Одновременное количественное определение клеточных и внеклеточных компонентов биопленок

Summary

Представлен протокол для одновременной количественной оценки и сравнения трех клеточных и внеклеточных компонентов в биопленках. Методология включает в себя использование конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, программного обеспечения для структурного анализа и визуализации биопленки, а также программного обеспечения для статистического анализа.

Abstract

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) является мощным инструментом для исследования биопленок. Очень немногие исследования позволили количественно оценить параллельное распределение более двух компонентов в биопленках, потому что: 1) выбор флуоресцентных красителей с минимальным спектральным перекрытием затруднен, и 2) количественное определение нескольких флуорохромов представляет собой многофакторную проблему. Цели: Представьте методологию количественной оценки и сравнения параллельных трехмерных распределений трех клеточных/внеклеточных компонентов биопленок, выращенных на соответствующих субстратах. методика: Метод состоит из отдельных, взаимосвязанных этапов, включающих выращивание биопленки, окрашивание, CLSM-визуализацию, структурный анализ и визуализацию биопленки, а также статистический анализ структурных параметров. Биопленки Streptococcus mutans (штамм UA159) выращивали в течение 48 ч на стерильных образцах композитов смол Point 4 и TPH³. Затем образцы погружали на 60 секунд либо в ополаскиватели для полости рта Biotène PBF (BIO) или Listerine Total Care (LTO), либо в воду (контрольная группа; n=5/группа). Биопленки окрашивали флуорохромами для внеклеточных полимерных веществ, белков и нуклеиновых кислот перед визуализацией с помощью CLSM. Структурные параметры биопленки, рассчитанные с помощью программного обеспечения для анализа изображений ISA3D, включают биообъем и среднюю толщину биопленки. Статистический анализ смешанных моделей сравнивал структурные параметры между группами ополаскивателя для полости рта и контрольной группой (программное обеспечение SAS; α=0,05). Программное обеспечение Volocity позволило визуализировать 3D-распределения наложенных компонентов биопленки (флуорохромов). Результаты: Ополаскиватель для полости рта BIO производил структуры биопленки, которые значительно отличались от контрольной (p<0,05) на обоих композитных смолах, в то время как LTO не вызывал различий (p>0,05) ни на одном из продуктов. Выводы: Эта методология эффективно и успешно количественно оценила и сравнила параллельные 3D-распределения трех основных компонентов биопленок S. mutans на соответствующих субстратах, тем самым преодолев две проблемы одновременной оценки компонентов биопленки. Этот метод также может быть использован для определения эффективности антибактериальных/противообрастающих агентов против нескольких компонентов биопленки, как показано на примере ополаскивателей для полости рта. Кроме того, этот метод имеет широкое применение, поскольку он облегчает сравнение 3D-структур/архитектуры биопленок в различных дисциплинах.

Introduction

Биопленки - это структурированные микробные сообщества, которые инкапсулированы в самостоятельно производимый внеклеточный матрикс и прикреплены к биологическим или инертным поверхностям¹. Биопленки представляют собой обычный образ жизни для многих бактерий и формируются путем поэтапного перехода от свободно плавающих (планктонных) клеток к сложным многовидовым сообществам. Присущая биопленкам устойчивость к противомикробным препаратам лежит в основе многих стойких и хронических бактериальных инфекций^1,2, о чем свидетельствуют биопленки полости рта (зубной налет). Кариесогенные микроорганизмы, такие как мутаны, стрептококки, перерабатывают сахарозу и другие углеводы для производства внеклеточного матрикса и образования кислот, которые могут деминерализовать структуру зубов и вызывать кариес. Большинство биопленочных матриц представляют собой биополимеры, состоящие из клеточных и внеклеточных компонентов, таких как экзополисахариды (ЭПС), белки и нуклеиновые кислоты^3,4.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM), наиболее широко используемый метод флуоресцентной визуализации, радикально изменил оптическую визуализацию в биологии, поскольку она обладает способностью собирать 3D-изображения гидратированных биологических структур без фиксации^5,6,7. Этот неразрушающий метод включает в себя сбор изображений тонких срезов в пределах интересующей области образца таким образом, чтобы исключить вклад расфокусированного света. Качество и разрешение изображений, полученных с помощью CLSM, превосходят возможности широкопольной флуоресцентной микроскопии. Одним из основных недостатков CLSM является то, что сканирование изображений происходит медленнее, чем при использовании методов широкопольной микроскопии, при которых целые изображения собираются одновременно^. Тем не менее, с расширением выбора флуорохромов, лазеров и фильтров, CLSM стал одним из преобладающих методов для мультиспектральной визуализации^5,7.

