SDK).
    3. Реализация живой операцию отображения видео с SDK.
    4. Преобразование микроскоп системы координат к опорной камеры системы на соответствующий перевод и масштабирования.
    5. Нарисуйте соответствующие функции в координатах камеры и наложения на видео в реальном времени в результате изображение на регулярной основе около 40 мсек (рис. 3).
  5. Усилители управления.
    1. Используйте программное обеспечение усилителя контролировать настройки усилителя из интерфейса.
  6. Колорадоуправляете осциллографы.
    1. Подключите осциллографы к компьютеру с помощью последовательных портов.
    2. Определите масштаб осциллографа, сцепление и временное разрешение на различных этапах процедуры патч-зажим в фиксации потенциала (например, электрод в ванной, формирования уплотнения, конфигурации цельноклеточной) и вольт-зажима.
    3. Отправить соответствующие команды настройки осциллографа, когда команды усилитель выдаются из интерфейса.
  7. Контроль давления пипетки.
    1. Соберите систему контроля давления в соответствии с рисунком 4.
      1. Используйте 12 В / 5 В питания снабдить каждую электронный компонент соответствующим образом.
      2. Соедините выход одного мембранного насоса к положительному буфера давления (мл контейнера 100).
      3. Подключите вход одного мембранного насоса с отрицательным буфером давления (мл контейнера 100).
      4. Подключите трубку держателя пипетки с датчиком давления в давлеповторно систему управления и пневматический клапан, который подключается к основным отделением давления.
      5. Подключение каждого из буферов давления к клапану соединен с главным отсеком давления.
      6. Подключение клапан между основным отделением давления и атмосферой.
      7. Подключите датчик давления в основном отделении давления.
      8. Подключите датчик давления в каждом буфере.
      9. Подключите систему контроля давления в плате сбора данных.
      10. Подключите каждый датчик давления к одному аналоговому входу.
      11. Подключите каждый клапан на цифровой выход.
    2. Удалить смещение от всех датчиков, открыв все клапаны, кроме тех, подключения к мембранных насосов и вычитая измеренное давление атмосферное давление.
    3. Реализовать контроль давления
      1. Определить в интерфейсе управления для включения или де-активации положительный контроль давления для каждого пипетки.
      2. Определить минимальное положительное давление для пипеткис около 70 мбар.
      3. Периодически (раз в 0.5 сек) обнаружить, когда давление в пипеток под контролем активного давления падает ниже установленного порога.
      4. По пересечения порога не открыть положительный буфер давления для основного отделения давления и этот отсек к пипетки в вопросе во время кратких периодов (20 мс), пока давление в пипеток выше порога. Закройте все другие клапаны.
      5. Де активировать дополнительный контроль давления, как окончательный подход к ячейке интерес инициируется.
    4. Применить отрицательное давление для формирования уплотнения
      1. Закройте все клапаны и открыть негативное буфера давления клапан в сторону основного отделения давления и этот отсек к пипетки в вопросе в течение всего срока экспериментатор требует, сохраняя кнопку нажатой.
  8. Централизация команды на устройство интерфейса человека.
    1. Подключите имеющийся в продаже Wireleсс геймпад к компьютеру.
    2. Реализация считывание состояния джойстика. Например, использовать библиотеки DirectX для C / C + + для выполнения показания каждые 5 мс.
    3. Сравнение текущего состояния с предыдущего состояния для обнаружения, которые были нажата, отпущена или нажата кнопки с момента последнего временного шага.
    4. Связать функции каждой кнопке в геймпада. Примером этого отображения показан на рисунке 5.

2. Процедура патч-зажим

  1. Подготовить ломтики мозговые области, представляющей интерес.
  2. Поставьте мозга кусочек интерес, с интересующей нас области в центре диапазона перемещения микроскопа.
  3. Выбор сотового
    1. Идентификации клеток, представляющих интерес при просмотре под микроскопом. Храните положение клеток на основе микроскопа системе координат с правой кнопкой мыши щелкните на видеоизображение дисплее в верхней части ячейки интерес.
