Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Жизнеспособность Анализы на клетки в культуре

46.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50645

⸱

20 января 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

В этой статье

Краткое содержание

Терапевтические соединения часто впервые рассмотрен в пробирке с жизнеспособностью анализов. Слепые количество клеток по человека-наблюдателя может быть очень чувствительны к небольшим изменениям количества клеток, но не оценить функцию. Компьютеризированная жизнеспособности анализы, как описано здесь, может оценить как структуру и функцию на объективной основе.

Аннотация

Руководство количества клеток на микроскоп являются чувствительными средством оценки жизнеспособности клеток, но требуют больших затрат времени и, следовательно, дорогой. Компьютеризированная жизнеспособности анализы стоят дорого с точки зрения оборудования, но может быть быстрее и объективнее, чем рассчитывает ручных клеток. В настоящем докладе описывается использование трех таких жизнеспособности анализов. Два из этих анализов инфракрасные и один люминесцентный. Оба инфракрасных анализы полагаться на 16 бит Odyssey Imager. Один инфракрасный анализ использует DRAQ5 пятно для ядер в сочетании с Sapphire пятно для цитозоле и визуализируется в 700 нм канала. Другой инфракрасный анализ, В-Cell Западная, использует антитела против белков цитоскелета (α-тубулина или микротрубочек связаны белка 2) и помечает их в 800 нм канала. Третий жизнеспособность анализ является широко используемым люминесцентные тест для АТФ, но мы используем четверть рекомендованной объема, чтобы сэкономить на стоимости. Эти измерения всех линейных и коррелирует с количеством сеLLS покрытием, но различаются по чувствительности. Все три анализы обойти много времени микроскопии и попробовать весь колодец, тем самым снижая ошибки выборки. Наконец, все анализы легко может быть завершена в течение одного дня в конце эксперимента, что большее количество экспериментов, чтобы быть произведены в короткие сроки. Однако все они опираются на предположение, что число клеток остаются пропорционально уровень сигнала после лечения, в предположении, что иногда не встречал, особенно для сотовой АТФ. Кроме того, если клетки увеличиваются или уменьшаются в размерах после лечения, это может повлиять на уровень сигнала, не влияя количества клеток. Мы пришли к выводу, что все жизнеспособности анализы, в том числе ручных подсчетов, страдают от ряда оговорок, но что компьютеризированные жизнеспособности анализы хорошо стоят первоначальные инвестиции. Используя все три анализы вместе дает полное представление о клеточной структуры и функции.

Введение

Наиболее распространенным жизнеспособность анализа в области биологических наук включает количество клеток. Об этом свидетельствует анализ лучших (самых последних) 200 публикаций, появившихся в PubMed с любым из ключевых слов "в пробирке" или "культура" на 4/29/2013 и 4/30/2013. Из этих публикаций, 23,5% использовали кол клеток анализы, в том числе ручных подсчетов количества клеток, автоматизированная количество клеток рассчитывает с ПО для обработки изображений, и трипанового синего. Live / Dead анализ использовали в размере 1% от этих публикаций. Число публикаций с использованием МТТ (3 - (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) Анализ метаболического жизнеспособности составил 11%. Этот обзор литературы показывает также, что число публикаций с использованием анализов, таких как МТТ в сочетании с подсчета клеток анализов было только 3,5%. Несмотря тенденция использовать один жизнеспособность анализа само по себе, оценки клеточной функции в сочетании с числа клеток кажется самый лучший выбор для оценки клеточного Integrity. Количество клеток сами по себе не являются достаточными, поскольку остальные клетки не могут быть функциональными или здоровыми, даже если они присутствуют в скважине 1,2. С другой стороны, функциональные меры, такие как АТФ может увеличиваться или уменьшаться в отсутствие параллельных изменений в количестве клеток. Разобщение метаболических показаний от числа клеток показывает, что АТФ и MTT анализы никогда не должны использоваться в качестве единственного жизнеспособности анализа. В настоящем докладе, три жизнеспособности анализы, что опрос как клеточные структуры и функции обмена веществ описаны, более полное представление о сотовой целостности, чем любой одном анализе сам по себе может позволить.

