Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток

Summary

Два дополнительных методы, основанные на цитометрии потока и микроскопии представлены которые позволяют количественно, в уровне одной клетки, динамики экспрессии генов, вызванных активацией MAPK пути в дрожжах.

Abstract

Количественная оценка экспрессии генов на уровне одной клетки раскрывает новые регуляторные механизмы уведут в измерениях, выполненных на уровне населения. Два методы, основанные на микроскопии и проточной цитометрии представлены продемонстрировать, как такие данные могут быть приобретены. Выражение флуоресцентного репортера, индуцированной при активации высокой осмолярности глицерин пути МАРК в дрожжах используется в качестве примера. Особые преимущества каждого метода выделены. Проточная цитометрия измеряет большое количество клеток (10000) и обеспечивает прямое измерение динамики белка экспрессии независимо от медленных созревания кинетики флуоресцентного белка. Изображений живых клеток с помощью микроскопа является напротив ограничено измерением зрелой форме репортера в меньшем количестве клеток. Тем не менее, наборы данных, генерируемые этой техники может быть чрезвычайно богатые благодаря комбинации нескольких репортеров и в пространственном и временном информацииполучены из отдельных клеток. Сочетание этих двух методов измерений может доставить новый взгляд на регуляцию экспрессии белка на сигнальных путей.

Introduction

Сигнализация с помощью трансдукции каскадов часто достигает кульминации в экспрессии белков. Характеристика этого профиля экспрессии является ключевым элементом в понимании функции биологических путей. Идентификация спектра до регулируемых белков и динамики их активации может быть достигнуто различными способами, такими как микро-массивов, северных пятнами или западных помарки ^1-3. Однако, эти методы в среднем отклик всей популяции клеток. Чтобы понять тонкую регуляцию экспрессии белков, желательно, чтобы собрать измерения на уровне одной клетки. В идеале, эти измерения должны также обеспечить количественные данные поддаются развивать математические модели базового пути.

Микроскопия и проточной цитометрии две методики, которые идеально подходят для доставки таких количественных измерений одной ячейки. Эндогенный мечение белков с флуоресцентным белком может бе используется для количественной оценки их уровня экспрессии ^4. Однако, так как добавление большого флуоресцентного фрагмента в конце белка может сделать его нефункциональным, часто более желательны, чтобы генерировать определенные репортеров экспрессии на основе промотора движущей экспрессию флуоресцентного конструкции. Этот репортер белок экзогенными для сотовой системы и, следовательно, не влияет на сигнальные события, которые происходят в клетке.

Оба микроскопии и проточной цитометрии были широко использованы в поле сигнализации дрожжей. В качестве примеров; Колман-Лернер и его коллеги коррелирует, в одиночных камерах, выражение спаривания конкретные и конструктивно, высказанные журналистам с помощью микроскопии для количественной оценки шума в дрожжи спаривания передачи сигнала каскада ^5, Акар и его коллеги использовали проточной цитометрии для изучения нормативно-сеть контролирующий экспрессию генов GAL ^6. В предыдущем исследовании ^7, мы использовали combinatiна этих двух методов для изучения выход экспрессии с высокой осмолярности глицерина (HOG) тропа в почкующихся дрожжей. Это митоген активированной протеинкиназы (МАРК) пути инициируется гипер-осмотического стресса. Это приводит к активации MAPK Hog1, который перемещает в ядро ​​клетки, чтобы вызвать программу транскрипции, что приводит к экспрессии примерно 300 генов. Для изучения этого процесса, мы инженерии выражения репортера на основе STL1 промоутер (гена индуцируется в частности, в ответ на Hog1 деятельности ⁸⁾ движущей выражение четырехместном Венеры флуоресцентного белка (р STL1-см.). Проточной цитометрии измерения обнаружили наличие двух популяций клеток на среднем уровне напряжения (0,1 М NaCl) и только часть населения, выражающей флуоресцентного репортера. Мы использовали микроскопию для дальнейшего расследования это поведение и обнаружил, что этот шум в экспрессии белка регулируется внутренними факторами ^9. Мы CoUл.д. далее заметить, что клетки с аналогичным уровнем Hog1 деятельности может отображать поразительно разные результаты экспрессии. Сочетание этих двух методов позволило нам продемонстрировать, как медленно ремоделирования генов стресс-ответа повлияло на исход выражение в одном уровне клетки ^7.

В данной работе мы используем выражение р STL1-QV репортера, вызванного гипер-осмотического шока в качестве примера количественной оценки экспрессии белка по микроскопии и проточной цитометрии. Этот же штамм подвергается 0,2 М NaCl стресса изучали с обоих методов. Это позволит нам выделить несколько ключевых различия в этих двух весьма дополнительных методов.