      2. Графический интерфейс будет отображать выбранные ячейки, а также микропипетки для глобального обзора и программного обеспечения добавит маркер на позицию клеток, которые будут наложены на изображения. Кроме того образ ячейки захватывается для дальнейшего использования в файле 'Сотовый #. JPG'.
  • Отнесение клеток пипеток
    1. После выбора клетки интерес, назначить которые пипетки будет записывать каждую ячейку. Графический интерфейс обеспечивает управление назначения, которые должны быть установлены. Визуализация предварительный просмотр окончательной конфигурации, установив флажок "Показывать окончательные позиции.
    2. Выберите каждый пипетки, для которых конечное положение предварительного просмотра желаемого или проверить 'Select All' флажок. Отключение отображения текущего положения для лучшей визуализации в случае необходимости.
  • Подготовьте Пипетки
    1. Заполните пипетки (6 - 8 МОм, как правило, лучше всего, если используются многие пипетки) шй внутриклеточный решение и загружать их в их владельцам. Поместите головкам в своих записях, но не скользить их вперед, не прикасаясь к ванной с кончика пипетки.
    2. Включить контроль положительным давлением и выбрать все пипетки для того, чтобы советы останется чистой. Аккуратно вставьте каждый headstage на месте.
  • Расположение кнопок наконечники
    1. Расположите микроскоп в центральное положение с упором 3 мм выше среза, нажав кнопку R2, удерживая кнопку «А». Используйте соответствующую позицию для каждого манипулятора как хранится от предыдущего эксперимента, нажав кнопку L2, удерживая кнопку A.
      Примечание: На данный момент не должно быть либо отличительной тень пипетки с учетом или небольшой движение по оси пипетки должны быть достаточно, чтобы наблюдать его в большинстве случаев. Компенсация за небольшими различиями в форме пипетки должна быть выполнена вручную.
    2. Принесите пипетки в фокус. Поместите кончик на красной центральной точкой в ​​видео-дисплей без перемещения микроскопа (это все равно должны быть в позиции [0, 0, 2000]).
    3. Сообщить программное обеспечение, которое пипетка находится в центре дисплея, нажав кнопку Z, удерживая кнопку С. После каждой пипетки находится, отправить этот пипетку назад так, что следующий за ним могут быть расположены, нажав кнопку L1, удерживая кнопку A.
  • Подойдя клетки
    1. После того как все наконечники были точно расположена и каждый пипетки отнести к клетке, автоматически расположить пипетки, близких к их соответствующих клеток. Просто щелкните правой кнопкой мыши в центре группы клеток и выбрать опцию 'Cluster "на всплывающем меню. На окне настроек кластера, который появится, выберите все пипетки, которые вы хотите поместить в это время и нажмите на 'Go со всеми проверенных пипеток. Повторите эту операцию для каждого кластера клеток, представляющих интерес.
    2. Пеrform окончательный подход вручную. Положение пипеток по отношению к клеткам может быть указано по-другому, но обычно это просто от ячейки по оси пипетки и 200 мкм над ним в вертикальном направлении, которое достаточно, чтобы кончик пипетки за пределами ткани 200 мкм . Подождите, пока позиционирование пипеток не закончено и переместите микроскопа к пипетки, нажав удерживая кнопку C. кнопку R1
    3. Перекалибруйте каждую позицию пипетки, сосредоточив внимание микроскоп на его кончике нигде в видео-дисплей и нажав кнопку В удерживая C. Кнопка квадратной сетки должны ненадолго появится указанием выявленных положение пипетки. Если положение не является правильным, позиционировать кончик на центральной точкой видеодисплея и нажмите кнопку Z, удерживая кнопку C.
  • Установите конфигурацию клеток подключением
    1. Подтвердите, что клетка представляет интерес для текущего пипетки правильноотмечен. В противном случае перемещения микроскопа, чтобы соответствовать ячейку интересов с центральной красной точкой. Марк клетка, нажав кнопку Y, удерживая кнопку C. Нажмите кнопку L2, удерживая кнопку С, чтобы поместить пипетку 200 мкм от ее установленного клетки, микроскоп автоматически переместится в соответствующее положение.