Предыдущие исследования показали, что CLSM является полезным инструментом для изучения структуры или архитектуры биопленок с использованием одной или двух флуоресцентных меток или красителей, чтобы обеспечить лучшее понимание распределения EPS и клеток внутри биопленок, и особенно во внеклеточном матриксе^7,8. Теоретически флуоресцентное окрашивание/мечение нескольких компонентов является желательным для изучения детальной структуры и колокализации клеточных и внеклеточных компонентов в биопленках. Тем не менее, параллельный анализ различных компонентов в биопленках может быть сложным, потому что: 1) выбор флуоресцентных красителей с минимальным спектральным перекрытием затруднен и 2) количественное определение нескольких флуорохромов представляет собой многофакторную проблему. Колокализация с использованием нескольких флуорохромов требует использования высокоспецифичных красителей с минимальной спектральной интерференцией, чтобы избежать каких-либо эффектов просачивания, которые возникают, когда два флуорохрома имеют значительное перекрытие в своем спектральном пике, в результате чего один из них возбуждается сильнее, чем другие⁹. В идеале флуорохромы с не перекрывающимися спектрами возбуждения должны обеспечить наилучшие результаты, однако найти красители, отвечающие этому критерию, очень сложно. Вместо этого выбор пятен оптимизируется за счет выбора флуорохромов, спектры излучения которых имеют минимальное перекрытие, что позволяет рассматривать пятна одно за другим в ограниченном диапазоне длин волн наблюдения⁹.

Наложение флуоресцентных изображений, вероятно, является наиболее широко используемым методом оценки параллельного распределения флуорохромов. Колокализация различных компонентов проявляется в виде наложения различных цветов через многочисленные каналы, создаваемые исследуемыми флуорохромами¹⁰. Инструменты для отображения многоканальных флуоресцентных изображений в виде объединенных цветных изображений доступны в большинстве программ CLSM и программ для анализа биологических изображений. Хотя наложение изображений полезно для пространственной оценки колокализации, изображения могут быть качественно изучены только с помощью визуального анализа. Это дает ограниченное количество информации, поскольку эти представления обычно не помогают количественно оценить колокализацию в различных экспериментальных условиях и не определяют, превышает ли колокализация случайное совпадение¹¹. До сих пор в очень немногих исследованиях использовались количественные методы для анализа трехмерной структуры биопленок и компонентов биопленки, и еще меньшее количество исследований количественно оценивало влияние антибактериальных обработок или противообрастающих мер на компоненты биопленки.

Целью данного исследования было представить методологию количественной оценки и сравнения параллельных трехмерных распределений трех клеточных и внеклеточных компонентов биопленок. Метод состоит из отдельных, но взаимосвязанных этапов, включающих выращивание биопленки, окрашивание, CLSM-визуализацию биопленок, структурный анализ и визуализацию биопленки, а также статистический анализ структурных параметров. Анализ роста биопленки позволяет выращивать биопленку на соответствующих субстратах и создает воспроизводимые структуры биопленки. Сочетание нового одновременного окрашивания ЭПС, белков и компонентов нуклеиновых кислот с измерением структурных параметров биопленки в 3D приводит к количественно измеримому распределению компонентов в биопленках. Статистический анализ структурных параметров биопленки облегчает оценку биопленок в конкретных экспериментальных условиях (например, после обработки ополаскивателями для полости рта), как будет описано в следующем разделе.

