Методическая статья

Одновременное количественное определение клеточных и внеклеточных компонентов биопленок

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50639

⸱

10 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол для одновременной количественной оценки и сравнения трех клеточных и внеклеточных компонентов в биопленках. Методология включает в себя использование конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, программного обеспечения для структурного анализа и визуализации биопленки, а также программного обеспечения для статистического анализа.

Аннотация

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) является мощным инструментом для исследования биопленок. Очень немногие исследования позволили количественно оценить параллельное распределение более двух компонентов в биопленках, потому что: 1) выбор флуоресцентных красителей с минимальным спектральным перекрытием затруднен, и 2) количественное определение нескольких флуорохромов представляет собой многофакторную проблему. Цели: Представьте методологию количественной оценки и сравнения параллельных трехмерных распределений трех клеточных/внеклеточных компонентов биопленок, выращенных на соответствующих субстратах. методика: Метод состоит из отдельных, взаимосвязанных этапов, включающих выращивание биопленки, окрашивание, CLSM-визуализацию, структурный анализ и визуализацию биопленки, а также статистический анализ структурных параметров. Биопленки Streptococcus mutans (штамм UA159) выращивали в течение 48 ч на стерильных образцах композитов смол Point 4 и TPH3. Затем образцы погружали на 60 секунд либо в ополаскиватели для полости рта Biotène PBF (BIO) или Listerine Total Care (LTO), либо в воду (контрольная группа; n=5/группа). Биопленки окрашивали флуорохромами для внеклеточных полимерных веществ, белков и нуклеиновых кислот перед визуализацией с помощью CLSM. Структурные параметры биопленки, рассчитанные с помощью программного обеспечения для анализа изображений ISA3D, включают биообъем и среднюю толщину биопленки. Статистический анализ смешанных моделей сравнивал структурные параметры между группами ополаскивателя для полости рта и контрольной группой (программное обеспечение SAS; α=0,05). Программное обеспечение Volocity позволило визуализировать 3D-распределения наложенных компонентов биопленки (флуорохромов). Результаты: Ополаскиватель для полости рта BIO производил структуры биопленки, которые значительно отличались от контрольной (p<0,05) на обоих композитных смолах, в то время как LTO не вызывал различий (p>0,05) ни на одном из продуктов. Выводы: Эта методология эффективно и успешно количественно оценила и сравнила параллельные 3D-распределения трех основных компонентов биопленок S. mutans на соответствующих субстратах, тем самым преодолев две проблемы одновременной оценки компонентов биопленки. Этот метод также может быть использован для определения эффективности антибактериальных/противообрастающих агентов против нескольких компонентов биопленки, как показано на примере ополаскивателей для полости рта. Кроме того, этот метод имеет широкое применение, поскольку он облегчает сравнение 3D-структур/архитектуры биопленок в различных дисциплинах.

Введение

Биопленки - это структурированные микробные сообщества, которые инкапсулированы в самостоятельно производимый внеклеточный матрикс и прикреплены к биологическим или инертным поверхностям1. Биопленки представляют собой обычный образ жизни для многих бактерий и формируются путем поэтапного перехода от свободно плавающих (планктонных) клеток к сложным многовидовым сообществам. Присущая биопленкам устойчивость к противомикробным препаратам лежит в основе многих стойких и хронических бактериальных инфекций1,2, о чем свидетельствуют биопленки полости рта (зубной налет). Кариесогенные микроорганизмы, такие как мутаны, стрептококки, перерабатывают сахарозу и другие углеводы для производства внеклеточного матрикса и образования кислот, которые могут деминерализовать структуру зубов и вызывать кариес. Большинство биопленочных матриц представляют собой биополимеры, состоящие из клеточных и внеклеточных компонентов, таких как экзополисахариды (ЭПС), белки и нуклеиновые кислоты3,4.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM), наиболее широко используемый метод флуоресцентной визуализации, радикально изменил оптическую визуализацию в биологии, поскольку она обладает способностью собирать 3D-изображения гидратированных биологических структур без фиксации5,6,7. Этот неразрушающий метод включает в себя сбор изображений тонких срезов в пределах интересующей области образца таким образом, чтобы исключить вклад расфокусированного света. Качество и разрешение изображений, полученных с помощью CLSM, превосходят возможности широкопольной флуоресцентной микроскопии. Одним из основных недостатков CLSM является то, что сканирование изображений происходит медленнее, чем при использовании методов широкопольной микроскопии, при которых целые изображения собираются одновременно. Тем не менее, с расширением выбора флуорохромов, лазеров и фильтров, CLSM стал одним из преобладающих методов для мультиспектральной визуализации5,7.