Protocol

1. Микроскопии Измерения

1. Инокулировать 5 мл синтетической среде с дрожжами.
2. Рост клеток при 30 ° С в течение ночи.
3. Измерьте OD ₆₀₀ из ночной культуры на следующее утро.
4. Развести ночной культуры в 5 мл синтетической среде с OD ₆₀₀ 0,05.
5. Grow разбавленной культуры при 30 ° С в течение по меньшей мере 4 часов.
6. Подготовка 3-кратный концентрированный (0,6 М) раствора NaCl в синтетической среде.
7. Подготовка 1 мг / мл раствора конканавалин А (ConA) в PBS.
8. Фильтрата ~ 200 мкл ConA раствора в слайде хорошо.
9. Дайте постоять в течение 30 минут.
10. Удалить решение ConA.
11. Добавить 150 мкл H ₂ O к колодцу.
12. Удалить H ₂ O.
13. Измерьте OD ₆₀₀ из клеточной культуры.
14. Подготовка 300 мкл клеточной культуре при OD ₆₀₀ = 0,02 в 1,5 мл микропробирки.
15. Обрабатывают ультразвуком клеток в водяной бане в течение 45 сек.
16. Vortex кратко мильcrotube.
17. Обрабатывают ультразвуком клеток в водяной бане в течение 45 сек.
18. Vortex кратко микропробирку.
19. Добавить 200 мкл клеточной культуре к колодцу.
20. Подождите 30 минут, чтобы клетки оседают на дно скважины.
21. Поместите а скользят по микроскопом.
22. Выберите настройки освещения для люминесцентной канал для записи.
23. Выберите настройки освещения для двух ярких изображений на местах (один немного не в фокусе: 3 мкм ниже фокальной плоскости для обеспечения надлежащего сегментации клеток).
24. Выберите временные интервалы для измерения покадровой
25. Выберите поля зрения в изображении.
26. Начните приобретение нескольких кадров.
27. Пауза приобретение добавить 100 мкл 0,6 М NaCl среды.
28. Резюме изображений.

2. Проточная цитометрия Измерения

1. Инокулировать 5 мл синтетической среде с дрожжами.
2. Расти при 30 ° С в течение ночи.
3. МераОП ₆₀₀ из ночной культуры на следующее утро.
4. Развести ночной культуры в 5 мл синтетической среде с OD ₆₀₀ 0.1.
5. Расти при 30 ° С в течение по меньшей мере 4 ч, чтобы достичь OD ₆₀₀ 0,2-0,4.
6. Подготовка циклогексимид решения 1 мг / мл в H ₂ O.
7. Подготовка 3-кратный концентрированный (0,6 М) раствора NaCl в синтетической среде.
8. Подготовьте 1,5 мл микропробирок 100 мкл 0,6 М NaCl среды для каждой временной точки должны быть измерены.
9. В момент времени 0, добавьте 200 мкл клеточной культуры в каждую микропробирку.
10. Выдержите при встряхивании при 30 ° С.
11. В момент времени Т, добавить 30 мкл циклогексимид в микропробирки.
12. Повторите шаг 2,11 для всех желаемых времени.
13. Выдержите все микропробирок по крайней мере 45 минут и до 3 ч при 30 ° С при встряхивании.
14. Подготовка FACS труб с 400 мкл PBS.
15. Разрушать ультразвуком клеток в водяной бане в течение 1 мин.
16. Vortex кратко Микропробирки.
17. Сынicate клетки в водяной бане в течение 1 мин.
18. Vortex кратко Микропробирки.
19. Добавить 100 мкл культуры клеток из каждой микропробирку в соответствующий FACS трубы.
20. Выберите лазер на 488 нм возбуждения и 530/30 нм полосовой фильтр для обнаружения.
21. Тест не-выражения и полностью выражая образец для проверки, если они попадают в диапазон чувствительности извещателя.
22. Измерьте 10000 клеток для каждого образца приобретенной.

Results

Микроскопия

Клетки дрожжей, несущие выражение репортер р STL1-QV (ySP9 ⁷⁾ были прикреплены к нижней части скважины горкой и помещен под микроскопом. Клетки стимулировали добавлением напряжений среды непосредственно в скважине в ходе сеанса изображения. Это позволяет нам приобрести несколько изображений клеток перед индукцией пути и следовать их судьбу после стимуляции. В данном случае, были затем клетки в течение ~ 2 часов с интервалом времени в 10 мин. Рис. 1А

Discussion

Микроскопия

Лечение колодца с ConA является важным шагом для обеспечения надлежащего изображений клеток. Поскольку ConA имеет низкую растворимость в PBS (5 мг / мл), процесс фильтрования позволяет удаление больших агрегатов, которые присутствуют в нефильтрованной раствора и мешают визуализации. Клетки приложить сравнительно сильно к обрабатываемой поверхности и добавление индуцирующего раствора не должно мешать локализации клеток, что позволяет непрерывного отслеживания до и после стимул. Эта о...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Дрожжи Азотное основание	ForMedium	CYN6202
CSM смесь аминокислот	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Циклогексимид	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Программное обеспечение для	Ti-Eclipse
Micro-manager	Ver 1.4.11
Инкубационная камера	LIS	The Box
Флуоресцентный свет	источник Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Проточный цитометр	BD	FACS calibur
Ультразвуковая ванна	Telesonic	TUC-150
8-луночный слайд	Thermo Lab-tek	155409
96-луночный планшет	Матричная бионаука	MGB096-1-2-LG
FACS трубка	BD Falcon 352054