Protocol

1. Приготовление сред и реагентов

1. Приготовьте 300 мл на ночь питательную среду (THY; 3% бульон Тодда Хьюитта, приготовленный в соответствии с инструкциями производителя с добавлением 0,3% дрожжевого экстракта в ультрачистой воде) и автоклав. Хранить при комнатной температуре до 2 месяцев.
2. Приготовьте 1 л агара THY (3% бульона Тодда Хьюитта, 0,3% дрожжевого экстракта и 1,5% агара в ультрачистой воде) в автоклаве и охладите до 60 °C перед тем, как разлить в чашки Петри. Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
3. Сделайте 150 мл биопленочной питательной среды (0,5X TY с добавлением 10 мМ сахарозы; 1,5% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 10 мМ сахарозы в ультрачистой воде) и простерилизуйте фильтром. Хранить при комнатной температуре до 1 месяца.
4. Приготовьте 1 л фосфатно-солевого буфера (PBS; 8 г NaCl, 0,2 г KCl,1,44 г Na2 HPO₄ и 0,24 г KH₂PO₄) и автоклав. Хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
5. Сделайте 600 мл 10 мМ Tris HCl буфер с добавлением 10 мМ CaCl₂ в ультрачистой воде (буфер TC; pH 7,2) и автоклаве. Хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
6. Автоклав 1 л сверхчистой воды. Хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

2. Изготовление образцов

1. Изготовьте дискообразные образцы композитов из стоматологической смолы Point 4 (PF) и TPH³ (TP) в изготовленной на заказ форме из нержавеющей стали в два этапа. Каждый шаг отверждается светом в течение 40 секунд с помощью светодиодного светоотверждающего устройства. Эти два продукта имеют несколько разный состав и уровни наполнителя, и, таким образом, создают различные топографии поверхности, на которых будут выращиваться биопленки.
   1. Образцы соответствующих субстратов могут быть изготовлены с использованием установленных протоколов из других дисциплин вместо шага 2.1.
2. Обрабатывайте и полируйте образцы до приемлемого конечного качества поверхности, например, с помощью полуавтоматической шлифовальной машины-полировальной машины. Полированные экземпляры промойте сверхчистой водой и высушите с помощью сжатого воздуха.
3. Стерилизуйте образцы с помощью газообразного этилена или альтернативного метода стерилизации.

3. Рост биопленки

1. Инокулируйте одну колонию S. mutans в культуральную среду объемом 4 мл на ночь (шаг 1.1). Выдерживать в течение ночи при 37 °C в течение 16-18 часов. Оптическая плотность (OD₆₀₀) культуры должна составлять ≥0,9.
   1. Лучше всего использовать колонию из пластинчатых культур, которые были пропущены в 2 раза от исходного материала, так как это приводит к более стабильному росту биопленки.
2. Создайте разведение в соотношении 1:100, используя ночную культуру (шаг 1.1) в 10 мл биопленочной питательной среды (шаг 1.3).
3. Переносите стерильные композитные образцы из смолы (например, PF, TP) на стерильные 12-луночные планшеты.
4. Добавляйте 2,5 мл разведенной питательной среды (шаг 3.2) в лунки для лечения (полоскание рта) и контрольные группы. Добавьте 2,5 мл стерильной неинокулированной биопленочной питательной среды в лунки для контроля стерильности.
5. Выращивайте биопленки в микроаэрофильных условиях. Поместите тарелки на шейкер при 100 об/мин внутри инкубатора при температуре 37 °C на 24 часа.
6. Через 24 часа асептически отасовать среду из всех лунок и дважды промыть стерильным PBS (шаг 1,4; 2,5 мл/лунка), отсасывая PBS после каждого промывки. Пополните 2,5 мл свежей биопленочной среды для выращивания в каждой лунке и инкубируйте еще 24 часа в тех же условиях, что и на предыдущем этапе, чтобы общее время роста биопленки составило 48 часов.
7. Вместо вышеуказанных шагов биопленки других видов могут быть выращены на субстратах с использованием установленных протоколов.