Двое из наших анализов требуют тепловизорный который измеряет флуоресценцию в нм каналов 700 и 800. Шум является низким в инфракрасном диапазоне, что приводит к более высоким коэффициентом 3 сигнал-шум. Одиссея тепловизор, который мы используем имеет 4,5 журнала динамический диапазон и битовую глубину от 16 translatinг до 2 16 или 65536 оттенков ИК-порт. Это можно сравнить с 8-битного цвета изображений, которые только получают 2 8 или 256 оттенков цвета для каждой длины волны. Таким образом, 16-битный изображений имеет более высокое разрешение. Следует отметить, что исходные инфракрасных изображений, часто псевдоцветной зеленый (800 нм) и красный (700 нм) в опубликованных отчетах для представления. Odyssey тепловизоры обычно используются как для вестерн-блоттинга и В-клеточной вестернов 4-7. В Cell вестерны на формальдегида фиксированной клеток использовать первичных антител против любого интересующего белка и маркировать их, в свою очередь с помощью инфракрасных флуоресцентных вторичными антителами. Этот метод известен быть особенно полезно для фосфорилирования конечными точками 6. В нашем В-клеточной вестернах, мы пятно фиксированных клеток для белков цитоскелета α-тубулина или нейронов микротрубочек связанных белков 2 (MAP2) в 800 нм канала. Эти белки являются достаточно обильные, получая высокие отношения сигнал-шум. Мы также окрасить наши тарелки в 700нм канал для ядер с DRAQ5 пятно и для цитоплазмы с Sapphire пятно. Оба белков цитоскелета и DRAQ5 + Sapphire пятна, таким образом, отражают клеточные структуры.

Третий жизнеспособность анализе измеряют функцию обмена веществ и называется "Сотовый Титр Glo.« В этом люциферазы основе анализа, значения люминесценции находятся в прямой пропорции к уровня АТФ. ATP анализы обычно используются для количественной оценки жизнеспособных клеток 8-12. Тем не менее, в том числе слово "титр" во имя анализа является чем-то неправильным, потому что выход АТФ на клетку можете изменить в зависимости от токсина лечения и, следовательно, не всегда пропорционально клеток номер 8. Уровни АТФ также может зависеть от циркадных ритмов 13 и клеточного деления 14 и дифференцировки клеток 15. Тем не менее, анализ ATP, показанный здесь, прост в исполнении и полезно, потому что АТФ является надежной мерой метаболическойЖизнеспособность 16-21, если не сотового телефона по себе. Использование этого теста в дополнение к ИК в ячейке вестерны поэтому дает более полную картину клеточной целостности, чем только какой-либо одной анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Схема протоколов проиллюстрировано на Рисунке 1.

1. Сотовый Покрытие

Пластина клеток в 96-луночных планшетах при различных плотностях гальванических (рис. 2). Для проверки линейности на N2A клеточной линии нейробластомы, плиты 2.5K, 5к, 10к, и 15k клеток на лунку в 3 или 6 скважин / группы. Для проверки линейности в крысиных первичных корковых нейронов, листовым 25k, 50k, 100k, и 200k клеток на лунку в 3 или 6 скважин / группы. Если клеточные линии или первичные элементы интересных выглядят здоровыми при различных плотностях покрытия, плиты на и вокруг оптимальной плотности клеток для этого типа клеток.

Примечание: В настоящем исследовании, N2A клетки высевают в 100 мкл СМИ и первичных корковых нейронов в 200 мкл среды на пластинах, которые предназначены для нижней испарения. Для получения подробной информации об обработке клеток, СМИ, сывороток, антибиотиков, и токсинного лечения см. Unnithan соавт. для N2A челLs 8 и Posimo др.. для первичных культур коры 22.

