Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро

16.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50662

⸱

1 августа 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Departments of Immunology and Microbial Sciences, The Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Спасение рекомбинантных аренавирусы из клонированных кДНК, подход называют обратной генетики, позволяет исследователям исследовать роль специфических вирусных генных продуктов, а также вклад их различных конкретных областях и остатки, ко многим различным аспектам биологии ареновирус . Кроме того, методы обратной генетики в FDA утвержденных клеточных линий (Vero) для разработки вакцины обеспечивает новые возможности для создания эффективных и безопасных вакцин для борьбы человека аренавирусы патогенными.

Аннотация

Разработка и реализация ареновирус обратной генетики представляет собой значительный прорыв в 4 поля ареновирус. Использование клеточных ареновирус минигеном систем вместе с способность генерировать рекомбинантного инфекционного аренавирусы с заданными мутациями в их геномах способствовал исследованию вклада вирусных детерминант в различных этапах жизненного цикла ареновирус, а также вирус-хозяин взаимодействий и механизмов ареновирус патогенез 1, 3, 11. Кроме того, развитие trisegmented аренавирусы разрешил использование ареновирус генома выразить дополнительную интерес чужеродных генов, тем самым открывая возможность ареновирус вакцины на основе вектора приложения 5. Кроме того, развитие однотактную инфекционных аренавирусы способны выразить гены репортер обеспечивает новый экспериментальный инструмент для повышения безопасности исследований с участием Highlу человека патогенных аренавирусы 16. Поколение рекомбинантных аренавирусы использованием плазмиды на основе обратной генетики до сих пор полагались на использование линий грызунов клетки 7,19, что создает некоторые препятствия для развития пищевых продуктов и медикаментов (FDA)-лицензированной вакцины или вакцины векторов. Чтобы преодолеть это препятствие, мы описываем здесь эффективное производство рекомбинантных аренавирусы в FDA утвержденных Vero клеток.

Введение

Аренавирусы окутаны вирусов с bisegmented, отрицательная РНК генома 3, которые принадлежат к семейству Arenaviridae. Ареновирус генома кодирует белки в четыре ambisense моды из двух отдельных вирусных сегментов 3. Большой (L) сегмент кодирует РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) и малое кольцо (действительно интересный новый ген) палец белка (Z), которая служит главной движущей силой вируса почкованием. Маленький (S) сегмент кодирует вирусный нуклеопротеина (NP), а поверхность гликопротеина (GP) (рис. 1).

Несколько членов семьи Arenaviridae ответственны за смертельные геморрагические лихорадки (HF) в организме человека 3. Из принципа опасения вируса Ласса (LASV) и вирус Хунин (JUNV), который как известно, вызывают высокую смертность у больных, госпитализированных 8, 9. Хотя эти вирусы являются эндемичными для Западной Африки и сельских Аргентине, соответственно,Есть растущую озабоченность ввоза LASV и JUNV чтобы не эндемичных районах в связи с увеличением числа поездок 10. Кроме того, хотя обычно не связаны с тяжелыми заболеваниями у людей, прототип ареновирус лимфоцитарные хориоменингита (LCMV) считается возбудителем пренебречь, поскольку были случаи смертельных инфекций у пациентов с иммунодефицитом 6, 15 и отвечает за врожденные аномалии и спонтанные аборты у беременных женщин, 2, 13. Пока ни один американский FDA-разрешенных вакцин против аренавирусы и лечение ограничивается аналог нуклеозидов рибавирином, которая лишь частично эффективны и часто связано со значительными побочными эффектами.

Внедрение на основе плазмиды обратной генетики и 4 поколение рекомбинантных аренавирусы 7, 19 в значительной степени продвинули области ареновирус исследований. В настоящее время клетки грызунов (например, ВНК-21) используются для вообще говоряAtion рекомбинантных аренавирусов из-за видоспецифических мышиной РНК-полимеразы I (поли-I) промотор, направляющий начальной транскрипции S и L сегментов. Однако вирус спасения в клетках ВНК-21 не утвержденного метода получения рекомбинантных аренавирусы в качестве потенциальных кандидатов семян вакцины. Здесь мы документировать использование человеческих POL-я промоутер для эффективного спасения прототипом Старого Света (OW) LCMV и Новый Свет (NW) JUNV Откровенный № 1 напряжения в клетках Vero. Использование аналогичной методологии, мы получили рекомбинантный trisegmented LCMV (r3LCMV) и откровенной № 1 (r3Candid # 1) аренавирусы, которые содержат два дополнительных чужеродные гены закодированы в двух различных сегментов РНК S 5. Эта новая система не только следует высокой воспроизводимостью и простой протокол, но могут быть непосредственно реализованы в получения рекомбинантных аренавирусов как потенциальные вакцины или семена вакцинного вектора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Трансфекцию ареновирус спасения

