Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественный

17.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50677

⸱

23 августа 2013 г.

 ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

Нейтрофилов соблюдение активированного эндотелия в местах инфекции является неотъемлемым компонентом воспалительного ответа хозяина. Описанных в настоящем докладе является связывание нейтрофилов, что позволяет В пробирке Количественного определения первичных человеческих нейтрофилов связывания с эндотелиальными клетками, активированными воспалительными медиаторами в статических условиях.

Аннотация

Сосудистый эндотелий играет важную роль в воспалительной реакции. Во время острой фазы воспаления, эндотелиальные клетки (ECS) активируются принимающими посредников или непосредственно консервативных компонентов микробного или хост-полученных молекул опасности. Активированный ЭК экспресс цитокинов, хемокинов и молекул адгезии, которые мобилизуют, активировать и сохранить лейкоцитов в месте инфекции или травмы. Нейтрофилы первый лейкоцитов, чтобы прибыть, и прилипать к эндотелию с помощью различных молекул адгезии, присутствующих на поверхности обоих элементов. Основные функции нейтрофилов непосредственно устранить микробных угроз, направленной на выпуск других лейкоцитов путем выпуска дополнительных факторов, и инициировать заживления ран. Таким образом, их набор и привязанность к эндотелия является важным шагом в инициации воспалительной реакции. В этом докладе мы описываем в пробирке адгезию нейтрофилов анализе с использованиемкальцеин AM меченных первичных человеческих нейтрофилов для количественной оценки степени эндотелия микрососудов клеточной активации в статических условиях. Этот метод имеет то дополнительное преимущество, что такие же образцы количественно с помощью флуоресцентной спектрометрии можно визуализировать непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии для более качественной оценки нейтрофилов обязательным.

Введение

Так как сосудистый эндотелий находится в прямом контакте с циркулирующей кровью, уникально расположен инициировать быстрое воспалительной реакции во время инфекции или травмы. Эндотелиальные клетки (ECS) выражают распознающих рецепторов, которые распознают различные консервативные бактериальные компоненты и опасности молекул и рецепторов для хозяина воспалительных медиаторов, таких как TNF-alpha. Активация этих рецепторов вызывает ЭК секретируют цитокины (например, IL-6, IL-8, CXCL1 и CCL2) и усиливают молекул адгезии (например, E / P-селектина, VCAM-1 и ICAM-1) на своей поверхности один , 2. Эти молекулы всех облегчения локализации лейкоцитов к локализации инфекции и травмы, чтобы очистить множество инфекционных агентов и инициировать восстановление тканей 3,4. Нейтрофилов ответ на инфекцию предполагает слаженную взаимодействие между сосудистого эндотелия и ответы нейтрофилов. После активации ЕС, IL-8 секретируется и образует внутрисосудистого градиент на эндотелий, который позволяет нейтрофилов к дому, чтобы в месте инфекции или травмы 5,6. E / P-селектинами промежуточных нейтрофилов захвата и катится по относительно слабой ассоциации с glycomolecules нейтрофилов на клеточной поверхности. Эти взаимодействия, наряду с IL-8 связывания с его родственными рецепторами, облегчения надежной, интегрину-опосредованной привязанность и возможного ареста нейтрофилов на поверхности клеток эндотелия 7-10. После ареста, нейтрофилы могут мигрировать из сосудистой конкретных местах инфекции непосредственно устранения патогенных микроорганизмов, генерировать нейтрофилов внеклеточных ловушек для предотвращения распространения патогенных микроорганизмов, способствуют заживлению ран и отпустите дополнительные факторы, которые вербуют других лейкоцитов, таких как моноциты, макрофаги и дендритные Клетки 11-17.