    1. Повторите покрытие на второй 96-луночного планшета. Одна пластина будет анализировали на АТФ (фиг.2А), а другой с ИК анализами (фиг. 2B). Никто не может использовать ту же самую тарелку для АТФ и инфракрасных анализов, потому что клетки должны быть лизируют открыта для внутриклеточных АТФ измерений.
    2. Будьте уверены, к пластине, по крайней мере 3 дополнительных скважин для вычитания фона в инфракрасных анализов на оптимальной плотности покрытия (колонка 2; Рисунок 2B).
  2. Добавить средствах массовой информации без клеток или, более недорого стерильную воду к наружным скважин в строках А и Н и в колонках 1 и 12. Избегайте опираясь на данные из скважин по краям, как жизнеспособность зачастую ниже, здесь от последствий СМИ испарения и температурных градиентов. Такие проблемы с микропланшетов обычно называют краевые эффекты 23,24. Не держите эти скважины пустпотому что тогда ряды B и G и столбцы 2 и 11 страдают от краевого эффекта.
    Краевые эффекты могут быть уменьшены путем инкубации с недавно посеянных пластины при комнатной температуре в условиях окружающей среды до переноса в CO 2-инкубаторе 24. Кроме того, недавнее исследование Carralot описывает математический метод коррекции для микротитрационных планшетах с использованием одного столбца 23 управления. Оливер и его коллеги использовали специально разработанный принудительного воздушного микропланшет инкубатор для снижения температурных градиентов 25. Если край эффект вызывают серьезную озабоченность, камеры стабильность микропланшет (например BT & C Объединенные) можно приобрести, чтобы создать однородную микросреду с высокой влажностью и даже температурных градиентов.
  3. Если больше скважин, чем показано на рисунке 1 необходимы, потому что дополнительные разведения реагентов или больше плотности обшивки будут проверены, использовать краевые скважин для вычитания фона.
  4. Подождите одну ночь для прикрепленияклеток и анализа на следующее утро, как описано ниже.