4. Антибактериальные процедуры/процедуры для полоскания рта

1. Аспиратная среда после завершения роста биопленки.
2. Добавьте 2,5 мл жидкости для полоскания рта Biotène PBF (BIO) или Listerine Total Care (LTO) или другого средства лечения в лунки для групп лечения и добавьте 2,5 мл стерильной сверхчистой воды в лунку контрольной группы. Погружайте образцы на 60 секунд в соответствии с инструкциями производителя, одновременно перемешивая пластины на орбитальном вибростенде со скоростью вращения 150 об/мин. Немедленно отсасывайте как жидкость для полоскания рта, так и сверхчистую воду из лунок.
3. Промойте образцы 5 раз в течение 15 секунд за промывку стерильной сверхчистой водой на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин, отсасывая воду после каждого этапа промывки.
4. Вместо вышеуказанных шагов другие антибактериальные агенты могут быть протестированы с использованием установленных протоколов.

5. Окрашивание

1. Подготовьте разведение пятен для анализа биопленки.
   1. Приготовьте стоковый раствор конканавалина А, конъюгата (АФ) Alexa Fluor 647 в дозе 5 мг/мл в 0,1 М бикарбоната натрия pH 8,3. Хранить при температуре -20 °C в одноразовых щелочах в течение нескольких месяцев, так как замораживание и размораживание не рекомендуется. Используя этот стоковый раствор AF, приготовьте разведение 250 мкг/мл в буфере TC.
   2. Приготовьте разведение 10 мкМ с использованием 5 мМ стокового раствора (SY) Syto 9, предоставленного производителем, в буфере TC. Храните оставшийся исходный раствор SY при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев.
   3. Приготовьте 10-кратное разведение с использованием 5 000-кратного стокового раствора Sypro Red (SR), предоставленного производителем, в стерильной сверхчистой воде. Храните оставшийся исходный раствор SR при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев.
2. Промойте все биопленки 2 раза с буфером TC (2,5 мл/лунка) вращающими движениями руки, позволяя второму смыванию оставаться в тарелке в течение 30 минут при комнатной температуре. Придыхательный.
3. Нанесите каплю 50 мкл красителя AF на каждый образец биопленки. Пятить 30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света месте. Мойте 2 раза с буфером TC (2,5 мл/лунка), аспирируя после каждого мытья.
4. Затем нанесите каплю 50 мкл красителя SY на каждый образец биопленки. Пятить 30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света месте. Умывайтесь 2 раза стерильной сверхчистой водой (2,5 мл/лунка), аспирируя после каждого мытья
5. Наконец, нанесите каплю 50 мкл красителя SR на каждый образец биопленки. Пятить 30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света месте. Умойтесь 3 раза стерильной сверхчистой водой (2,5 мл/лунка), аспирируя после каждого мытья.
6. Переложите образцы в 6-луночный планшет, поместив по одному образцу в лунку в 6 мл стерильной сверхчистой воды для облегчения конфокальной микроскопии.

6. Визуализация с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

1. Получить изображения каждого компонента (окрашивания) в биопленках группы лечения и контрольной группы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с настройками, показанными в таблице 1. В данном исследовании использовалась объектив с 63-кратным наклоном и числовой апертурой 0,9 мм и рабочим расстоянием 2,2 мм.
   