Описанные в этом докладе, в пробирке метод для количественного нейтрофилов соблюдение мкВascular ECs после активации принимающей медиатор воспаления ФНО. Этот тест предназначен для оценки активацию ЭК, а не нейтрофилов. Первичные человеческие нейтрофилы выделяют с использованием первого разделения градиента плотности, а затем метили кальцеин ацетоксиметила (AM). Эстераз в живых клетках гидролизуют кальцеина AM к сильно флуоресцирующего кальцеин молекулы с возбуждением 492-495 нм и излучение 513-516 нм 18. Флуоресцентно меченных нейтрофилы затем инкубировали с монослои EC и не прилипшие нейтрофилов затем удаляются. Флуоресценции из оставшихся, связанного нейтрофилов затем измеряется с помощью флуоресцентного спектрофотометра, и рассчитывается как процент от общего числа нейтрофилов флуоресценции вход на лунку. Этот метод имеет то дополнительное преимущество, что связанное кальцеин меченных нейтрофилы использовали в спектрофотометрии может быть непосредственно визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы дать более качественный считываются из EC переменногоактиваций. Так как это анализ проводят в статических условиях, только очень исходных событий, которые происходят в адгезии нейтрофилов каскад будет оцениваться. Это подтверждается в этом отчет, используя E-селектину блокирующих антител, чтобы показать, что нейтрофилы соблюдение ФНО обработанных легких человека микрососудистой EC (HMVEC-Lung) монослоя резко снижается, когда взаимодействие с E-селектину нарушается.

В дополнение к ФНО, мы успешно использовали эту пробу, чтобы определить степень пупочной вены человека EC (HUVEC) активация Toll-подобный рецептор 1/2 агонисты пептидогликан связанных липопротеинов (PAL), муреин липопротеинов (MLP) и Pam3Cys и HMVEC-Lung активации Pam3Cys 19,20. Кроме того, мы успешно использовали эту пробу с ингибиторы киназы и после RNAi-обусловленный нокдаун поверхности и цитоплазматических белков в HMVEC-Lung, предполагая, что эта методика является совместимым с различными биохимическими и screeninг анализов 20. Таким образом, этот анализ предоставляет простой в использовании, воспроизводимым, более функциональный способ доступа степень активации EC воспалительными медиаторами в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Покрытие и обслуживание эндотелиальные клетки микрососудов

  1. Оттепель и развить свой эндотелиальные клетки микрососудов в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителей. В этом протоколе, клетки выращивали в EGM-2 МВ СМИ (Lonza), и рекомендуется, чтобы все эксперименты проводятся в течение двух недель оттаивания, чтобы минимизировать любые расхождения, обусловленные пассаж. Наши эксперименты с HMVEC-Lung выполняются проходы между 4 до 9.
  2. День 1: Когда клетки достигают 80-90% слияния, Trypsinize и ресуспендируйте на 120 000 клеток на мл. Пластина 36 000 клеток (0,3 мл) на лунку в 48-луночные, полистирол планшет для тканевых культур (ов). Включите скважин HMVEC, которые не будут инкубировали с нейтрофилами, чтобы получить показание фоновой флуоресценции. Если вы не используете 48-луночных планшетов, специально предназначенных для флуоресцентные анализы, чередующихся строк или столбцов не будет минимизировать любое загрязнение свет из соседних скважин. Примечание: Wells может быть предварительно покрытые поли-LysiСВ, коллагена или фибронектина.
  3. День 2: добавить свежую среду.
  4. День 3: фазово-контрастной микроскопией, подтвердить здоровые клетки (то есть "булыжника" Оформление и меньше мусора клетки), и они на 100% сливной (рис. 1). Если клетки не на 100% сливной измените носитель каждый день, пока они не будут готовы.
  5. После HMVEC монослоев готовы к обработке, промыть клетки один раз сбалансированным солевым раствором Хенка (HBSS) и добавляют 0,3 мл свежей EGM-2 сред М. или средой, содержащей воспалительных агонист в соответствующие лунки. В этом протоколе HMVEC-Lung обрабатывали TNF-[100 нг / мл] (PeproTech, Нью-Джерси) в течение 3 часов, так как это хорошо описано активатор ЭК 21. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется время вашего эксперимента, чтобы ваш активированный HMVEC клетки (шаг 4.1) и кальцеин AM помечены нейтрофилов (шаг 3.5) готовы к использованию в то же время. Это приведет нас примерно 2,5 часа, чтобы изолировать и маркировать neutrophшек.