2. Люминесцентные АТФ Анализ

  1. Следуйте рекомендациям сотового Титр Glo производителя по восстановления подложки с буфером и для времени инкубации.
    1. Удалить 50 или 150 мкл носители из 100 или 200 мкл обшивки СМИ, соответственно. Чуть менее 50 мкл останется позади в скважине. Добавить 25 мкл реагентов (субстратов плюс буфер) в столбцы 2-6 (рис. 2А) в разведении 1:02.
      Примечание: Различные объемы средств массовой информации, оставленных после удаления может разбавить или сконцентрировать АТФ реагентов для анализа дифференциально через скважин. Следите за тем, что уровень жидкости во всех многоканальных пипеток эквивалентно. Измерьте оставшуюся жидкость выберите скважин по всей пластине с помощью пипетки непосредственно перед добавлением АТФ реагентов для анализа, чтобы обеспечить точность. Если высокая изменчивость существует с дифференциальных ставок СМИ evaporAtion по всей поверхности пластины, удалить все старые носители и добавить такой же объем свежей средой или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в каждую лунку непосредственно перед добавлением АТФ анализа реагентов. Если пластины страдают от переменных уровней испарения, попробуйте переключиться на низких испарения плит из Costar Corning. В последних пластинок, 60-интерьера скважины показано на рисунке 2 страдают только от среднего 0,995% ± 0,41 медиа испарения в течение ночи. Существует, таким образом, вариабельность незначительным объемом средств массовой информации во время анализа.
    2. В колонках с 7 по 11, строки B через D, удалить достаточно средств массовой информации, чтобы покинуть 50 мкл позади, как описано выше, и добавить 50 мкл реагентов в разведении 1:1.
    3. В колонках с 7 по 11, строки E через G, оставьте клетки в 100 мкл среды и добавить 100 мкл реагентов, опять же в разведении 1:1. Компания рекомендует 100 мкл реагентов должны быть разбавлены 1:01 в 100 мкл среды.
      Примечание: Для того,сэкономить на стоимости, можно сократить эти рекомендации как по объему и в разведении. Тем не менее, прежде чем делать это, убедитесь, что он не уменьшает линейность и чувствительность анализа.
    4. После того, как один конкретный объем и коэффициент разбавления из реагентов признано удовлетворительным, придерживаться их во всех последующих экспериментах. Критерии удовлетворительных данных описаны в разделе результатов.
    5. Неиспользованные восстановленные реагенты могут быть замораживать и использовать на более поздний срок, чтобы сэкономить на стоимости. По заявлению производителя, восстановленные реагенты могут храниться при температуре -20 ° С в течение 21 недель с ~ 3% потери активности.
  2. Место пластины на орбитальном шейкере в течение 2 мин или нутационное шейкере в течение 10 мин. Если часть пластины в настоящее время анализируют на другом измерении, и это не может быть поколеблено, агитировать СМИ с простой до-и-вниз пипетки только в лунки интерес. Однако чрезмерное пузырьки, генерируемые во время этого этапа будет мешать люминесценцииВыход nescent.
    1. 10 мин после добавления реагентов, передача 60 мкл содержимого также в белые 96-луночные планшеты. Значения люминесценции выше в белых пластин, чем в ясных или черных пластин, потому что они отражают свет вверх по направлению к детектору.
      Примечание: По нашему опыту, клетки выживают лучше на низкой испаряемости, четкие CoStar пластины по сравнению с другими пластинами. Эти конкретные пластины не продаются с белыми стенами. Во-вторых, непрозрачные стенки и ясные дном тарелки стоят дороже, чем полностью прозрачных пластин. Если передает люминесцентный жидкости в белых пластин, белые тарелки можно мыть и повторно использовать, экономя на стоимости с использованием новых белых пластин для каждого эксперимента. Передача жидкости, таким образом, более дешевый вариант в долгосрочной перспективе.
    2. Поп пузырьки воздуха до чтения пластину с иглой или, предпочтительно, с принудительным воздушным из пластиковой пипетки передачи лампочки. Читайте пластину на люминометре с 1 сек времени в интеграции (компания recommeNDS 0,25-1 сек время как достаточно интеграция). Читайте пластины 10-12 мин после добавления АТФ реагентов для анализа. Ремень имеет решающее значение для сравнения через различные тарелки, потому что сигнал люминесцентный является временным с высокой скоростью распада, как показано на Гилберта и коллегами 26.
  3. Среднее значение на основании значения люминесцентные из 3 или 6 скважин в каждой группе и участка в зависимости от числа клеток в диаграмме рассеяния (см. Рисунок 3). Впервые вычесть средние фонового свечения значения соответствующих пустых скважин (колодцев 2B - 2G, колодцы 11B - 11D и скважин 11E - 11G) от каждой соответствующей точки данных. Там будет три разные группы для каждой плотности покрытия в этот начальный эксперимент (рис. 2А). Уровни АТФ может быть линейно коррелирует с плотностью клеток в одной или всех этих групп. Продолжайте наибольшего разведения реагентов, которые до сих пор дает удовлетворительные результаты, чтобы сэкономить на стоимости. Критерии удовлетворительные результаты описаны ян секция Результаты.
    Примечание: С массовой информации, используемых в настоящем исследовании, фоновые значения с данного анализа не являются высокими, и это можно пропустить пустые скважины. Однако производитель сообщает Promega различий в люминесценции с различной культуральной среде. Настоящее исследование использует Hyclone плода Clone III, синтетический вариант эмбриональной телячьей сыворотки для N2A клеток и телячьей сыворотки для первичных корковых культур. По заявлению производителя, телячьей сыворотки уменьшается значения люминесценции, но не уменьшается чувствительность анализа. Тем не менее, если это серьезное беспокойство, разбавленные АТФ реагентов для анализа в PBS вместо массовой информации во время анализа.
    1. Если клетки появляются расти неравномерно по столбцам ночь, попробуйте анализируя их в 6 часов посева. Тем не менее, иметь в виду, что плотность в обычное время анализа (например, 24 ч после обработки) является плотность, при которой линейность должна быть достигнута.

3. Infrareг Анализы

  1. На следующее утро после обшивки, фиксации клеток в второй пластины при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Обязательно носите перчатки для этого шага и распоряжаться фиксатора как химические отходы, потому что формальдегид является канцерогеном. Добавить 4% формальдегида и 4% сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере с существующей информации в разведении 1:1. Средства массовой информации также могут быть смыты с PBS до фиксации в полной силы фиксатором. Либо техника хорошо работает.
    1. Выдержите в фиксатора в течение 20 мин, затем снимите фиксатор и промыть 3 раза в 200 мкл PBS.
  2. Хранить пластину в PBS с 0,2% азида натрия при 4 ° С, если анализ не будет иметь место в тот же день. В противном случае, приступить к анализа и поместить клетки в блокировании решения, чтобы минимизировать неспецифическое связывание антител.
    1. Развести рыбы сыворотки Odyssey блок 1:01 в PBS и добавить 0,3% Triton-X 100 как сотовый permeabilizer. Оставьте достаточно блокирующего раствора, а также начального и среднего Antiboду так, что решения 35 мкл может быть пипеткой в ​​каждую лунку. Тем не менее, если много пузырьков наблюдаются при пипетировании, сделать> 50 мкл для каждой лунки, в противном случае пузырьки доходят в клетки и блок антител из переплета. Чрезмерное мыльные пузыри появится как незапятнанной круглого пятна в середине колодца. Попробуйте настроить пипетирование если это произойдет.
    2. Инкубировать в этом блокирующем растворе в течение 30-60 мин при комнатной температуре.
      Примечание: 5% бычий сывороточный альбумин или нормальный сыворотки из того же вида, что и вторичного антитела также могут быть использованы как блокирование решения, чтобы сэкономить на стоимости блока рыбы в сыворотке крови. Блокирование решения может повлиять на производительность антитела. Таким образом, оптимальный блок для каждого антитела лучше определить эмпирически.
      Примечание: Некоторые исследователи разместить в ячейке западных пластинок на шейкеры во инкубации. Тем не менее, это не является необходимым.
  3. Сделать первичные антитела: 1:10000 разбавления для анти-α-тубулина(Мышиное моноклональное, таблица 1) и 1:2000 разбавление для анти-map2 (мышиного моноклонального, таблица 1). Эти антитела специфичны к белкам, представляющих интерес в этих клеточных моделей; специфичность имеет важное значение для любого иммуноцитохимического пятна.
    Примечание: MAP2 является маркером нейронов и подходит для смешанных нейронных / глиальных культур. Послеродовом культуры, показанные здесь, также содержат некоторые глии (~ 25%), потому что астроциты появится сначала на эмбриональный день 18, с их число пика в раннем неонатальном периоде 27,28. Один не может отличить астроцитов и нейронов в АТФ и DRAQ5 + Sapphire анализов. Для того чтобы измерить нейроны и астроциты отдельно, использовать одновременно MAP2 и окрашивание GFAP в нм каналов 800 и 700, как описано Mullett и коллегами 4,29, оставляя DRAQ5 + Sapphire. Однако, если все клетки в культуре хотите быть оценены, использовать пан-клеточный маркер, такой как α-тубулина, β-актина, или GAPDH.
    Примечание: Эти разведения были оптимизированы для N2A и первичных корковых клеток и, возможно, не обобщаются на каждой модели. Поэтому постарайтесь по крайней мере два разведения первичных антител, один на левой половине пластины и один на правой половине (см. рисунок 2b). Кроме того, попробуйте 3-4 разведения первичных антител на 3 лунок каждый. Например, рекомендуемые концентрации на вкладыше антитело листа может быть замкнут с двукратных изменений. Другими словами, если рекомендуемые концентрации для иммуноцитохимии 1:500, также пытаются 1:250 и 1:1000 факторы разбавления.
    1. Развести антител в 1:01 Odyssey блока: PBS и добавить 0,3% Triton-X. Чтобы сэкономить на стоимости, попытайтесь получения антител в блокирующем растворе, который был применен к клеткам в шаге 3.2.1 удалением это решение в конце инкубации. Держите клеток в PBS, делая это, они не должны высыхать.
    2. Инкубировать в первичных антител или 1-2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Для слабо бinding антител и белков, которые не в изобилии, овернайт инкубации может помочь увеличить сигнал.
