Производство большого количества Размер контролируемой опухолевых сфероидов Использование микролунках планшета

Краткое содержание

Введем протокол для генерации больших чисел (тысяч до сотен тысяч) одинакового размера и составом контролируемых опухолевых сфероидов, используя коммерчески доступные микролуночные пластины.

Аннотация

Опухолевые Сфероиды получают все большее признание в качестве важного пробирке модель в для поведения опухолевых клеток в трех измерениях. Более физиологически актуальны, чем обычные приверженцем листов культур, они более точно воспроизводят сложность и взаимодействие, присутствующие в реальных опухолей. Для того, чтобы использовать эту модель, чтобы лучше оценить биологии опухоли или эффективность новых терапевтических средств, необходимо, чтобы иметь возможность генерировать сфероидов воспроизводимо, контролируемым образом и в значительных количествах.

Система состоит из AggreWell высокой плотности массива пирамидальной формы лунки, в которую собой суспензию одиночных клеток центрифугируют. В число клеток кластеризации в нижней части каждую микролунку, а также количество и соотношение различных типов клеток, участвующих зависят только от свойств суспензии, введенной экспериментатором. Таким образом, мы способны генерировать опухоли сфероидов произвольного размера и состава сиз необходимости для изменения базовой технологической платформы. Сотни лунок на квадратный сантиметр площади поверхности культура, в свою очередь гарантировать, что чрезвычайно высокие уровни производства могут быть достигнуты с помощью простой, nonlabor интенсивно процесса. Поэтому мы ожидаем, что этот протокол будет в целом полезно для исследователей в области сфероида опухоли.

Введение

Существует больше доказательств, что опухолевые клетки ведут себя по-разному в трехмерных культурах, чем они делают при культивировании на пластике, и что терапевтические агенты, определенные на обычных тканевых культур платформ может потерять эффективность, когда перешли к более физиологически соответствующей системы ^1. Поэтому желательно, чтобы изучить поведение раковых клеток в этих условиях, как, чтобы получить информацию об их основной биологии, а также увеличить вероятность успеха перехода новых терапевтических агентов от скрининга объекта в клинику. Один полезную модель системы с долгой историей использует трехмерные кластеры раковых клеток, известных как опухолевых сфероидов ^1,2. В идеале, методы формирования сфероида позволило бы производство большого числа однородных сфероидов, размер и состав под контролем экспериментатора. В то время как висит падение и хорошо пластина приближается ^3,4 в состоянии выполнить некоторые из этих реquirements, пропускная как правило, ограничивается, и поколение большого числа сфероидах становится задачей трудоемкой.

Недавно мы разработали систему для решения аналогичных проблем в регенеративной области медицины ^5. Применение принудительной агрегации в рамках серии плотно упакованных микронного масштаба скважины (см. рисунок 1), этот подход допускает образование сфероидов с произвольным количеством клеток, в том числе смеси нескольких типов клеток ^6, а также включение различных биоматериалов ^7. Сфероиды образуются в больших количествах - тысячи до сотен тысяч или более - и может быть извлечена сразу или сохранить в лунки в которых они образовались со средней обмен на по крайней мере один ⁸ до двух (неопубликованные наблюдения) недель. Эта система, таким образом, хорошо подходят для генерации большого количества военной форме и воспроизводимых опухолевых сфероидов для оценки Effectiveness новых противоопухолевых агентов или основных биологических исследований.

Протокол

Примечание: Микролуночные пластины доступны в различных форматах, в зависимости от желаемых результатов. Технические характеристики, а также приблизительные руководящие принципы для минимальных и максимальных количества клеток, которые должны использоваться с каждым форматом приведены в таблице 1. Меньшие Микролунки конус к резкому точке, и, таким образом, нет никакого нижнего предела размера, хотя изменчивость между сфероидов становится более значительным, при меньших размерах. Регулярное производство сфероидах в среднем с всего за 20 камерами на каждом проста ^8. Чем больше размер микролуночный не полностью конические, поэтому попытки сформировать сфероидов из небольшого числа клеток может привести к несколько более мелких сферических частиц в каждую микролунку. Из-за небольших различий в свойствах поверхности, подготовка с раствора ПАВ (шаг 1.2) не является обязательным при использовании AggreWell 400Ex пластины.