2. Выделения нейтрофилов использованием Polymorphprep

  1. Изолят нейтрофилов, как описано выше 22, или с готовой градиенте плотности решение изолировать полиморфноядерных гранулоцитов из цельной крови. Используя Polymorphprep в соответствии с протоколом по Nuzzi и др.. Итогам 2007 года с выходом приблизительно 2-3 х 10 6 нейтрофилов на мл цельной крови 23. Примечание: Во избежание чрезмерного лизиса эритроцитов, осаждение декстрана для удаления эффекта красных кровяных клеток может быть выполнено до центрифугирования в градиенте плотности 24.
  2. Принесите Polymorphprep решение градиентом плотности до комнатной температуры.
  3. Сбор 30 мл цельной крови от здорового человека добровольцев в присутствии антикоагулянта такие как гепарин, цитрата или ЭДТК. Крови следует использовать в течение 2 часов, то и дело между 18-22 ° C.
  4. Слой 5 мл цельной крови в течение 5 мл раствора с градиентом плотности в 15 мл коническую пробирку ( Рис. 2А). Избежать изменение объема крови и решение в градиенте плотности, так как это может привести к изменению условий последующего центрифугирования.
  5. Центрифугируют при 450 х г в течение 30 мин при температуре 18-22 ° С. Убедитесь, что скорость медленно вверх и вниз центрифуге (т.е. выключить центрифуги тормоза), и баланс трубы также для предотвращения вибрации, чтобы помочь уменьшить активацию нейтрофилов и предотвращения смешивания слоев. Более центрифугирования или более центробежных сил приведет к нижней лейкоцитов слой, который содержит нейтрофилы, мигрировать дальше вниз по направлению к гранулированным эритроцитов.
  6. Аспирируйте плазму и верхние лейкоцитов полосу, содержащую МНПК в целях предотвращения загрязнения слоя, содержащего нейтрофилы (рис. 2В).
  7. Используйте 1-2 мл серологические пипетки для удаления лейкоцитов нижнего слоя, содержащего нейтрофилы. Объедините слои нейтрофилов в 30 мл PBS (без Са 2 + и Mg 2 +) в 50 млконическую трубку.
  8. Довести объем до 50 мл с PBS (без Са 2 + и Mg 2 +) и центрифуге при 450 мкг в течение 10 мин при 18-22 ° C.

Примечание: Шаги 2,9 и 2,10 являются дополнительными, но настоятельно рекомендуется.

  1. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют нейтрофилов в 8 мл стерильной воды в течение 30 секунд для лизиса эритроцитов, сразу же добавить клеточной суспензии по 2 мл 5 раз PBS (без Са 2 + и Mg 2 +) и осторожно перемешать вручную. НЕ инкубации клетки воды дольше, чем 30 секунд, так как значительная смерти нейтрофилов может произойти.
  2. Центрифуга при 250 мкг в течение 5 мин при 18-22 ° C.
  3. Промыть клетки один раз 10 мл PBS (без Са 2 + и Mg 2 +) и снова центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин при температуре 18-22 ° С.
  4. Ресуспендируют нейтрофилов в 10 мл RPMI-1640 (без фенола красного) и подсчета живых клеток с использованием трипанового голубэлектронной красителя методом исключения. Избегайте длительных периодов плотности клеток более 5 × 10 6 на мл поскольку это может привести к активации нейтрофилов.

3. Нейтрофилов маркировки Кальцеин AM

  1. 6 × 10 5 нейтрофилы использовали каждую лунку 48-луночного планшета.
  2. После подсчета, передавать клетки ресуспендировали в 50 мл коническую пробирку и разбавить нейтрофилов до 2-4 × 10 6 клеток на мл фенолового красного RPMI-1640.
  3. Добавить кальцеина AM маточного раствора до 3 мкМ (т.е. 2,98 мкл кальцеина AM наличии (1 мг / мл) на мл среды) и хорошо перемешать, осторожно слегка ударяя по пробирке. Более 5 мкм кальцеина AM приведет к утечке из нейтрофилов. Примечание: Номера флуоресцентный кальцеина AM расщепляют внутри клетки эндогенными эстераз производить очень флуоресцентной молекулы кальцеином (т.е. мертвых клеток не будет флуоресцировать).
  4. Крышка трубки с алюминиевой фольгой и инкубировать еили 30 мин при 37 ° С в темноте. Примечание: Более длительное время инкубации может привести к более кальцеин освобождается от нейтрофилов в течение адгезии анализа.
  5. Центрифуга при 450 х г в течение 5 мин при температуре 18-22 ° С, а мыть нейтрофилов 2x с 10 мл RPMI-1640 (без фенола красного; предварительно нагретой до 37 ° С). После ресуспендирования клеток на второй стирки, первый проход нейтрофилов хотя 40 мкм стерильный фильтр, чтобы удалить сгустки, а затем еще раз центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин при температуре 18-22 ° С.
  6. Ресуспендируют нейтрофилов в среде RPMI 1640 (без фенола красного; предварительно нагревали до 37 ° С) при 2 × 10 6 нейтрофилов на мл.