      Примечание: Оставьте не менее 3 скважин в блокировании решения для вычитания фона при каждой концентрации вторичного антитела (скважины 2B-2D и скважин 2E-2G на рисунке 2B). Не подвергайте эти скважины к любому первичного антитела бы то ни было. Они показывают степень неспецифического связывания по вторичным антителом и полезны для расчетов сигнал-шум. Если есть опасения, что вторичные антитела приведет к высоким уровням неспецифическое связывание, также включают в себя контрольные лунки, которые не подвергаются либо первичной или вторичной антитела, но получают одинаковое количество стирок. Разница между этими скважин и "вторичный" скважин только покажет степень неспецифического связывания, вызванного вторичного антитела в покое. В нашем тесте на мыши N2A клеток, интенсивность с антимышиным вторичным антителом сигнализировать один был 0,557 ± 0,032, сигнал с антикроличьеодин вторичное антитело было 0,533 ± 0,041, сигнал без вторичного антитела 0,357 ± 0,003, а сигнал с первичными и вторичными антителами был 11,867 ± 0,911. Таким образом, мы не наблюдали высокий уровень неспецифического связывания даже при использовании анти-мышиные вторичные антитела на клетках мыши. Есть несколько производителя инфракрасных вторичными антителами, мы рекомендуем только покупать высоко перекрестно-адсорбированные из них. Следует отметить, что концентрация вторичных антител IgG может варьироваться в зависимости от источника.
  4. Смыть первичных антител с 3 стирок 200 мкл PBS на лунку, 10 минут каждый. Первичные антитела могут быть сохранены при 4 ° С в течение нескольких недель в 0,2% азида натрия и повторно до тех пор, крошечные пятнышки мусора не становятся очевидными, когда решения проходят вверх к свету. Это делается только, чтобы сэкономить на стоимости. Если стоимость не является проблемой, что приготовить антител для каждого использования.
  5. Развести вторичного антитела с 1:1000 или 1:2000 в 1:01 Odyssey блока: PBS с 0,3% Triт-X (рис. 2В). Добавить разбавление 1:1000 в верхней половине пластины и 1:2000 в нижней части пластины. Эти концентрации могут быть дополнительно снижены, чтобы сэкономить на стоимости, но проверить на линейность до совершения этого.
    Примечание: Не забудьте добавить соответствующее решение вторичного антитела к вычитание фона скважин (столбец 2 на рисунке 2B).
    1. Если второй белок будет анализировали на месте DRAQ5 + сапфир, этикетка клеток для α-тубулина или МАР2 с 700 нм козы против мышиного IgG и второго белка в 800 нм канала с первичными антителами от других, чем мыши видов. Нм канал 800 имеет меньше фона, чем 700 нм канала и должны быть зарезервированы для наиболее важных белка.
    2. Инкубировать в вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре в ящике от света.
  6. Смыть вторичные антитела с 3 стирок 200 мкл PBS на лунку, 10 минут каждый.
  7. Сделать решения DRAQ5 + Sapphire. Для левой половине пластинки, разбавленные DRAQ5 1:10000 (0,5 мкМ конечная концентрация) и Sapphire 1:1000 в PBS с 0,3% Triton-X (столбцы 3 - 6; фиг.2В). Для правой половине пластинки, разбавленные DRAQ5 1:20000 (0,25 мкм) и Sapphire 1:2000 (колонки 7 - 10; фиг.2В).
    Примечание: DRAQ5 используется для продажи на складе 1 мм вместо запаса 5 мм. Некоторые ранее опубликованные отчеты поэтому используется 1:4000 или 1:2000 разведения DRAQ5 8.
    1. Чтобы сэкономить на стоимости, если две пластины, подвергаемые исследованию, одновременно, то же самое DRAQ5 + Sapphire растворы могут быть использованы на двух пластинах в последовательности, пипетки это от первой пластины и добавлением его в секунду. Если же растворы будут использоваться дважды таким образом, использовать их в течение одного дня. Решения Разводненная DRAQ5 + Sapphire не могут быть сохранены при 4 ° С или замороженными для последующего использования.
    2. Выдержите в этих растворах в течение 30 мин при комнатной температуре вдали ером свет. Если времени мало, и DRAQ5 + решения Sapphire не будет повторно использовать на других плит с различными вторичными, добавить эти пятна к решениям вторичных антител в шаге 3.5 и инкубировать в течение 1 часа.
      Примечание: Не добавляйте DRAQ5 + решение Sapphire на вычитание фона скважин (столбец 2 на рисунке 2B), как эти скважины не должны быть окрашены в 700 нм канала.
  8. Промыть пластины 3 раза с 200 мкл PBS на лунку в течение 10 мин каждый. Поместите 0,2% азида натрия в конечной промывки PBS, если пластина будет окрашивали с другими видимого диапазона вторичных антител после инфракрасной техники будет завершена.
  9. Сканирование пластину на Odyssey Imager. Начните с просмотре пластинок при интенсивности 5 и разрешением 169 мм. Либо "среднего качества" или настройки "низкого качества" являются достаточными. Компания не выпускает подробную информацию фильтра возбуждения / эмиссии. Тем не менее, фильтры выбросов примерно на 20 нм в ширину и сосредоточены вокруг 720 и 820 нм, по данным производителя.
    Примечание: Можно сканировать листы в то время как все еще влажный, как следователи возможно, пожелает продолжить, чтобы окрасить их с другими маркерами. Тем не менее, компания предлагает в своем онлайн-протокола, что сухие пластины привести к менее хорошо к-а распространения сигнала. При сканировании их обоих мокрой, а затем сухой, чтобы сравнить данные, не забудьте удалить все PBS из колодца, потому что остальные соли после испарения может привести к высокому фоновой флуоресценции по краям.