Предыдущие исследования показали, что CLSM является полезным инструментом для изучения структуры или архитектуры биопленок с использованием одной или двух флуоресцентных меток или красителей, чтобы обеспечить лучшее понимание распределения EPS и клеток внутри биопленок, и особенно во внеклеточном матриксе7,8. Теоретически флуоресцентное окрашивание/мечение нескольких компонентов является желательным для изучения детальной структуры и колокализации клеточных и внеклеточных компонентов в биопленках. Тем не менее, параллельный анализ различных компонентов в биопленках может быть сложным, потому что: 1) выбор флуоресцентных красителей с минимальным спектральным перекрытием затруднен и 2) количественное определение нескольких флуорохромов представляет собой многофакторную проблему. Колокализация с использованием нескольких флуорохромов требует использования высокоспецифичных красителей с минимальной спектральной интерференцией, чтобы избежать каких-либо эффектов просачивания, которые возникают, когда два флуорохрома имеют значительное перекрытие в своем спектральном пике, в результате чего один из них возбуждается сильнее, чем другие9. В идеале флуорохромы с не перекрывающимися спектрами возбуждения должны обеспечить наилучшие результаты, однако найти красители, отвечающие этому критерию, очень сложно. Вместо этого выбор пятен оптимизируется за счет выбора флуорохромов, спектры излучения которых имеют минимальное перекрытие, что позволяет рассматривать пятна одно за другим в ограниченном диапазоне длин волн наблюдения9.

Наложение флуоресцентных изображений, вероятно, является наиболее широко используемым методом оценки параллельного распределения флуорохромов. Колокализация различных компонентов проявляется в виде наложения различных цветов через многочисленные каналы, создаваемые исследуемыми флуорохромами10. Инструменты для отображения многоканальных флуоресцентных изображений в виде объединенных цветных изображений доступны в большинстве программ CLSM и программ для анализа биологических изображений. Хотя наложение изображений полезно для пространственной оценки колокализации, изображения могут быть качественно изучены только с помощью визуального анализа. Это дает ограниченное количество информации, поскольку эти представления обычно не помогают количественно оценить колокализацию в различных экспериментальных условиях и не определяют, превышает ли колокализация случайное совпадение11. До сих пор в очень немногих исследованиях использовались количественные методы для анализа трехмерной структуры биопленок и компонентов биопленки, и еще меньшее количество исследований количественно оценивало влияние антибактериальных обработок или противообрастающих мер на компоненты биопленки.

Целью данного исследования было представить методологию количественной оценки и сравнения параллельных трехмерных распределений трех клеточных и внеклеточных компонентов биопленок. Метод состоит из отдельных, но взаимосвязанных этапов, включающих выращивание биопленки, окрашивание, CLSM-визуализацию биопленок, структурный анализ и визуализацию биопленки, а также статистический анализ структурных параметров. Анализ роста биопленки позволяет выращивать биопленку на соответствующих субстратах и создает воспроизводимые структуры биопленки. Сочетание нового одновременного окрашивания ЭПС, белков и компонентов нуклеиновых кислот с измерением структурных параметров биопленки в 3D приводит к количественно измеримому распределению компонентов в биопленках. Статистический анализ структурных параметров биопленки облегчает оценку биопленок в конкретных экспериментальных условиях (например, после обработки ополаскивателями для полости рта), как будет описано в следующем разделе.