    2. Отрегулируйте положение пипетки таким образом, это совпадает с красной меткой. Отрегулируйте пипетки смещение, нажав удерживая кнопку X. кнопку R1
    3. Активируйте тестовую пульс нажатием кнопки L1, удерживая кнопку X. Медленно подойти пипетку его отнести клетки.
    4. При наблюдении образование углубления на поверхности клеточной мембраны применять краткое импульс отрицательного давления при нажатии на кнопку Y, удерживая кнопку Z, чтобы приложенное давление, чтобы достичь клетку. Должны создан холдинг потенциал о-65mV на данный момент, нажав на кнопку L2, удерживая кнопку X.
  • Конфигурация Цельноклеточная
    1. После того, как печать Giga-формируется для каждой ячейки, начать разрыва мембраны, применяя отрицательное давление.
  • Выполните записи
    1. Используйте систему стимуляции / приобретения выполнять свои записи. Применение импульсов или серии импульсов на один отдельной клетки одновременно наблюдать и ответов на остальных клеток к карте соединения из записанных клеток.
  • Отступите пипетки
    1. После записи завершена, отступать пипетки медленно из ткани щелкнув правой кнопкой мыши на радио-кнопки Таблица. Выберите 'Отступите-> Пипетки 500 мкм' иметь пипетки отступать нескольких минутах ходьбы вдоль их осей. Соблюдайте дрейф в потенциале клеток (очистка советы, применяя некоторые положительное давление может помочь).
    2. Отступать пипетки весь путь обратно, установить скорость позиционирования в "Быстрый" и повторить ту же операцию, но выберите опцию «Все». Удалить используетсяпипетки, осторожно перемещая вне головкам и открутив пипетки из держателей. Это полезно, чтобы избежать скручивания держателей в глазницах, так как это может существенно повлиять на положение кончика пипетки.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    После описанных выше методов нам удалось выполнения записи цельноклеточной до двенадцати нейронов одновременно, почти в два раза наибольшее количество нейронов одновременно патч-зажат до сих пор. Примеры сетей прямых синаптических связей между пирамидальных нейронов, записанной в Layer V в соматосенсорной коре крыс показаны на рисунке 6.

    Определение вероятности соединение профилей в зависимости от меж-соматической расстояния для данного типа клеток представляет собой типичны...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Сразу возникает вопрос, как правило, возникает в отношении показатель успеха процедуры мы описали. За высокие показатели успеха подготовка имеет важное значение. Пипетки должны быть наконечник отверстия, которые адекватны для клеток существ записанных. Фильтрация внутриклеточный решение, чтобы избежать забиты пипетки, также важно. Очень чистые, недавно вытащил пипетки еще одно требование. Биномиальное распределение является простой моделью, которую можно использовать, чтобы понять, как эти проблемы влияют на конечный вы...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы хотели бы поблагодарить Гилада Silberberg, Микеле Пигнателли, Томас К. Бергер, Luca Gambazzi и Sonia Garcia за ценные советы по улучшению для автоматизации процедуры патч-зажим. Мы благодарим Rajnish Ranjan за ценные советы и помощь в реализации программного обеспечения. Эта работа была частично финансируется проекта Synapse ЕС и частично Научная программа по правам границ.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    МикроскопOlympusBX51WI40X Иммерсионный объектив
    МанипуляторыLuigs NeumannSM-5Используемый последовательный протокол
    УсилителиAxon InstrumentsMultiClamp 700BSDK Используемые
    камерыФотоникаVS 55BNC Аналоговый выход
    ФреймграбберТрансляция данныхDT3120SDK б/
    ОсциллографыTektronixTDS 2014Последовательная связь
    Сбор данныхInstruTECHITC 1600
    Сбор данныхNationalInstruments PCI-6221Используемая библиотека (.dll)
    Клапан давленияSMCSMC070C-6BG-32
    Датчик давленияHoneywell24PCDFA6G
    Мембрана насосЩегоОптимальный
    у

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
    2. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473(2010).
    3. Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
    4. Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
    5. Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
    6. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
    7. Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
    8. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
    9. Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
    10. Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
    11. Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
    12. Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).
    13. Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Похожие статьи