Два дополнительных методы, основанные на цитометрии потока и микроскопии представлены которые позволяют количественно, в уровне одной клетки, динамики экспрессии генов, вызванных активацией MAPK пути в дрожжах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Количественная оценка экспрессии генов на уровне одной клетки раскрывает новые регуляторные механизмы уведут в измерениях, выполненных на уровне населения. Два методы, основанные на микроскопии и проточной цитометрии представлены продемонстрировать, как такие данные могут быть приобретены. Выражение флуоресцентного репортера, индуцированной при активации высокой осмолярности глицерин пути МАРК в дрожжах используется в качестве примера. Особые преимущества каждого метода выделены. Проточная цитометрия измеряет большое количество клеток (10000) и обеспечивает прямое измерение динамики белка экспрессии независимо от медленных созревания кинетики флуоресцентного белка. Изображений живых клеток с помощью микроскопа является напротив ограничено измерением зрелой форме репортера в меньшем количестве клеток. Тем не менее, наборы данных, генерируемые этой техники может быть чрезвычайно богатые благодаря комбинации нескольких репортеров и в пространственном и временном информацииполучены из отдельных клеток. Сочетание этих двух методов измерений может доставить новый взгляд на регуляцию экспрессии белка на сигнальных путей.
Введение
Сигнализация с помощью трансдукции каскадов часто достигает кульминации в экспрессии белков. Характеристика этого профиля экспрессии является ключевым элементом в понимании функции биологических путей. Идентификация спектра до регулируемых белков и динамики их активации может быть достигнуто различными способами, такими как микро-массивов, северных пятнами или западных помарки 1-3. Однако, эти методы в среднем отклик всей популяции клеток. Чтобы понять тонкую регуляцию экспрессии белков, желательно, чтобы собрать измерения на уровне одной клетки. В идеале, эти измерения должны также обеспечить количественные данные поддаются развивать математические модели....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Микроскопии Измерения
- Инокулировать 5 мл синтетической среде с дрожжами.
- Рост клеток при 30 ° С в течение ночи.
- Измерьте OD 600 из ночной культуры на следующее утро.
- Развести ночной культуры в 5 мл синтетической среде с OD 600 0,05.
- Grow разбавленной культуры при 30 ° С в течение по меньшей мере 4 часов.
- Подготовка 3-кратный концентрированный (0,6 М) раствора NaCl в синтетической среде.
- Подготовка 1 мг / мл раствора конканавалин А (ConA) в PBS.
- Фильтрата ~ 200 мкл ConA раствора в слайде хорошо.
- Дайте постоять в течение 30 минут.
- Удалить решени....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Микроскопия
Клетки дрожжей, несущие выражение репортер р STL1-QV (ySP9 7) были прикреплены к нижней части скважины горкой и помещен под микроскопом. Клетки стимулировали добавлением напряжений среды непосредственно в скважине в ходе сеанса изображения. Это позволяет нам приобрести несколько изображений клеток перед индукцией пути и следовать их судьбу после стимуляции. В данном случае, были затем клетки в течение ~ 2 часов с интервалом времени в 10 мин. Рис. 1А
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Микроскопия
Лечение колодца с ConA является важным шагом для обеспечения надлежащего изображений клеток. Поскольку ConA имеет низкую растворимость в PBS (5 мг / мл), процесс фильтрования позволяет удаление больших агрегатов, которые присутствуют в нефильтрованной раствора и мешают визуализации. Клетки приложить сравнительно сильно к обрабатываемой поверхности и добавление индуцирующего раствора не должно мешать локализации клеток, что позволяет непрерывного отслеживания до и после стимул. Эта о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Авторы благодарят Маттиас Петра и его группу в Институте биохимии в ETH в Цюрихе, где были разработаны эти методы. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Швейцарии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Дрожжи Азотное основание | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM смесь аминокислот | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Циклогексимид | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Программное обеспечение для | Ti-Eclipse | |
| Micro-manager | Ver 1.4.11 | ||
| Инкубационная камера | LIS | The Box | |
| Флуоресцентный свет | источник Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Проточный цитометр | BD | FACS calibur | |
| Ультразвуковая ванна | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-луночный слайд | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-луночный планшет | Матричная бионаука | MGB096-1-2-LG | |
| FACS трубка | BD Falcon 352054 |
Ссылки
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