Этот протокол основан на использовании AggreWell 400 пластин - для других форматов минусыии Таблица 1. Число клеток, загружаемых в каждую лунку определяется путем умножения количества лунок он содержит по количеству ячеек, которые будут кластерных для каждого сфероида. Например, для создания сферических частиц из 1000 клеток за штуку, каждую лунку должны быть загружены (1200 сфероидах раз 1000 клеток каждый =) 1,2 х 10 ⁶ клеток. Плотность клеток должны быть рассчитаны при условии, что эти клетки будут загружены в объеме 0,4 мл. Таким образом, на примере сфероидов, образованных из 1000 клеток в каждом, 1,2 х 10 ⁶ клеток в 0,4 мл приводит к плотности 3 × 10 ⁶ клеток на мл.

1. Подготовка Микролунки получать клетки

1. Микролуночные пластины являются стерильными, как это предусмотрено, и должны быть удалены только из упаковки в стерильной среде, такие как ламинарном шкафу биобезопасности. Стерильность следует поддерживать в течение протокола. Если бесплодие быть нарушена, лунки стерилизовать с помощью 70% этанола в воде с использованиемследующие дополнительные шаги.
   1. Добавляют 0,5 мл 70% этанола в каждого неиспользуемого скважины. Некоторые Микролунки будет пузырьки воздуха ловушки, хотя это может быть уменьшена путем добавления жидкости с одной стороны, и позволяет ему распространяться по всей поверхности, а не падать вертикально на поверхность. Замените крышку.
   2. Хотя паров этанола должны быстро проникают пузырьки, если Есть большое количество может быть желательно, чтобы удалить их. Центрифуга течение 2 мин при 2000 х г. Следует отметить, что важно обеспечить ротор должным образом сбалансированы на этой скорости.
   3. Использование низкого увеличения инвертированного микроскопа, проверяют пузырьки были удалены из лунок.
   4. Инкубировать в течение 5 мин с крышкой на при комнатной температуре.
   5. Аспирируйте этанол. Пластина может теперь быть промывают стерильной водой или PBS для немедленного использования или сушат на воздухе для хранения.
2. Для того чтобы гарантировать, что клетки не взаимодействуют с поверхностью микропланшета, она может быть получена с использованием поверхностно-активное вещество. В целом эторекомендуется выполнить этот шаг на начальном этапе, и впоследствии сравнить сфероидов, созданные с и без ПАВ покрытием лунок.
   1. Добавить 0,5 мл промывки раствора в каждую лунку. Некоторые Микролунки будет пузырьки воздуха ловушки, хотя это может быть уменьшена путем добавления жидкости с одной стороны, и позволяет ему распространяться по всей поверхности, а не падать вертикально на поверхность. Замените крышку.
   2. Центрифуга течение 2 мин при 2000 х г для удаления пузырьков. Следует отметить, что важно обеспечить ротор должным образом сбалансированы на этой скорости.
   3. Использование низкого увеличения инвертированного микроскопа, проверяют пузырьки были удалены из лунок.
   4. Инкубировать в течение по крайней мере тридцати минут с крышкой на при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Пластины могут быть сохранены на четыре градуса с поверхностно раствора в лунках, пока не требуется, если должным образом герметизированы для предотвращения высыхания.
   5. Промыть пластины стерильной водой или PBS непосредственно перед использованием. Не позволяйте пластинывысыхать после нанесения покрытия.

2. Подготовка клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Детали клеточного препарата будет несколько меняться в зависимости от конкретного типа клеток изучается. Однако мы наблюдали эти условия, чтобы быть эффективным с широким диапазоном ячеек, в том числе линий, обсуждаемых здесь, а также человека и мыши эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC), фибробласты, предполагаемого примитивной энтодермы, и стромальные клетки. Другие группы использовали эту систему успешно для широкого диапазона приложений, включая хондрогенезе из мезенхимальных стволовых клеток ^9, стандартизированные поколение нейронных предшественников из плюрипотентных стволовых клеток ^10, токсикологические анализы в гепатоцитах ¹¹ и оценки спинного мозга регенерации в саламандры ^12. Конкретный протокол для работы с клетками НТ29 показано здесь.