    1. Odyssey Imager сканирует до и через нижнюю часть пластины. Плиты из разных производителей может потребовать различных фокус-смещение, потому что дно лунки может варьироваться в их толщины и глубины в пластине. Попытка сканирования на различных смещений фокусировки и посмотреть, где самая высокая отношение сигнал-шум и Самое четкое (наиболее в фокусе) сигнал достигается: 2,5 мм, 3,0 мм, 3,5 мм, 4,0 мм. Попытка также для измерения глубины скважины от нижней части пластины с линейкой, чтобы подтвердить FindinГЦБ на Одиссее. Следует помнить, что пластик в нижней части скважины может добавить дополнительную высоту измерения линейки. В Costar плиты, используемые в данном исследовании, требуют фокус смещение 4,0 мм.
    2. Используйте Western функцию В-клеток в программном обеспечении, чтобы поместить правую размера сетки на изображение пластинки и экспортировать данные в Microsoft Excel. Изучите "интегральной интенсивности" значения одних и тех же скважин в различных фокус-зачетов найти самые высокие значения флуоресценции. В центре внимания смещение, которое дает самый высокий сигнал-шум (сигнал в иммуноокрашиванию скважин против "не первичных негативных управления" скважин) является то, чтобы выбрать в дальнейшем.
    3. После того, как одного из основных направлений смещение принято решение, повторите сканирование с меньшим шагом. Например, если самая яркая сигнал был на уровне 3,5 и 4,0 мм, попробуйте сканировать в 3,6, 3,7, 3,8, и 3,9 мм и посмотреть, есть ли дальнейшее улучшение уровня сигнала. Если фокус смещение не так, интенсивности сигналов через 12 колоннами на пустой плели (когда все столбцы должны иметь равный сигнал) появится в виде U-образной кривой, а не прямой линией. Если так будет продолжаться, чтобы быть проблемы с пластмассовыми пластинами, попробуйте стеклянным дном тарелки.
  10. Вычтите среднем интегральных интенсивностей в фоновом режиме вычитания скважин (рис. 2В; скважин 2B - 2D или скважин 2E - 2G) от каждого соответствующего точке данных в нм каналов 700 и 800. Затем в среднем интегральных интенсивностей сигналов для каждой группы скважин. Участок данные в виде диаграммы рассеяния против плотности клеток (см. рисунок 3).
    1. Сравните результаты двух различных разведений первичных и вторичных антител и результаты двух различных разведений DRAQ5 + Sapphire по урегулированию на одном разбавления каждого для последующих экспериментов. Если линейность не достигается, попробуйте сканировать в другом интенсивности. Повторное сканирование с интенсивностью 3 и 7, а не 5 и повторно проанализировать данные. Если данные улучшения в одном из этих интенсивностей, новсе еще не является удовлетворительным, повторное сканирование с шагом вокруг той интенсивности.
    2. Будьте осторожны, не анализировать изображения, где программное обеспечение показывает белые пятна в лунках; эти пятна означают насыщенный сигнал из диапазона тепловизора. Сканирование по более низкой интенсивности, если это произойдет.
    3. Если линейность не достигается, попробуйте также для фиксации клеток в 6 часов посева, потому что они могли бы расти или умереть неравномерно в разных колонках на ночь. Кроме того, попробуйте разные плотности покрытия, различную интенсивность сканирования, дальнейшие оптимизации реагента факторов разбавления, прозрачным дном тарелки, DRAQ5 сам по себе как ядро ​​только пятно, или других, чем анти-α-тубулина или анти-МАР2 различных антител.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Скорость-ограничивающим фактором в этих экспериментах инфракрасный окрашивание, как анализ АТФ является относительно коротким по продолжительности. Для инфракрасных анализов, мы ожидаем, что восемь 96-луночные планшеты могут быть окрашены и сканируется в течение одного дня по ошеломляющие двух партий четырех пластин каждый (см. рисунок 1). Эта оценка предполагает 20 мин фиксации, 30 мин стирки, 30 мин блокировки, 2 ч инкубации первичного антитела с последующим 30 мин промывок, 1 час инкубации вторичное ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы обнаружили, что уровень сигнала во всех трех анализов жизнеспособности является линейной и коррелирует с плотностью нанесения покрытия. Тем не менее, не все анализы одинаково чувствительны к 2 раза или в 1,5 раза изменений плотности покрытия. Для n2a клеток, инфракрасные анализы менее чувствительны, чем анализа АТФ, особенно при более низких плотностей покрытия. Хотя инфракрасные анализы менее чувствительны, чем АТФ, то DRAQ5 + Sapphire анализы и α-тубулина анализы находятся в хорошем согласии в том, что они раскрыва...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни один из авторов не имеют никаких конфликтов раскрывать.