4. Анализ связывания нейтрофилов

  1. Промыть 3 раза HMVEC монослоев 0,5 мл стерилизованным фильтрацией (0,22 мкм), RPMI 1640 (без фенола красного), содержащем 3% БСА на лунку.
  2. Аспирируйте СМИ и добавить 6 х 10 5 кальцеин меченных нейтрофилов (0,3 мл клеточной Suspensioп) или 0,3 мл среды RPMI 1640 (без фенола красного) без нейтрофилы, в соответствующие лунки 48-луночного планшета. Примечание: Это эквивалент 8 × 10 5 нейтрофилов на см 2.
  3. Выдержите в течение 20 мин при 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
  4. Общее число нейтрофилов флуоресценцию (Предварительная стирка): Измерение интенсивности флуоресценции каждой лунки с длиной волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 520 нм (флуоресцеина набор фильтров) в Fluostar, или эквивалент, спектрофотометр. Этот шаг выполняется только до конечной точки инкубации Примечание: В этом протоколе кальцеин возбуждения и обнаружения излучаемого света были выполнены из верхней части обнаружили скважин, однако, и также может быть выполнена из нижней части скважины..
  5. Промойте лунки, содержащие HMVEC монослоя и нейтрофилов 5x 0,5 мл на лунку PBS (Вт / Ca 2 + и Mg 2 +). Выньте носители и промывныеопрокидыванием планшета и мягкими похлопывающими движениями на бумажные полотенца, чтобы удалить остатки жидкости.
  6. Плюс 0,3 мл RPMI 1640 (без фенола красного) на лунку.
  7. Адгезивные нейтрофилов флуоресценции (POST стирка): Измерение интенсивности флуоресценции каждой лунки, как на стадии 4.4.
  8. Определить соблюдение процентов и относительных соблюдение на гнездо:

Примечание: На этом этапе изображения кальцеин меченных нейтрофилов может быть получено с помощью флуоресцентного микроскопа, оборудованного способный со стандартными фильтрами флуоресцеина. Изображения на рисунке 4 были получены на Olympus IX51 инвертированный микроскоп оснащен камерой Retiga 2000R (Q Imaging) использованием Q-Capture Pro7 программного обеспечения (Q Imaging).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того чтобы получить надежные и воспроизводимые результаты помощью анализа связывания нейтрофилов, важно, что здоровье и слияния на эндотелиальные клетки микрососудов являются оптимальными на день анализа, как показано с HMVEC-Lung на рисунке 1. Кроме того, крайне важно, чтобы низкий пассаж микрососудистые ЭК используются (то есть меньше, чем 9 проходов) и, соответственно, мы рекомендуем выполнять все эксперименты в течение двух недель оттаивания. Здоровье нейтрофилов также предельное значен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важных шагов для успешной нейтрофилов / эндотелия микрососудов анализа клеточной адгезии являются: 1) использование небольшого числа проход (<9), здоровым клеткам эндотелия; 2) Обслуживание изолированных нейтрофилов при низкой плотности (то есть <5 х 10 6 клеток / мл), и их использование в течение двух часов изоляции, и 3) Привередливый промывки кальцеина AM-меченый нейтрофилов и использование кальцеина AM-меченый нейтрофилов своевременно, чтобы минимизировать EC загрязнение и потери к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Департаментом UCSF анестезии и интраоперационной помощи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HMVEC-LungLonzaCC-2527
EGM-2 MVLonzaCC-3202
HBSSLife Technologies14175-095Может быть заменен любым поставщиком
48-луночные планшеты для культуры тканейBD Falcon353078
PBS (без фенолового красного)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL001может быть заменен любым поставщиком
D-PBS (без Ca2+ и Mg2+ и фенолового красного)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL003может быть заменен любым поставщиком
RPMI-1640 (без фенолового красного)Life Technologies11835-030
PolymorphprepAxis-Shield1114683
кальцеина AMLife TechnologiesC3099(0,995 мМ) сток soln
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
40 μ M фильтрыVWR21008-949Могут быть заменены на
FLUOstar OPTIMA любого производителя СпектрофотометрBMG LABTECH.

Ссылки

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745(2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410(2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Активация эндотелиальных клетокмаркировка Calcein AMфлуоресцентная спектрофотометрияфлуоресцентная микроскопиявыделение нейтрофиловPolymorph Prepобработка TNF-альфаингибирование P38 MAPK
Количественный
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.