1. Начните с T75 колбу клеток НТ29, культивируют в DMEM+ 10% FBS
2. Аспирируйте ростовую среду из колбы, и добавить 3 мл трипсина.
3. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С
4. Остановить трипсина пищеварение, добавив 3 мл ростовой среды. Возьмите аликвоту для подсчета клеток и передать остаток в 15 мл трубки центрифуги.
5. Центрифуга в течение 5 мин при 200 х г.
6. В то время как центрифугирования в прогресс, подсчета клеток.
7. Аспирируйте трипсин / средний смесь и заменить свежей средой роста, объеме, определяемом требуемой плотности клеток, рассчитанной выше.
8. (По выбору) Pass клеточной суспензии через сито, чтобы удалить любые комки. ПРИМЕЧАНИЕ: условия уборки сотовый будет несколько отличаться между линиями. Если протокол для диссоциации например пассажей клеток, представляющих интерес имеется, который должен быть использован в качестве отправной точки. С чувствительные клеточных линий использовании трипсина может привести к чрезмерному гибели клеток. В этих случаях мы наблюдали хорошие результаты, используя TrypLE в качестве альтернативного dissociatiна реагентом ^8. Если клетки становятся слипаются при диссоциации и теряют жизнеспособность, добавление ДНКазы к раствору фермента может решить эту проблему. Уменьшение времени диссоциации и используя шаг растирания, чтобы разбить комки клеток может также увеличить жизнеспособность.

3. Сфероид Формирование

Примечание: сфероиды могут быть получены в различных средних составов, однако начальные испытания следует проводить с использованием среды, в которой клетки культивировали, чтобы отличить последствия перехода к 3-мерной системе культуры от последствий изменения состава среды.

1. Добавить 0,4 мл ростовой среды в каждую лунку.
2. Центрифуга течение 2 мин при 2000 х г для удаления пузырьков. Следует отметить, что важно обеспечить ротор должным образом сбалансированы с этой скоростью до центрифугирования.
3. Использование низкого увеличения инвертированного микроскопа, проверяют пузырьки были удалены из лунок.
4. Добавить 0,4 млсуспензию клеток при требуемой плотности (рассчитанной выше). Аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, без введения пузырьков воздуха в лунки. Важно, чтобы гарантировать, что клетки равномерно распределены по всей скважине, с тем чтобы получить последовательные сфероидов.
5. Центрифуга в течение 5 мин при 200 х г. Если пластина не собственного уровня во время центрифугирования, конвекционные потоки могут возникнуть, в результате которых неравномерного распределения клеток через лунки. Таким образом, пластина должна быть сбалансирована внутри, так и против другой пластины, так, чтобы вес равномерно распределяется по обе стороны от несущей пластины.

ПРИМЕЧАНИЕ: В случае отсутствия данных о неравномерности распределения клеток видно, это может быть необходимо нанести небольшое количество смазки на опорных точек на пластине носителя - проконсультироваться с центрифуги производителя для получения инструкций.

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как клетки были центрифугировали в лунки, они достаточно сопроTant к вымыванию из незначительных движений пластины. Резких движений, которые приводят к выплескивания среды следует избегать, но передача пластины из центрифуги в микроскоп или инкубаторе не должны приводить к значительному смещению клеток.

6. Использование инвертированного микроскопа, убедитесь, что клетки группируются в лунки, и чтобы они были равномерно распределены по скважине.
7. Выдержите в течение ночи при 37 ° С
8. Использование инвертированного микроскопа, наблюдать за процессом сфероида образования. Некоторые клеточные линии образуют компактные сфероидов в течение 24 часов, другие могут занять больше времени. Переход от кластера собираться в НТ29 показано на рисунке 2.
9. Восстановление сфероидов из лунок и трансфер в суспензионной культуре, осторожно струйное их с помощью пипетки. С другой стороны, поддерживать сфероиды на месте со средой замены ⁸ - продолжительность зависит от их первоначального размера и темпов роста, которые четкостиИне время, пока они не перерастают микролунки, в котором они были сформированы.
   1. Для замены среды без потери сфероиды аспирации среды на краю хорошо с использованием пипетки Пастера. Медленно подносите вниз, пока она не начнет рисовать жидкость от мениска, и следуйте мениск вниз, как он падает. Затем добавляют свежую среду к стенке скважины в том же самом месте. Несколько сфероиды могут быть потеряны, поэтому если среда всегда отсасывали и заменяли на той же позиции, это число будет оставаться небольшой по сравнению с большими количествами в скважине.