   Таблица 1. Настройки конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

2. Установите размер сканирования на 250 μм x 250 μм и минимальное разрешение в пикселях 512 x 512, чтобы получить изображения CLSM с разрешением, достаточным для количественного анализа.
3. Используйте окрашивание SY для установки верхней и нижней точек стопки изображений биопленки, затем установите z-шаг так, чтобы он был достаточным для количественного анализа (0,6 мкм для этого исследования). Перед сбором скана оптимизируйте параметры изображения и пятна (т. е. напряжение и смещение ФЭУ) с помощью опции QLUT. Для присвоения псевдоцветов каждому пятну (зеленый для SY, красный для SR и синий для AF) использовалась таблица поиска цвета, чтобы сделать каждый компонент биопленки более различимым в 3D-реконструкции.
4. Собирайте изображения CLSM с частотой 400 Гц с помощью последовательного сканирования в режиме «между стеками» для оптимизации захвата изображений нескольких пятен в пределах одной биопленки.

7. Структурный анализ биопленки

1. Анализируйте изображения CLSM, собранные с помощью программного обеспечения для анализа изображений биопленок. Следующие шаги описывают использование программного обеспечения^{ISA3D 12} для расчета структурных параметров собранных изображений биопленки.
   1. Скопируйте файлы изображений CLSM для каждой биопленки в папку «Изображения», как указано в руководстве к программе. Убедитесь, что соглашение об именовании файлов CLSM, требуемое программным обеспечением, соблюдено. Программное обеспечение позволяет анализировать файлы в подпапках в пакетном режиме, тем самым облегчая анализ биопленок лечебной и контрольной группы за один прогон.
   2. Введите размеры изображений CLSM по осям x, y и z в полях dxy и dz главного диалогового окна. Выберите настройки картографирования пороговых значений и расстояний, как описано в руководстве к программному обеспечению (для этого исследования использовались Otsu и Quasi-Evclidean соответственно). Введите подходящее имя для файла результатов, а затем запустите программу. Файл результатов будет создан в папке ISA.
   3. Просмотрите файл результатов, чтобы получить значения для двадцати 3D структурных параметров¹², таких как биообъем и средняя толщина биопленки (измеренные в этом исследовании), которые количественно определяют 3D распределение каждого компонента (красителя) внутри биопленки.

8. Визуализация структуры биопленки

1. Создайте реконструкцию наложенных компонентов (пятен) внутри каждой биопленки с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Следующие шаги описывают использование программного обеспечения Volocity для создания 3D-реконструкций.
   1. Создайте библиотеку для каждой биопленки, скопировав файлы изображений CLSM в программное обеспечение, как описано в руководстве.
   2. Используйте пункт меню 3D Renderer для создания реконструированного 3D-изображения из CLSM-изображений каждой биопленки (для этого исследования использовался формат HR Opacity).
   3. Поверните 3D-изображение, чтобы сориентировать все биопленки аналогичным образом относительно осей x, y и z. Сделайте снимок правильно ориентированной реконструкции биопленки, а затем экспортируйте снимок в TIFF, JPEG или другой подходящий формат.
2. Провести визуальный анализ параллельного распределения ЭПС, белков и компонентов нуклеиновых кислот в биопленках на реконструированных изображениях.
3. Используйте коэффициент корреляции Пирсона и коэффициент перекрытия Мандерса для выполнения анализа колокализации нескольких компонентов биопленки (в этом исследовании колокализация не измерялась).

9. Статистический анализ

1. Используйте отдельные статистические анализы смешанных моделей для сравнения средних значений структурных параметров между группами ополаскивателя для полости рта и контрольной группой (α=0,05). Для проведения данного исследования для проведения статистического анализа использовалось программное обеспечение SAS.

Results

Репрезентативные результаты для контрольной группы лечения (ополаскиватели для полости рта) и необработанной контрольной группы показаны в таблице 2, а также на рисунках 1 и 2. В таблице 2 приведены средние значения и значения стандартного отклонения структурных параметров биопленки: биообъема (^мкм3) и средней толщины биопленки (мкм), рассчитанных с помощью программного обеспечения ISA3D. Структурные параметры биопленок, обработанных жидкостью для полоскания рта, которые достоверно отличались от таковых у биопленок контрольной группы (p<0,05), выделены красным цветом и значениями стандартного отклонения. Результаты статистического анализа смешанных моделей показали, что ополаскиватель для полости рта BIO продуцировал структуры биопленки, которые значительно отличались от контрольной (p<0,05) на обоих композитах смол, в то время как ополаскиватель для полости рта LTO не давал существенных различий (p>0,05) ни на одном из композитов смол. Результаты ясно показывают, что клеточные и внеклеточные компоненты биопленки, оставшиеся после двух процедур полоскания рта, различались. Следует также отметить, что биопленки S. mutans, выращенные на двух субстратах (PF и TP), различались по 3D-структуре, несмотря на то, что они были выращены в схожих условиях и оба субстрата были отполированы одинаковыми абразивами.

Одновременное распределение EPS, белков и нуклеиновых кислот в биопленках может быть визуализировано с помощью 3D-реконструкций, созданных с помощью программного обеспечения Volocity. На рисунках 1 и 2 представлены репрезентативные реконструкции биопленок контрольной группы, выращенных на композитах смол PF и TP соответственно. Синее пятно представляет EPS в биопленках S. mutans, зеленое пятно демонстрирует нуклеиновые кислоты, а красное пятно показывает белки. Промежуточное пространство может быть занято водой или другими нефлуоресцентно меченными компонентами биопленок.

Рисунок 1. Репрезентативная 3D реконструкция биопленки S. mutans, выращенной на композите смолы PF в контрольной группе (не получала жидкость для полоскания рта). Одновременное наложение трех красителей на одну биопленку позволяет одновременно визуализировать компоненты EPS (синее окрашивание), нуклеиновую кислоту (зеленое окрашивание) и белок (красное окрашивание) в биопленках S. mutans. (1 единица = 24 мкм). Нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную цифру.

Рисунок 2. Репрезентативная 3D реконструкция биопленки S. mutans, выращенной на композите смолы TP в контрольной группе (не получала жидкость для полоскания рта). Одновременное наложение трех красителей на одну биопленку позволяет одновременно визуализировать компоненты EPS (синее окрашивание), нуклеиновую кислоту (зеленое окрашивание) и белок (красное окрашивание) в биопленках S. mutans. (1 единица = 24 мкм). Нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную цифру.

Композитная смола		Пункт 4		TPH3
Ополаскиватель для рта	компонент	БВ (мкм3)	MT (μм)	БВ (мкм3)	MT (μм)
Biotène PBF	Нуклеиновые кислоты	279 517±53 291	9.32±2.80	195 033±42 014	7.45±3.70
	Пенополистирол	344 902± 56 386	35.22±17.19	197 840± 62 351	9.83±7.26
	Белки	298 796± 62 868	54.21±21.65	216 033±66 654	24.33±39.64
Листерин Тотальный уход	Нуклеиновые кислоты	355 707±110 444	26.45±14.21	273 296±47 323	13.43±2.89
	Пенополистирол	494 099±180 592	64,90± 26,68	329 150±47 145	34.35±30.32
	Белки	348 416± 161 316	58.68±47.28	303 150±54 705	34.18±41.46
Контроль (необработанный)	Нуклеиновые кислоты	388,375±42,152	51.15±40.66	327 809±39 400	17.08±1.65
	Пенополистирол	660 448± 173 197	91.37±74.84	363 850± 67 612	28.33± 15.07
	Белки	517 274±119 475	127.96±73.84	353 161±56 518	21.17±4.41

Таблица 2. Средние значения и значения стандартного отклонения биообъема (BV) и средней толщины биопленки (MT) биопленок, обработанных BIO или LTO, или оставленных необработанными (контрольная группа). Структурные параметры биопленок, обработанных ополаскивателями для полости рта, которые достоверно отличались от таковых у биопленок контрольной группы (p<0,05), выделены красным цветом и значениями стандартного отклонения.

Discussion

Получение CLSM-изображений должно быть выполнено таким образом и в таком формате, которые необходимы для количественной оценки биопленок и для колокализационного анализа, таким образом, чтобы распределение интенсивности сигнала в каждом изображении было надежным отражением распределения каждого флуорохрома в стеке биопленки. Интенсивность сигнала должна быть различимой от шума и фона^10,11, не подверженной влиянию автофлуоресценции от подложки и имеющей минимальные просачивания из-за спектральной интерференции между используемыми флуорохромами¹¹. Шум является неизбежным ограничением флуоресцентной микроскопии¹¹, и качество изображения иногда может быть ограничено по техническим или логистическим причинам. Идентификация флуорохромов с минимальным спектральным перекрытием имеет решающее значение для успеха этого метода, но может быть сложной. Кроме того, количественное определение множественных флуорохромов представляет собой многофакторную проблему. Поэтому неудивительно, что очень немногие исследования успешно количественно оценили одновременное распределение более двух компонентов в структурах биопленок.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы представить методологию, состоящую из отдельных, но взаимосвязанных этапов количественной оценки и сравнения параллельных трехмерных распределений трех клеточных и внеклеточных компонентов в биопленках. Описанный анализ роста биопленки позволяет выращивать биопленку на соответствующих субстратах и создает воспроизводимые биопленочные структуры, как показано в результатах, приведенных в таблице 1. Сочетание нового одновременного окрашивания ЭПС, белков и компонентов нуклеиновых кислот с измерением структурных параметров биопленки в 3D приводит к количественно измеримому распределению компонентов в биопленках. Качественный визуальный анализ параллельного распределения ЭПС, белков и нуклеиновых кислот в биопленках возможен путем реконструкции наложенных на нее пятен внутри каждой биопленки. Программное обеспечение ISA3D¹² содержит несколько уникальных структурных параметров, таких как фрактальная размерность, однородность и коэффициент шероховатости биопленки, в дополнение к традиционно измеряемым параметрам, таким как пористость и толщина биопленки, для улучшения количественного определения трехмерных структур биопленок. Статистический анализ структурных параметров биопленки облегчает релевантное сравнение биопленок в конкретных экспериментальных условиях, таких как антибактериальная/противообрастающая эффективность (например, после обработки ополаскивателями для полости рта) или во времени (временные эффекты).

Эта методология эффективно и успешно количественно оценила и сравнила параллельные 3D-распределения трех основных компонентов биопленок S. mutans , которые были выращены на соответствующих субстратах, тем самым преодолев две проблемы одновременной оценки компонентов биопленки. Этот метод также может быть использован для определения эффективности антибактериальных процедур или противообрастающих мер в отношении нескольких компонентов биопленки, как показано с использованием ополаскивателей для полости рта в этом исследовании. Кроме того, большинство описанных выше протоколов могут быть заменены протоколами по изготовлению соответствующих субстратов и анализам роста биопленки соответствующих микроорганизмов. Таким образом, этот метод имеет широкое применение, поскольку он облегчает сравнение 3D-структур/архитектуры биопленок in vitro и in vivo в различных дисциплинах, включая медицину, стоматологию, геологию и морские науки.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Bacto Todd Hewitt Broth	Becton, Dickinson and Company	249240
Дрожжевой экстракт, гранулированный	EMD Millipore	1.03753.0500
Bacto Tryptone	Becton, Dickinson and Company	211705
OmniPur Sucrose	EMD Millipore	8510
Хлорид калия, реагент ACS, 99,0-100,5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
Фосфат калия, одноосновный, ≥ 99,0%, реагент ACS	Sigma-Aldrich	P0662-500G
Хлорид натрия	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Фосфат натрия, моноосновный, моногидрат	EMD Millipore	SX0710-1
Трис(гидроксиметил)аминометан, 99,8+%, реагент ACS	Sigma-Aldrich	252859-500G
А, Alexa Fluor 647 Конъюгат	Инвитроген	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 или S6653
Biotè Ополаскиватель для полости рта PBF	GlaxoSmithKline	N/A
Listerine Total Care	McNeil-PPC, Inc.	Н/Д