Протокол

1. Приготовление сред и реагентов

  1. Приготовьте 300 мл среды для ночного культивирования (THY; 3% бульон Тодда-Хьюитта, приготовленный согласно инструкции производителя, с добавлением 0,3% дрожжевого экстракта в ультрачистой воде) и проавтоклавируйте. Хранить при комнатной температуре до 2 месяцев.
  2. Приготовьте 1 л агара THY (3% бульон Тодда-Хьюитта, 0,3% дрожжевого экстракта и 1,5% агара в ультрачистой воде), проавтоклавируйте и охладите до 60 °C перед разливом в чашки Петри. Хранить при 4 °C до 3 месяцев.
  3. Приготовьте 150 мл среды для роста биопленки (0,5X TY с добавлением 10 mM сахарозы; 1,5% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 10 mM сахарозы в ультрачистой воде) и стерилизуйте методом фильтрации. Хранить при комнатной температуре до 1 месяца.
  4. Приготовьте 1 л фосфатно-солевого буферного раствора (PBS; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 и 0,24 g KH2PO4 в ультрачистой воде) и проавтоклавируйте. Хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
  5. Приготовьте 600 мл 10 mM буфера Tris HCl с добавлением 10 mM CaCl2 в ультрачистой воде (буфер TC; pH 7,2) и проавтоклавируйте. Хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
  6. Проавтоклавируйте 1 л ультрачистой воды. Хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

2. Изготовление образцов

  1. Изготовьте дискообразные образцы из зубных композитных смол Point 4 (PF) и TPH3 (TP) в специально изготовленной форме из нержавеющей стали двумя слоями. Каждый слой подвергайте световой полимеризации в течение 40 sec с помощью светодиодного (LED) полимеризатора. Эти два продукта имеют несколько различающийся состав и уровень наполнения, что приводит к формированию разных топографий поверхности, на которых будут выращиваться биопленки.
    1. Вместо шага 2.1 образцы соответствующих субстратов могут быть изготовлены с использованием установленных протоколов из других дисциплин.
  2. Обработайте и отполируйте образцы до достижения приемлемой окончательной чистоты поверхности, например, используя полуавтоматический шлифовально-полировальный станок. Промойте отполированные образцы ультрачистой водой и высушите с помощью сжатого воздуха.
  3. Стерилизуйте образцы с помощью газообразного этиленоксида или альтернативным методом стерилизации.

3. Рост биопленки

  1. Инокулируйте одну колонию S. mutans в 4 ml ночной культуральной среды (шаг 1.1). Инкубируйте в течение ночи при 37 °C в течение 16-18 ч. Оптическая плотность (OD600) культуры должна быть ≥0.9.
    1. Рекомендуется использовать колонию из планцевых культур, прошедших двухкратный пассаж из исходного стока, так как это обеспечивает более стабильный рост биопленки.
  2. Приготовьте разведение 1:100, используя ночную культуру (шаг 1.1) в 10 ml среды для роста биопленки (шаг 1.3).
  3. Перенесите стерильные образцы композитного пломбировочного материала (например, PF, TP) в стерильные 12-луночные планшеты.
  4. Добавьте по 2.5 ml разведенной культуральной среды (шаг 3.2) в лунки для групп обработки (ополаскиватель для рта) и контрольных групп. В лунки контроля стерильности добавьте по 2.5 ml стерильной неинокулированной среды для роста биопленки.
  5. Культивируйте биопленки в микроаэрофильных условиях. Поместите планшеты на шейкер при 100 rpm в инкубатор при 37 °C на 24 ч.
  6. Через 24 ч асептически аспирируйте среду из всех лунок и дважды промойте стерильным PBS (шаг 1.4; 2.5 ml/лунку), аспирируя PBS после каждой промывки. Добавьте по 2.5 ml свежей среды для роста биопленки в каждую лунку и инкубируйте еще 24 ч в тех же условиях, что и на предыдущем этапе, чтобы общее время роста биопленки составило 48 ч.
  7. Вместо вышеописанных этапов биопленки других видов могут быть выращены на субстратах с использованием установленных протоколов.