Благодарности

Мы признаем Juliann Жомотт за идею экономии на объемах реагентов в анализе АТФ. Мы глубоко признательны за превосходным административной поддержки Марии Карузо, Деб Вилсона, и Джеки Фаррер и к Mylan Школа фармации для оказания финансовой поддержки для этих исследований. Мы также выражаем благодарность к Hunkele страшных заболеваний Foundation и Паркинсона и двигательных расстройств Фонд за их финансовую поддержку из первичных нейронов исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клеточный титр GloPromegaG7572Покупайте в количестве 100 мл и аликвоте, вместо покупки более дорогого количества 10 мл. Восстановленные, неиспользованные реагенты могут быть повторно заморожены при -20 °°; C в течение не менее 21 недели
18% формалинThermo-Shandon9990244Покупка этого фиксатора позволяет избежать взвешивания порошков формальдегида и кипячения раствора; воздействие паров тем самым сводится к минимуму
СахарозаSigma-AldrichS0389Не обязательно добавлять его в растворы формальдегида, но он улучшает внешний вид неподвижных элементов
Odyssey BlockLI-COR927-40003Эту рыбную сыворотку можно купить оптом и заморозить при -20°С; C для длительного применения
Triton-X 100Sigma-Aldrich21568Храним стоковый раствор 10% Triton-X 100 в стерильной воде при температуре 4° C
Sodium Phosphate MonobasicFisherS468Также можно купить таблетки PBS или 10x растворы PBS, но они дороже
Sodium Phosphate DibasicFisherS373Смотрите выше
Азид натрия (250x)Ricca Chemical Company7144.8-16Не покупайте порошок, потому что азид натрия очень токсичен. Мы храним все наши использованные антитела в 1x азиде натрия при температуре 4 ° C до тех пор, пока они не будут загрязнены мусором
Мышиный анти-α-тубулинSigma-AldrichT5168Это антитело дорогое, но может быть сильно разбавлено и является высокоспецифичным
Мышиный анти-MAP2Sigma-AldrichM9942Это антитело дорогое, но высокоспецифичное (предпосылка для внутриклеточных вестернов)
800 нм Козий антимышиный IgGLI-COR926-32210Другие компании также продают инфракрасные вторичные антитела. Обязательно приобретайте антитела с высокой степенью перекрестной адсорбции и учтите, что концентрации IgG могут варьироваться в зависимости от источника
DRAQ5Biostatus DR50200Это соединение раньше продавалось компанией LI-COR по 1 мМ
SapphireLI-COR928-40022
ЛюминометерPerkinElmerVICTOR3 1420 счетчик
Odyssey ImagerLI-COR9201-01
Шейкер/миксерИсследовательская продукция Интернэшнл248555
с несколькими метками

Ссылки

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DRAQ5 SapphireOdyssey
Жизнеспособность Анализы на клетки в культуре
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.