Наши спасательных система основана на использовании как полимеразой II экспрессии белка плазмидами, кодирующими нуклеопротеина (NP) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (L), вирусный транс-действующие факторы, необходимые для репликации РНК и экспрессии генов в геноме ареновирус 7, 19 и плазмиды, способные направлять внутриклеточный синтез, через сотовую РНК-полимеразы I (поли-I) из S и L антигеном виды РНК 7. В наших исследованиях мы используем pCAGGs плазмиды экспрессии белка, который использует куриный β-актин промотора и polyadenylanation (PA) сигнальные последовательности, и человеческий POL-я плазмиды, которая использует человеческие полимеразы промотор и терминатор мышиных последовательностей (рис. 2) . S и L сегментов РНК клонируют в HPOL-I плазмиды в антигеномную ориентации для обеспечения генерации геномных сегментов РНК после транскрипции HPOL-I. По спасению диких-воPE рекомбинантных LCMV (rLCMV) и откровенной № 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP и L друг от вируса котрансфицировали вместе с их соответствующими человека POL-I S и L сегментов РНК (рис. 3). Генерация рекомбинантного trisegmented LCMV (r3LCMV) и откровенной № 1 (r3Candid № 1), а затем аналогичный протокол, но сегмент S была разделена на две различные плазмиды POL-I S, каждый из которых кодирует ген-репортер отличительных: в одном, NP открытые чтения рамка (ORF) был заменен на зеленый флуоресцентный белок (GFP) ген-репортер (HPOL-I S GFP / GP) и, с другой стороны, вирусный предшественник гликопротеина (ГПХ) ORF заменяется Gaussia люциферазы (Gluc) ген-репортер (HPOL-I S NP / Gluc). Схематическое представление протокола показано на рисунке 4. После трансфекции и инфекции протокол был установлен на 6-луночные планшеты.