4. Антибактериальная обработка/обработка ополаскивателем для полости рта

  1. После завершения роста биопленки аспирируйте среду.
  2. Добавьте 2,5 ml ополаскивателя для рта Biotène PBF (BIO) или Listerine Total Care (LTO), либо другого исследуемого средства, в лунки групп терапии, а в лунку контрольной группы добавьте 2,5 ml стерильной сверхчистой воды. Погрузите образцы на 60 sec, согласно инструкциям производителя, при перемешивании планшетов на орбитальном шейкере со скоростью 150 rpm. Немедленно аспирируйте ополаскиватель и сверхчистую воду из лунок.
  3. Промойте образцы 5 раз по 15 sec за одну промывку стерильной сверхчистой водой на орбитальном шейкере при 150 rpm, аспирируя воду после каждого этапа промывки.
  4. Взамен вышеуказанных этапов можно протестировать другие антибактериальные агенты, используя установленные протоколы.

5. Окрашивание

  1. Приготовьте разведения красителей для анализа биопленок.
    1. Приготовьте стоковый раствор конканавалина А, конъюгата с Alexa Fluor 647 (AF), с концентрацией 5 mg/ml в 0,1 M растворе гидрокарбоната натрия при pH 8.3. Храните при -20 °C в одноразовых аликвотах в течение нескольких месяцев, так как повторное замораживание и оттаивание не рекомендуется. Используя данный стоковый раствор AF, приготовьте разведение 250 μg/ml в буфере TC.
    2. Приготовьте разведение 10 μM, используя стоковый раствор Syto 9 (SY) с концентрацией 5 mM, предоставленный производителем, в буфере TC. Храните оставшийся стоковый раствор SY при -20 °C в течение нескольких месяцев.
    3. Приготовьте разведение 10x, используя стоковый раствор Sypro Red (SR) с концентрацией 5,000x, предоставленный производителем, в стерильной сверхчистой воде. Храните оставшийся стоковый раствор SR при -20 °C в течение нескольких месяцев.
  2. Промойте все биопленки 2x буфером TC (2.5 ml/лунку), аккуратно перемешивая планшет круговыми движениями; оставьте раствор после второй промывки в планшете на 30 min при комнатной температуре. Аспирируйте жидкость.
  3. Нанесите каплю красителя AF объемом 50 μl на каждый образец биопленки. Окрашивайте в течение 30 min при комнатной температуре в защищенном от света месте. Промойте 2x буфером TC (2.5 ml/лунку), аспирируя жидкость после каждой промывки.
  4. Затем нанесите каплю красителя SY объемом 50 μl на каждый образец биопленки. Окрашивайте в течение 30 min при комнатной температуре в защищенном от света месте. Промойте 2x стерильной сверхчистой водой (2.5 ml/лунку), аспирируя жидкость после каждой промывки.
  5. В завершение нанесите каплю красителя SR объемом 50 μl на каждый образец биопленки. Окрашивайте в течение 30 min при комнатной температуре в защищенном от света месте. Промойте 3x стерильной сверхчистой водой (2.5 ml/лунку), аспирируя жидкость после каждой промывки.
  6. Перенесите образцы в 6-луночный планшет, помещая по одному образцу в каждую лунку в 6 ml стерильной сверхчистой воды для последующей конфокальной микроскопии.

6. Визуализация с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

  1. Получите изображения каждого компонента (красителя) внутри биопленок групп лечения и контроля с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с настройками, указанными в таблице 1. В данном исследовании использовался иммерсионный объектив 63X с числовой апертурой 0.9 и рабочим расстоянием 2.2 mm.
    Схема окрашивания биопленок; длины волн лазера (nm) и полосы излучения (nm) для ЭПС, нуклеиновых кислот и белков.
    Таблица 1. Настройки конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

  1. Установите область сканирования 250 μm x 250 μm и минимальное разрешение по пикселям 512 x 512, чтобы получить изображения CLSM с разрешением, достаточным для количественного анализа.
  2. Используйте краситель SY для определения верхней и нижней границ стека изображений биопленки, затем установите шаг по оси z, достаточный для количественного анализа (0,6 μm для данной работы). Перед началом сканирования оптимизируйте параметры изображения и окрашивания (т. е. напряжение и смещение ФЭУ) с помощью опции QLUT. Для присвоения псевдоцветов каждому красителю (зеленый для SY, красный для SR и синий для AF) использовалась цветовая lookup-таблица, чтобы сделать каждый компонент биопленки более различимым при 3D-реконструкции.
  3. Соберите изображения CLSM на частоте 400 Hz, используя последовательное сканирование в режиме «between stacks» для оптимизации захвата изображений нескольких красителей в пределах одной биопленки.

7. Структурный анализ биопленки

  1. Проанализируйте изображения, полученные с помощью CLSM, используя программное обеспечение для анализа изображений биопленок. В следующих шагах описывается использование ПО ISA3D12 для расчета структурных параметров полученных изображений биопленок.
    1. Скопируйте файлы изображений CLSM для каждой биопленки в папку Images, как указано в руководстве к программному обеспечению. Убедитесь в соблюдении требуемого программой соглашения об именовании файлов CLSM. Программное обеспечение позволяет анализировать файлы в подпапках в пакетном режиме, что облегчает одновременный анализ биопленок опытной и контрольной групп.
    2. Введите размеры осей x, y и z изображений CLSM в поля dxy и dz главного диалогового окна. Выберите настройки порога и картирования расстояний, как описано в руководстве к ПО (в данном исследовании использовались методы Otsu и Quasi-Euclidean соответственно). Введите подходящее имя для файла результатов, после чего запустите программу. Файл с результатами будет создан в папке ISA.
    3. Откройте файл результатов, чтобы получить значения двадцати структурных 3D-параметров12, таких как биообъем и средняя толщина биопленки (измеренные в данном исследовании), которые количественно определяют 3D-распределение каждого компонента (красителя) внутри биопленки.

8. Визуализация структуры биопленки

  1. С помощью программного обеспечения для анализа изображений создайте реконструкцию наложенных друг на друга компонентов (окрасок) внутри каждой биопленки. В следующих шагах описывается использование программы Volocity для создания 3D-реконструкций.
    1. Создайте библиотеку для каждой биопленки, импортировав файлы изображений CLSM в программу в соответствии с руководством.
    2. Используйте опцию меню 3D Renderer для получения реконструированного 3D-изображения из CLSM-снимков каждой биопленки (в данном исследовании использовался формат HR Opacity).
    3. Поверните 3D-изображение так, чтобы все биопленки были ориентированы одинаково относительно осей координат x, y и z. Сделайте снимок правильно ориентированной реконструкции биопленки, а затем экспортируйте этот снимок в формате TIFF, JPEG или другом подходящем формате.
  2. Проведите визуальный анализ совместного распределения компонентов ЭПС, белков и нуклеиновых кислот внутри биопленок на полученных реконструированных изображениях.
  3. Используйте коэффициент корреляции Пирсона и коэффициент перекрытия Мандерса для проведения анализа колокализации нескольких компонентов биопленки (в данном исследовании колокализация не измерялась).

9. Статистический анализ

  1. Для сравнения средних значений структурных параметров между группой, использовавшей ополаскиватель для рта, и контрольной группой, примените статистический анализ с использованием отдельных смешанных моделей (α=0.05). В данном исследовании для проведения статистического анализа использовалось программное обеспечение SAS.

Результаты

Репрезентативные результаты для групп с применением средств обработки (ополаскивателей для рта) и необработанной контрольной группы представлены в Таблице 2, а также на Рисунках 1 и 2. В Таблице 2 приведены значения среднего арифметического и стандартного отклонения для структурных параметров биопленки: биообъема (μm3) и средней толщины биопленки (μm), которые были рассчитаны с помощью программного обеспечения ISA3D. Структурные параметры биопленок, обработанных ополаскивателем, которые значимо отличались от параметров биопленок в контрольной группе (p<0.05), выделены в значениях среднего и стандартного отклонения красным цветом. Результаты статистического анализа смешанных моделей показали, что при использовании ополаскивателя BIO структура биопленок на обоих композитах значимо отличалась от контроля (p<0.05), тогда как ополаскиватель LTO не вызвал значимых различий (p>0.05) ни на одном из композитов. Результаты четко демонстрируют, что клеточные и внеклеточные компоненты биопленки, сохранившиеся после применения двух различных ополаскивателей, различались. Следует также отметить, что биопленки S. mutans, выращенные на двух разных субстратах (PF и TP), различались по своей 3D-структуре, несмотря на то, что они выращивались в одинаковых условиях и оба субстрата были полированы с использованием аналогичных абразивов.