Результаты

Spheroids из множества линий опухолевых различной анатомических происхождения могут легко быть созданы и экстрагировали в суспензионной культуре. Рисунок 3 иллюстрирует последовательный контроль размера, получаемый с помощью этого метода, с очень равномерными популяций сфероида при каждом условии. Очистить различия между строк в поведении также видны, с раком толстой кишки НТ29 клеток и TE6 пищевода раковых клеток, образующих плотно упакованные сфероиды с резко обозначенными границами, в то время как раковые клетки LNCaP простаты породило менее когерентных сфероидах с нерегулярными границами (см. Обсуждение возможных причин ). Более сильные внутренние силы в более согласованных агрегатов также привело к краху к более симметричной форме даже будучи еще в лунки в которых они образовались, в то время как LNCaP агрегаты, особенно на больших размеров, заметно сохранить квадратного-пирамидальной геометрии микролунки. Отношения между числами входных клеток и физике ческих размер результирующего сфероида будет зависеть от целого ряда переменных. Теоретические объемы, основанные на произведение объема на клетку, и количество клеток, используемых может быть уменьшен путем потери клеток, которые в свою очередь могут включать потерю клеток на стадии одного клеточной суспензии, а также потери от чрезмерно мелких агрегатов за счет недостаточное количество соседей, и от чрезмерно больших агрегатов из-за транспортировки ограничения и некроз в ядре. Размер также будет зависеть от любой пролиферации, которые могут возникнуть в процессе агрегации. Так как эти параметры будут отличаться от клеточной линии к клеточной линии, если сфероиды конкретных физических размеров желательно правильное количество клеток по введению должно быть определено экспериментально. В первом приближении, сфероид диаметром ожидается увеличение с кубического корня из числа клеток, входящих - например 8-кратное увеличение количества клеток должно привести к удвоению сфероида диаметре.

_content "FO: держать-together.within страницах =" всегда ">
Рисунок 1. Схема сфероида производства. Система микролуночный состоит из множества плотно упакованных квадратных-пирамидальный лунки (625 на см ² для 400 μ м размера), в которую клетки могут быть центрифугировали. Клетки объединяются на наклонных боковых стенок, и размер получаемого сфероида регулируется изменением плотности клеточной суспензии, используемой.

50665fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Ассамблея кластерных клеток в сфероидах. Сфероиды были сформированы из семисот НТ29 клеток в каждой. Сразу после центрифугирования (А), клетки свободно сгруппированы в нижней части каждой микролунку. Следует отметить, что кластеры равномерно смещены в нижнем правом углу в этом случае. Это допустимо при условии размеры кластеров остаются неизменными в массиве. Если различия в размерах значительное скопление видны с одной стороны массива в другой, см. примечание в шаг 3.5. После инкубации в течение 24 ч (B), межклеточные адгезионные силы вызвали кластеры агрегировать и образовывать последовательную сфероидов, которые затем могут быть извлечены (C).

об /> Рисунок 3. Сфероиды генерируемые в микролунках планшета. Сфероиды были сформированы из семисот (А, С, Е) или полутора тысяч (B, D, F) рака толстой кишки НТ29 клетки (А, В), LNCaP клетки рака простаты (С, D) или TE6 пищевода раковые клетки (E, F). Обратите внимание на консистенцию сфероидах пределах подготовки, а также различия между клеточными линиями - в частности, свободные LNCaP агрегатов по сравнению с более плотно упакованы HT29 и TE6 клеток. Шкала бар представляет 200 мкм.

	Формат Микролуночный
	AggreWell 400	AggreWell 40EX	AggreWell 800
Ширина Микролуночный (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm )	400	400	800
Микролунки на см 2	625	625	156.25
Микролунки на лунку	1200	4700	300
Минимальные клеток на микролунку *	N / A	N / A	2000
Максимальные клеток на микролунку *	2000	2000	10000
Минимальные клеток на лунку *	N / A	N / A	6 × 10 5
Максимальные клеток на лунку *	2,4 х 10 6	9,4 х 10 6	3 х 10 6
1.1.1 - 70% объема этанола (мл)	0.5	2.0	0.5
1.2.1 - промывка объем раствора (мл)	0.5	2.0	0.5
3.2 - объем Средний предварительный натяг (мл)	0,4	1.6	0,4
3.5 - объем сотового нагрузка (мл)	0,4	1.6	0,4
* Цифры из клеток на микролунку являются лишь приближением как это значение будет меняться в зависимости от размера используемых специфических клеток, и должны быть определены эмпирически

Таблица 1. AggreWell варианты и модификации протокола.