  1. OptiMEM Lipofectamine-2000 (LPF2000) смеси: Подготовьте 250 мкл среды OptiMEM и, в зависимостина вирус спасательных, 10 - 12 мкг LPF2000 (1 мкг / мкл) в трансфекции (таблица 1). Отношение 2,5 мкг LPF2000 на мкг ДНК рекомендуется. Инкубировать в течение 5 - 10 мин при комнатной температуре. Между тем, готовить смесь трансфекции плазмидой в отдельную пробирку микроцентрифужных (шаг 1.2).
  2. Плазмиду смесь трансфекции ДНК: Подготовка трансфекции плазмидой коктейль в микроцентрифуге трубки с помощью рекомендуемое количество для каждого вируса спасательных работ (см. таблицу 1). Принесите конечный объем до 50 мкл с OptiMEM.
  3. OptiMEM-LPF2000-ДНК плазмиды смеси: Добавить 250 мкл OptiMEM-LPF2000 смеси (шаг 1.1) в смеси трансфекции плазмиды ДНК (шаг 1.2). Инкубируют в эту смесь в течение 20 - 30 мин при комнатной температуре. В то же время подготовить и считать 1 х 10 6 клеток на Vero трансфекции реакции. Vero клетки будут трансфицированных в суспензии.
  4. Подготовка клетки Веро: Vero челлс культивируют в 100 мм чашек. Перед началом приведения 1х PBS, DMEM 10% FBS, 1% PS информации и трипсин-ЭДТА смесь до 37 ° C.
    1. Мытье клетки дважды с 5 мл 1x PBS.
    2. Trypsinize клеток с 1 мл трипсина-EDTA и подождите, пока клетки отделяются (около 5 мин). Нежный нарезание возможно, необходимые для полного открепления клеток от блюд.
    3. Осторожно ресуспендирования клеток в 10 мл среды DMEM 10% FBS, 1% PS в 15 мл центрифужную пробирку.
    4. Центрифуга клетки в течение 5 минут при 1000 оборотов в минуту в центрифуге.
    5. Ресуспендируют клеток в 10 мл среды DMEM 10% FBS, 1% PS и подсчета клеток с использованием гемоцитометра и регулировать концентрации 1 × 10 6 клеток / мл. Было отмечено, что 0,5 - 1 х 10 6 клеток на Vero трансфекции показали наилучшие результаты.
  5. Смешайте LPF2000/DNA и клеток: через 20 - 30 мин комнатной температуры инкубации (шаг 1.3), добавить 1 мл клеток Веро (1 х 10 6) (шаг 1.4) кOptiMEM-LPF2000-ДНК плазмиды смеси и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
  6. Семенной LPF2000/DNA-cell смесь в 6-луночные планшеты: Добавить ДНК-LPF2000-Веро смеси (шаг 1,5) в лунки 6-луночного планшета. Аккуратно встряхните 6-и-тарелку и потом трансфекции инкубировать в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
  7. Изменить трансфекционную среду: около 16 - 24 часов после трансфекции, удалите трансфекции СМИ, добавляют 2 мл инфекции СМИ и инкубировать трансфекции клеток в течение 48 часов.
  8. Сотовые пассаж: После 48 часов инкубации инфекции в средствах массовой информации, удалить супернатанта клеточной культуры (TCS) и передать трансфицированным клеток в 100 мм блюдо. TCS редко содержит инфекционный вирус, потому что Трансфицированные клетки нуждаются в дополнительной инкубации для создания вирусных частиц. Для ячейки пассаж:
    1. Мытье клетки дважды по 2 мл 1x PBS.
    2. Trypsinize клетки W го 0,5 мл трипсина-EDTA и ждать, пока клетки отсоединить.
    3. Ресуспендируют клеток в 1 мл среды DMEM 10% FBS, 1% PS в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
    4. Центрифуга клетки в течение 5 минут при 5000 оборотов в минуту, 4 ° С в микроцентрифуге.
    5. Осторожно ресуспендирования клеток в 1 мл среды инфекции и передачи клеткам 100 мм чашку. Поднимают общего объема в пластине с инфекционными информации, в 8 мл, достаточный объем, чтобы предотвратить высыхание клеток, а также для концентрации вируса.
  9. Осторожно встряхнуть 100 мм чашку и продолжают инкубацию Vero клеток в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 72 час.
  10. Коллекция TCS: После 72 часов инкубации, собирать TCS в 15 мл центрифужные пробирки. Удалить клеточного дебриса центрифугированием в течение 5 мин при 2500 оборотах в минуту в центрифуге. Инфекционные ареновирус находится в TCS, так что удалить из клетки мусора гранул и хранить TCS при -80 ° С.
Le "> 2. Подтверждение рекомбинантного спасательной ареновирус

Обнаружение успешное спасение rLCMV и rCandid № 1 осуществляется через блок формирования фокуса (ФФУ) иммунофлюоресценции (РИФ). Для вируса дикого типа спасательных мы используем антитела, специфичные к вирусным NP. R3LCMV и r3Candid # 1 кодируют два репортерных генов (GFP и Gluc), что позволяет вирусной обнаружения и титрование без необходимости антител с помощью флуоресцентной микроскопии (GFP) и / или люминесценции (Gluc).

  1. Подтвердите дикого типа рекомбинантных спасательных ареновирус: За день до титрования, мыть клетки Веро дважды PBS, Trypsinize и подготовить 96-луночных планшетов достигнет 80 - 90% слияния следующий день (4 х 10 4 клеток / лунку). Осторожно встряхнуть пластин вручную, чтобы получить равномерное распределение клеток. Культуры клеток, в одночасье, в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. Проверьте клеток под микроскопом, чтобы подтвердить монослой, прежде чем приступить к инфекции:
    1. Серийно разбавленных (10 кратное разбавление), содержащих вирус TCS извлечены из трансфицированных клеток в 100 мм чашке (шаг 1,10) в OptiMEM.
    2. Удалите носитель из посеянных клетки Vero, мыть два раза с 50 мкл 1x PBS, и инфицировать клетки с 50 мкл серийно разводили вируса (шаг 2.1). Infect клетки в течение 1,5 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
    3. После заражения, удалить вирус посевной, добавьте 100 мкл инфекции СМИ / лунку и инкубировать клетки в течение 16 - 18 час. Вирусные повторное инфицирование может произойти после 18 ч инкубации, что может привести к переоценке вирусные титры.
    4. В 16 - 18 ч после инфицирования удалить TCS из каждой лунки и фиксации клеток с 4% формальдегидом разведенного в 1 × PBS, в течение 15 мин при комнатной температуре.
    5. Затем удалите фиксирующем растворе и клетки проницаемыми с 0,1% тритона Х-100 разбавляют в 1 × PBS, в течение 10 мин при комнатной температуре.
    6. Аспирируйте пермеабилизации решение, то мыть клетки 3 раза Wiй 1x PBS.
    7. Блок клеток с 2,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA) в 1х PBS (блокирующий раствор) в течение 1 часа при комнатной температуре. Альтернативно клетки можно блокировать в течение ночи при 4 ° С и продолжали инкубацию с антителом на следующий день.
    8. Тем временем подготовки первичного антитела. Развести LCMV и Candid # 1-специфический первичными антителами в блокирующем растворе, а затем центрифугируют антитело / блокирующий раствор в течение 15 мин при 3500 оборотах в минуту. Моноклональное анти-LCMV NP антител клона 1.1.3 (1:30 разбавление) 16 и моноклональных анти-NP JUNV антитело SA02-BG12 от BEI ресурсов (разведение 1:500) может быть использован для обнаружения rLCMV и rCandid # 1 соответственно.
    9. После 1 часа инкубации, аспирации блокирующего раствора и добавляют 50 мкл первичного антитела к клеткам и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
    10. В это время, разбавленные вторичные антитела в блокирующем растворе, а затем центрифугируют антитело / блокирующий раствор в течение 15 мин при 3500 оборотах в минуту. Поликлональной кроличьего антитела против мышиного IgG FITC вторичными антителами для обнаружения первичных моноклональные антитела были использованы для получения изображения наблюдались на рисунке 5.
    11. После 1 часа инкубации, аспирации первичных антител, промыть 3 раза 1 × PBS и добавьте вторичным антителом в течение 30 мин при 37 ° С.
    12. После 30 мин инкубации, аспирации вторичные антитела и промыть 3 раза с 1x PBS. Клетки теперь готовы наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии как определять успех вирусной спасательных и титрование путем подсчета фокус единиц на мл (ФФУ / мл).
  2. r3LCMV и r3Candid # 1 вирусные помощь: Поскольку эти вирусы передачи двух репортерных генов, их спасает можно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии для обнаружения GFP выражение или Gluc выражение в ТКС. Спасение может быть также подтверждается выражением Gluc в ТКС. На титрование trisegmented вирусы, мы следуем шаги 2.1 до 2.1.4, однако клетки не нужно Bэлектронной фиксируется для определения успешной вирусной спасательных из-за GFP выражения. Титрования вируса будет определен путем подсчета ФФУ / мл. Для определения успешный вирусный спасение Gluc выражение, Gluc выражение из TCS может быть измерена с использованием набора для анализа Gluc (Biolux Gaussia набора для анализа люциферазы, New England Biolabs). С этой целью:
    1. Внесите 100 мкл TCS в 96-а белая пластина (плоское дно микротитрационные планшеты, Fisher Scientific).
    2. Настройка люминометра (LumiCount, Packard Biosciences).
    3. Добавить 50 - 100 мкл Assay Gluc раствора (в соответствии с рекомендациями производителя) к каждому образцу и измерить Gluc экспрессии гена репортера в фотометр. В качестве отрицательного контроля, Gluc выражение TCS с вирусами дикого типа инфицированных клеток была измерена.

3. Прохождение Супернатанты тканевой культуры

Вирусные спасательных зависит от эффективности трансфекции. Vero клетки, как было показано, имеют более низкую эффективность трансфекции по сравнению с другими клеточными линиями 14. Если титры вируса в TCS низки, инфицировать свежий Vero клеток при множественности инфекции (MOI), 0,01 (LCMV) или 0,1 (Candid # 1) в течение 72 ч, чтобы усилить вируса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное спасение рекомбинантного дикого типа ареновирус будет подтверждено присутствие вирусных антигенов использованием IFA (рис. 5). В случае trisegmented рекомбинантных вирусов, успешной вирусной спасательных можно оценить путем наблюдения GFP выражение с помощью флуоресцентной микроскопии (фиг. 6А). Успешное спасение будет дополнительно подтверждена путем оценки Gluc выражение (фиг.6В). Типичные результаты, иллюстрирующие успешное спасение дикого типа и trisegmente...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Генерация рекомбинантного аренавирусы использованием плазмиды на основе обратной генетики стала широко используемый подход для исследования различных аспектов ареновирус биологии. Здесь мы документе решающую совершенствования нынешней системы, выполняя ареновирус спасает в Веро-клетки, что позволяет потенциальным поколение FDA утвержденных кандидатов вакцины против аренавирусы и вакцины против векторов других инфекционных заболеваний.

Экспериментальные процедуры, связанные в целом хорошо изв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим бывших и нынешних членов лабораторий JCT и LM-S за разработку и улучшение методов обратной генетики аренавируса и плазмид. Также благодарим Снежану Димитрову за техническую поддержку. Моноклональное антитело, направленное на JUNV NP (SA02-BG12), было получено от BEI Resources (NIAID Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository). BYHC был поддержан грантом No GM068411 от Национальной исследовательской службы Рут Л. Киршштейн. EO-R является стипендиатом Fullbright-Conicyt (BIO 2008) и Рочестерской стипендией по вакцинам (2012). Текущая поддержка EO-R обеспечивается постдокторской стипендией за разнообразие и академическое превосходство от Управления по развитию факультета и разнообразию в Университете Рочестера. Исследования в лаборатории LM-S финансируются грантами NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, Центрами передового опыта NIAID по исследованию и надзору за гриппом (HHSN266200700008C) и Центром биозащитного иммунного моделирования Университета Рочестера (HHSN272201000055C).

Исследования в лаборатории JCT были поддержаны грантами RO1 AI047140, RO1 AI077719 и RO1 AI079665 от NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Material and methods
Cell lines
Vero E6 (эпителиальные клетки почек африканской зеленой мартышки) поддерживаются в 37 ° С-инкубатор с 5 % CO<суб>2 в DMEM 10 % FBS 1 % PS. Клетки доступны из Американской коллекции типовых культур (ATCC, каталожный номер CRL-1586).

Plasmids
Все плазмиды, за исключением hpol-I L, могут быть выращены при 37 °°; C, на 16-18 ч. Мы рекомендуем выращивать культуры hpol-I L при температуре 30° C в течение 24 часов. Плазмиды готовят с помощью набора плазмид макси (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) в соответствии с рекомендациями производителя и хранят при температуре -20°С. Концентрацию очищенной ДНК-плазмиды определяют методом спектрофотометрии при длине волны 260 нм, а чистоту оценивают с помощью соотношения 260:280 нм. Препараты с соотношением 1,8-2,0 260:280 нм считаются подходящими для целей спасения от вирусов. Кроме того, концентрация и чистота плазмид должны быть подтверждены с помощью электрофореза в агарозном геле.

Viruses
Описанный протокол спасения rLCMV (Armstrong 53b) и rCandid#1 может быть выполнен в условиях уровня биобезопасности (BSL) 2. Загрязненный материал, включая ТХС и клетки, должен быть стерилизован перед утилизацией. Для спасения других аренавирусов может потребоваться более высокий уровень BSL, поэтому необходимо соблюдать надлежащие меры безопасности.

Среды и растворы для культур тканей
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle's (DMEM), 50 мл фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 5 мл 100X пенициллина/стрептомицина (PS). Хранить при температуре 4 °C. Эта среда будет использоваться для поддержания клеток Vero.

Infectious Media: смесь OptiMEM и DMEM 10 %FBS 1 %PS. Хранить при 4 °C. Хранить при 4 °C. Эта среда будет использоваться при вирусных инфекциях.

10X Фосфатный буферный раствор (PBS): 80 г NaCl, 2 г KCl, 11,5 г Na2HPO4.7H2O, 2 г KH2PO4. Добавьте ddH2O до 1 литра. Отрегулируйте pH до 7,3. Стерилизовать автоклавом. Хранить при комнатной температуре.
1X PBS: Разбавьте 10X PBS 1:10 ddH2O. Стерилизовать в автоклаве и хранить при комнатной температуре.
2,5% BSA: 2,5 г BSA в 97,5 мл 1X PBS. Хранить при температуре 4 °C. Это используется в качестве решения для блокировки IFA.

Ссылки

  1. Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
  2. Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197(1996).
  3. Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827(2007).
  4. Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
  5. Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
  6. Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
  7. Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
  8. Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
  9. Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
  10. Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
  11. Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
  12. Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
  13. Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
  14. Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
  15. Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
  16. Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
  17. Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
  18. Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
  19. Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FDA
Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.