Одновременное распределение ЭПС, белков и нуклеиновых кислот внутри биопленок может быть визуализировано с помощью 3D-реконструкций, созданных в программном обеспечении Volocity. Рисунки 1 и 2 демонстрируют репрезентативные реконструкции биопленок контрольной группы, выращенных на композитах из смол PF и TP соответственно. Синий краситель представляет ЭПС в биопленках S. mutans, зеленый краситель демонстрирует нуклеиновые кислоты, а красный краситель показывает белки. Промежуточное пространство может быть занято водой или другими компонентами биопленок, не имеющими флуоресцентной метки.

Трехмерный график рассеяния, динамическая визуализация данных, график, интерактивный исследовательский инструмент, аналитический дисплей.
Рисунок 1. Репрезентативная 3D-реконструкция биопленки S. mutans, выращенной на полимерном композите PF в контрольной группе (без обработки ополаскивателем для полости рта). Одновременное совмещение трех красителей в одной биопленке позволяет визуализировать компоненты ЭПС (синий краситель), нуклеиновых кислот (зеленый краситель) и белков (красный краситель) в биопленках S. mutans. (1 единица = 24 μm). Нажмите здесь, чтобы просмотреть рисунок в большем размере.

Визуализация 3D-структуры клеток, флуоресцентная микроскопия, анализ пространственных данных, научный график.
Рисунок 2. Репрезентативная 3D-реконструкция биопленки S. mutans, выращенной на композите TP resin в контрольной группе (без обработки ополаскивателем для рта). Совместное наложение трех красителей в пределах одной биопленки позволяет одновременно визуализировать компоненты EPS (синий краситель), нуклеиновых кислот (зеленый краситель) и белков (красный краситель) в биопленках S. mutans. (1 Unit = 24 μm). Нажмите здесь, чтобы просмотреть рисунок в большем размере.

Композитный пломбировочный материалТочка 4TPH3
Ополаскиватель для ртаКомпонентBV (μm3)MT (μm)BV (μm3)MT (μm)
Biotène PBFНуклеиновые кислоты279,517±53,2919.32±2.80195,033±42,0147.45±3.70
EPS344,902±56,38635.22±17.19197,840±62,3519.83±7.26
Белки298,796±62,86854.21±21.65216,033±66,65424.33±39.64
Listerine Total CareНуклеиновые кислоты355,707±110,44426.45±14.21273,296±47,32313.43±2.89
EPS494,099±180,59264.90± 26.68329,150±47,14534.35±30.32
Белки348,416±161,31658.68±47.28303,150±54,70534.18±41.46
Контроль (без обработки)Нуклеиновые кислоты388,375±42,15251.15±40.66327,809±39,40017.08±1.65
EPS660,448±173,19791.37±74.84363,850±67,61228.33± 15.07
Белки517,274±119,475127.96±73.84353,161±56,51821.17±4.41

Таблица 2. Средние значения и стандартное отклонение биообъема (BV) и средней толщины биопленки (MT) для биопленок, обработанных BIO или LTO, а также необработанных (контрольная группа). Структурные параметры биопленок, обработанных ополаскивателями для рта, которые значимо отличались от параметров биопленок в контрольной группе (p<0.05), отмечены красным цветом (средние значения и стандартное отклонение).

Обсуждение

Получение CLSM-изображений должно быть выполнено таким образом и в таком формате, которые необходимы для количественной оценки биопленок и для колокализационного анализа, таким образом, чтобы распределение интенсивности сигнала в каждом изображении было надежным отражением распределения каждого флуорохрома в стеке биопленки. Интенсивность сигнала должна быть различимой от шума и фона10,11, не подверженной влиянию автофлуоресценции от подложки и имеющей минимальные просачивания из-за спектральной интерференции между используемыми флуорохромами11. Шум является неизбежным ограничением флуоресцентной микроскопии11, и качество изображения иногда может быть ограничено по техническим или логистическим причинам. Идентификация флуорохромов с минимальным спектральным перекрытием имеет решающее значение для успеха этого метода, но может быть сложной. Кроме того, количественное определение множественных флуорохромов представляет собой многофакторную проблему. Поэтому неудивительно, что очень немногие исследования успешно количественно оценили одновременное распределение более двух компонентов в структурах биопленок.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы представить методологию, состоящую из отдельных, но взаимосвязанных этапов количественной оценки и сравнения параллельных трехмерных распределений трех клеточных и внеклеточных компонентов в биопленках. Описанный анализ роста биопленки позволяет выращивать биопленку на соответствующих субстратах и создает воспроизводимые биопленочные структуры, как показано в результатах, приведенных в таблице 1. Сочетание нового одновременного окрашивания ЭПС, белков и компонентов нуклеиновых кислот с измерением структурных параметров биопленки в 3D приводит к количественно измеримому распределению компонентов в биопленках. Качественный визуальный анализ параллельного распределения ЭПС, белков и нуклеиновых кислот в биопленках возможен путем реконструкции наложенных на нее пятен внутри каждой биопленки. Программное обеспечение ISA3D12 содержит несколько уникальных структурных параметров, таких как фрактальная размерность, однородность и коэффициент шероховатости биопленки, в дополнение к традиционно измеряемым параметрам, таким как пористость и толщина биопленки, для улучшения количественного определения трехмерных структур биопленок. Статистический анализ структурных параметров биопленки облегчает релевантное сравнение биопленок в конкретных экспериментальных условиях, таких как антибактериальная/противообрастающая эффективность (например, после обработки ополаскивателями для полости рта) или во времени (временные эффекты).

Эта методология эффективно и успешно количественно оценила и сравнила параллельные 3D-распределения трех основных компонентов биопленок S. mutans , которые были выращены на соответствующих субстратах, тем самым преодолев две проблемы одновременной оценки компонентов биопленки. Этот метод также может быть использован для определения эффективности антибактериальных процедур или противообрастающих мер в отношении нескольких компонентов биопленки, как показано с использованием ополаскивателей для полости рта в этом исследовании. Кроме того, большинство описанных выше протоколов могут быть заменены протоколами по изготовлению соответствующих субстратов и анализам роста биопленки соответствующих микроорганизмов. Таким образом, этот метод имеет широкое применение, поскольку он облегчает сравнение 3D-структур/архитектуры биопленок in vitro и in vivo в различных дисциплинах, включая медицину, стоматологию, геологию и морские науки.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Производство и бесплатный доступ к этой статье спонсируются компанией Leica Microsystems.

Благодарности

Финансирование этого исследования было предоставлено грантом Национальных институтов здравоохранения/NIDCR 1R15DE019566-01A1. Dr. Джим Хенторн (Jim Henthorn) (Лаборатория проточной и графической цитометрии OUHSC) отмечен за оказание технической помощи в области конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Доктор Фернандо Эстебан Флорес (Департамент стоматологических материалов) благодарен за оказание технической помощи во время съемок этого видео.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bacto AgarBecton, Dickinson and Company214010
Bacto Todd Hewitt BrothBecton, Dickinson and Company249240
Дрожжевой экстракт, гранулированныйEMD Millipore1.03753.0500
Bacto TryptoneBecton, Dickinson and Company211705
OmniPur SucroseEMD Millipore8510
Хлорид калия, реагент ACS, 99,0-100,5%Sigma-AldrichP3911-500G
Фосфат калия, одноосновный, ≥ 99,0%, реагент ACSSigma-AldrichP0662-500G
Хлорид натрияSigma-AldrichS9888-500G
Фосфат натрия, моноосновный, моногидратEMD MilliporeSX0710-1
Трис(гидроксиметил)аминометан, 99,8+%, реагент ACSSigma-Aldrich252859-500G
А, Alexa Fluor 647 КонъюгатИнвитрогенC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 или S6653
Biotè Ополаскиватель для полости рта PBFGlaxoSmithKlineN/A
Listerine Total CareMcNeil-PPC, Inc.Н/Д
Конканавалин

Ссылки

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  3. Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).
  4. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).
  5. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).
  6. Robinson, J. P. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).
  7. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).
  8. Wood, S. R., et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).
  9. Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).
  10. Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).
  11. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).
  12. Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).

Перепечатки и разрешения

Теги

3DStreptococcus mutans
Одновременное количественное определение клеточных и внеклеточных компонентов биопленок
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.