Обсуждение

Мы создали систему, при которой большое количество однородных сфероидов может быть получена из нескольких клеточных линий из различных источников. Нам еще предстоит столкнуться с приверженцем клеточной линии, что не образует сфероидов в этих условиях. Ранее мы уже наблюдали потерю клеток в популяциях, подверженных anoikis ^5,8, однако на сегодняшний день этот вопрос не возник с линиями опухолевых. Система произвольно масштабируемой с площадью поверхности, с поведением последовательной через лунки в 24-колодец и формате 6-а, а также прототипов биореакторах, содержащих 50000 микролунки каждый настоящее время разрабатываются.

Если сфероид асимметрия быть проблемой, время инкубации в шаге 4.8 может быть увеличена до двух-трех дней. Spheroids также можно инкубировать в течение периода после извлечения из лунок, чтобы увеличить симметрию, однако в этом случае необходимо соблюдать осторожность, чтобы сохранить плотность культуры достаточно низкой, как сфероидов в контакте друг с другом Wiбудете часто сливаются в более крупные структуры. По этой причине, мы ранее поддерживали культур в лунки, в которых были сформированы агрегаты, с основным ограничением является размер сфероида. Это, в свою очередь, является функцией как скорость роста и начальным размером ^8, и если расширенный культура в планшете планируется, это следует учитывать заранее. Опции для предотвращения чрезмерно быстрый рост, если она произойдет, включают либо начиная с небольших сферических частиц, или с использованием более крупных лунки на AggreWell 800 пластины.

Если сфероиды не в состоянии увеличить в согласованности с течением времени, один из потенциальных причин может быть гибель клеток. В частности, в более крупные агрегаты высоко метаболически активных клеток, ограничения массовые транспортные по доставке кислорода и необходимых питательных веществ может привести к некротической сердечника ² - таким образом Несвязные сфероид может быть просто следствием чрезмерной клеточной смерти. Кроме того, измерения механической coheSion сфероидов были использованы для оценки межклеточные силы связи, в связи с метастатическим потенциалом данной клеточной линии ^13. Было бы интересно исследовать взаимосвязь между сфероида формы и метастатического потенциала, возможно, с использованием морфометрических таких как округлости и периметра к соотношения площадей.

В дополнение к исследования механических и морфометрических свойств сфероидов, монтаж в системе микропланшетным позволяет масштабную производство смешанного состава сфероидах, состоящая из комбинации нескольких типов и / или биоматериалов ^6,7 клеток. Взаимодействия опухолевых клеток с другими типами клеток играют важную роль в более тесно моделировать поведение опухолей в естественных условиях ^14, при этом он может представлять интерес для генерации сфероидов из опухолевых клеток в сочетании с фибробластами и эндотелиальными клетками, например. Микрочастицы различных биоматериалов также могут быть включены, и может повлиять на SPHeroid свойства как непосредственно через их взаимодействия с клетками ^7,15, а также в качестве резервуаров для контролируемого высвобождения факторов роста и цитокинов в глубь сфероида ^16.

Если есть беспокойство по поводу бесплодия, например при работе с планшете, в котором ранее был использован некоторые скважины, которые, возможно, провел некоторое время в инкубаторе в рамках предыдущего эксперимента, колодцы могут быть повторно стерилизована с 70% этанола в воде.

После того, как сфероиды были сформированы, они также могут быть отделены от остаточных некорпорированных клеток пропусканием суспензии через ячейки сетчатого фильтра. Отдельные клетки будут проходить, в то время как сферические частицы будут сохранены. Если сфероид подозревается в проливая потенциально метастатических клеток в течение культуры, может быть желательным для выполнения этой процедуры несколько раз - первоначально для удаления некорпоративные клетки, а затем изолировать purifieг популяции клеток, выделяемых сфероидов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Планшет AggreWell 400 StemCell	Technologies Inc.	27845/27945
Раствор для промывки	StemCell Technologies Inc.	07010
Cell strainer (37 &микро; m)	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
Трипсин-Версен (ЭДТА)	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
FBS	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
Инвертированный микроскоп	VWR / Motic	CA19000-610
Центрифуга Allegra X15R с держателями для стандартных луночных планшетов	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Ламинарный проточный шкаф	биобезопасности ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP