Одновременное Многоцветный изображений биологических структур с флуоресцентной фотоактивации локализации микроскопии

Summary

Мы демонстрируем использование флуоресцентной фотоактивационной микроскопии локализации (FPALM) для одновременного изображения нескольких типов флуоресцентно меченных молекул в клетках. Описанные методы позволяют локализовать от тысяч до сотен тысяч отдельных флуоресцентных меченых белков с точностью до десятков нанометров в пределах отдельных клеток.

Abstract

Микроскопия сверхвысокого разрешения на основе локализации может быть применена для получения пространственной карты (изображения) распределения отдельных флуоресцентно меченых одиночных молекул в образце с пространственным разрешением в десятки нанометров. Используя либо фотоактивируемые (PAFP), либо фотопереключаемые (PSFP) флуоресцентные белки, слитые с представляющими интерес белками, или органические красители, конъюгированные с антителами или другими молекулами, представляющими интерес, флуоресцентная фотоактивационная локализация микроскопия (FPALM) может одновременно визуализировать несколько видов молекул в отдельных клетках. Используя следующий подход, популяции большого числа (от тысяч до сотен тысяч) отдельных молекул визуализируются в отдельных клетках и локализуются с точностью ~10-30 нм. Полученные данные могут быть применены для понимания наноразмерных пространственных распределений нескольких типов белков в клетке. Одним из основных преимуществ этого метода является резкое увеличение пространственного разрешения: в то время как дифракция ограничивает разрешение до ~200-250 нм в обычной световой микроскопии, FPALM может получать изображения в масштабах длины более чем на порядок меньше. Поскольку многие биологические гипотезы касаются пространственных отношений между различными биомолекулами, улучшенное разрешение FPALM может дать представление о вопросах клеточной организации, которые ранее были недоступны для традиционной флуоресцентной микроскопии. В дополнение к подробному описанию методов пробоподготовки и сбора данных, мы опишем здесь оптическую установку для FPALM. Еще одним фактором для исследователей, желающих проводить микроскопию со сверхвысоким разрешением, является стоимость: собственные установки значительно дешевле, чем большинство коммерчески доступных машин для визуализации. Ограничения этого метода включают необходимость оптимизации маркировки интересующих молекул в образцах клеток, а также потребность в программном обеспечении для последующей обработки для визуализации результатов. В данной работе мы описываем использование экспрессии PAFP и PSFP для визуализации двух видов белков в фиксированных клетках. Также описывается распространение метода на живые клетки.

Introduction

В то время как клеточные структуры существуют в широком диапазоне пространственных масштабов, флуоресцентная визуализация клеточной организации на масштабах длины менее ~250 нм ограничена в обычной микроскопии из-за физического ограничения дифракционного предела. Этот предел был преодолен с появлением флуоресцентной фотоактивационной локализионной микроскопии (FPALM¹) и аналогичных методов^2,3, которые позволяют локализовать большое количество отдельных молекул с точностью ~10 нм, для получения изображений с разрешением в несколько десятков нанометров. FPALM основан на использовании оптического управления для активации и инактивации подмножеств молекул (полное описание FPALM и инструкции по реализации этой системы визуализации см. в Gould et al.^{4). Этот} метод позволяет картировать пространственное распределение целых популяций отдельных молекул, тем самым проясняя биологические структуры в масштабах от десятков нанометров до десятков микрон. Микроскопия сверхвысокого разрешения, основанная на локализации (далее именуемая локализационной микроскопией), в настоящее время адаптирована для решения ряда биологических вопросов, при этом технологические разработки позволяют, например, визуализировать индивидуальные молекулярные ориентации с помощью поляризационного FPALM или P-FPALM⁵, флуоресцентную визуализацию одиночных молекул в трех измерениях с помощью Biplane FPALM⁶ или других методов^7-9, и флуоресцентная визуализация одиночных молекул в живых клетках со сверхвысоким разрешением^10-12. Локализационная микроскопия также применяется для визуализации множественных видов в неподвижных клетках^13-16. В последнее время с помощью FPALM были одновременно визуализированы три вида белков как в фиксированных, так и в живых клетках¹⁷. Локализационная микроскопия позволяет визуализировать образцы, помеченные различными способами: Примеры включают белки, экспрессируемые с помощью меток PAFP или PSFP, антитела или молекулы, меченные органическими красителями в клетке, или обычные органические красители. В то время как использование обычных флуоресцентных красителей позволяет мечить белки в отсутствие метки гибридного белка, условия, обычно необходимые для использования органических красителей без клеток в визуализации сверхвысокого разрешения, требуют погружения образцов в восстанавливающие буферы². Кроме того, внутриклеточная доставка конъюгатов антитело-краситель обычно требует фиксации клеток и проникновения их мембран, или требует, чтобы живые клетки были сделаны проницаемыми с помощью электропорации или каким-либо другим способом. Требования к снижению буферных условий и проницаемости мембраны ограничивают пригодность органических красителей для визуализации живых клеток, хотя последние разработки позволили эффективно использовать HaloTags и FPALM для визуализации мембранных структур

.

FPALM был первым методом локализации микроскопии, примененным к живым клеткам¹⁰. В живых клетках, в дополнение к предоставлению зависимой от времени пространственной карты расположения меченых молекул, FPALM может отслеживать отдельные молекулы в нескольких кадрах, а молекулярные траектории определяются в масштабах миллисекунд¹⁹. Таким образом, FPALM обеспечивает доступ к довольно коротким временным масштабам и наноразмерному разрешению.

Multicolor FPALM можно использовать для множества различных зондов, включая фотоактивируемые белки и органические или неконтролируемые красители. Здесь мы подробно описываем протокол и настройку для одновременной визуализации двух видов флуоресцентных белков, Dendra2 и PAmCherry. Мы сообщаем о результатах визуализации PAmCherry, конъюгированного с бета-актином (PAmCherry-actin) и Dendra2, конъюгированным с гемагглютинином гриппа (Dendra2-HA) в фибробластах NIH-3T3. Компоненты, описанные в настройке, можно заменить на другое оборудование, более подходящее для визуализации других датчиков. В этом случае мы постарались быть ясными в тексте.

Multicolor FPALM идеально подходит для сообщения о пространственном распределении нескольких видов белков в живых или фиксированных клетках. Этот метод особенно подходит для исследования пространственных и/или динамических отношений в нанометровых пространственных масштабах, хотя изображения будут сообщать о локализации в диапазоне длин, от десятков нанометров до десятков микрон. Одним из основных преимуществ многоцветного FPALM является то, что установка относительно недорога в изготовлении и очень гибкая для использования с различными комбинациями датчиков. Процесс построения и калибровки системы из компонентов также обеспечивает значительное понимание факторов, которые могут поставить под угрозу качество и интерпретируемость данных, а значит, и результаты исследования. В данной статье мы подробно описываем методы оптической настройки, пробоподготовки и сбора данных о нескольких видах белков с помощью конструкций слияния PSFP и PAFP с использованием FPALM. В то время как этот протокол описывает анализ неподвижных клеток, эти процедуры легко применимы для визуализации живых клеток.

Описанная здесь оптическая установка идеально подходит для одновременной визуализации PSFP Dendra2 и PAFP PAmCherry. Многие другие датчики могут использоваться для многоцветной визуализации; Однако требуемые точные компоненты могут варьироваться в зависимости от спектров возбуждения и излучения выбранных зондов. Выбор дихроичных зеркал, фильтров и длин волн лазера должен быть сделан на основе этих соображений.

Protocol

Обратите внимание: Схематическое представление оптических компонентов, на которые ссылается этот протокол, можно найти на рисунке 1.

1. Подготовка образцов клеток

1. Пластинчатые ячейки с оптимизированной плотностью (для ячеек NIH-3T3 это примерно 2-5 х 10⁴ ячейки/^см2) в лунках 8-луночной камеры. Клетки должны быть покрыты сплошной средой, соответствующей типу клеток, хотя среды должны быть изготовлены без антибиотиков и без фенолового красного, который способствует фоновой флуоресценции. Обратите внимание, что условия для экспериментов с клетками, такие как оптимальный диапазон номеров пассажей, могут отличаться для отдельных клеточных линий.
2. Инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 °C и 5%_CO2 (или в условиях, соответствующих типу клеток), чтобы клетки могли прилипнуть к покровному стеклу. Трансфектировать клетки свободной ДНК эндотоксина для каждого из двух видов белковых конструкций (в данном случае ДНК для PAmCherry-актина и Dendra2-HA). Накройте образец светонепроницаемым материалом, таким как алюминиевая фольга. Трансфекция должна включать лунки с обоими конструктами ДНК, а также лунки только с одной из этих конструкций.
3. Инкубируйте в течение 4-6 часов, при 37 °C и 5%_CO2 (или в условиях, соответствующих типу клеток), прежде чем перейти на полноценную среду (с антибиотиками, без фенолового красного) и далее инкубировать в течение 16-48 часов, чтобы позволить клеткам экспрессировать желаемые белки.
   1. Клетки можно зафиксировать путем трехкратной промывки фосфатно-соевым буфером (PBS), затем инкубации с 4% параформальдегидом (PFA) (ВНИМАНИЕ: Токсично) в PBS в течение 15 минут при RT, а затем еще 3-кратной промывкой PBS. Однако, в зависимости от интересующих белков, эта фиксация может привести к образованию значительного пула помеченных молекул, которые все еще подвижны. Для дальнейшего снижения подвижности альтернативные методы фиксации включают использование охлажденного 100% метанола или 0,2% глутеральдегида и 4% PFA в PBS в течение >30 мин при 25 °C²⁰. В любом из этих методов клетки следует промывать PBS, как описано выше. Следует отметить, что использование глутеральдегида может увеличить фоновую флуоресценцию или аутофлуоресценцию при некоторых условиях визуализации и может потребовать постфиксационной обработки борогидридом^{натрия 21}.
4. Образец можно хранить при температуре 4 °C, погрузив в PBS, запечатанный в самогерметизирующуюся пленку, в течение 7 дней перед визуализацией.

2. Юстировка микроскопа

1. Поместите калибровочную шкалу (прицельную сетку) на предметный столик микроскопа. Используя 10-кратный объектив и лампу для пропускаемого света, отцентрируйте прицельную сетку в центре поля зрения (FOV).
2. Иллюминация Кёлера. Отрегулируйте микроскоп по Кёлерову²². Для начала закройте диафрагму поля и, глядя в окуляр, сфокусируйтесь на прицельной сетке. Если края диафрагмы поля не сфокусированы, отрегулируйте высоту конденсора до тех пор, пока и апертура поля, и прицельная сетка не окажутся в фокусе.
3. Отрегулируйте боковое положение апертуры поля зрения до тех пор, пока она не будет центрирована по отношению к полю обзора. Закройте отверстие в поле до тех пор, пока не загорится только центральная сетка на прицельной сетке.
4. Для грубой юстировки положения камеры (т.е. при первом выравнивании установки) используйте лампу высокой интенсивности при закрытом затворе камеры и не размещайте какие-либо компоненты в коробке B (рис. 1) в оптическом тракте до тех пор, пока не будет достигнут шаг 2.5. Не размещайте L2 и L3 в тракте обнаружения при первом выравнивании камеры. Примерно отцентрируйте изображение прицельной сетки на затворе камеры, регулируя вертикальное и горизонтальное положение камеры (рис. 2B). Отключите усиление ЭМ, выключите освещение в комнате и откройте затвор камеры.
5. После снижения интенсивности лампы до уровня, который не повредит датчик камеры, проецируйте свет от изображения прицельной сетки непосредственно на датчик камеры (рис. 2A). Сфокусируйте прицельную сетку, отрегулировав ручку фокусировки микроскопа во время просмотра изображения в режиме живого видео в программном обеспечении для сбора данных. Центрируйте изображение прицельной сетки по сенсору камеры, регулируя вертикальное и горизонтальное положение камеры (рис. 2B).
6. Поместите L2 и L3 в путь обнаружения между диафрагмой и камерой (рис. 2C). Выровняйте L2 и L3 таким образом, чтобы L2 находился на расстоянии одного фокусного расстояния от точки фокусировки выходного отверстия микроскопа, а L3 — на расстоянии одного фокусного расстояния от сенсора камеры. Расстояние между L2 и L3 в идеале должно быть равно сумме фокусных расстояний L2 и L3, но может быть несколько скорректировано в соответствии с ограничениями пространства. Камера и объективы должны находиться на той же высоте, что и выходной порт.
7. Обратите внимание, что свет, излучаемый микроскопом, должен быть центрирован на L2 и L3. Отрегулируйте расстояние между ячейкой L2 и микроскопом, чтобы изображение прицельной сетки было четко сфокусировано как на камере, так и через окуляр.
8. При необходимости можно использовать небольшие сдвиги (например, <1 мм) L2 и L3 для центрирования изображения прицельной сетки на сенсоре камеры.
9. Двухцветный модуль. После оптимизации положения камеры прикрепите компоненты, показанные в поле B (рис. 1), к пути обнаружения. Эти компоненты могут быть прикреплены к съемному креплению, так что весь модуль может быть вставлен для многоцветного FPALM, или снят для других приложений FPALM, не требующих этого.
10. При первой сборке этих компонентов отрегулируйте длину пути каждого канала, чтобы она была одинаковой. Спроецируйте прицельную сетку на микросхему камеры, отрегулируйте M7 и M9 и/или закройте апертуру обнаружения (AP), чтобы предотвратить пространственное перекрытие между двумя каналами. Сфокусируйте изображение прицельной сетки в отраженном световом канале.
11. Если изображение в проходящем световом канале не находится в фокусе, перемещайте M9 (и при необходимости поворачивайте) до тех пор, пока изображение прицельной сетки не окажется в фокусе одновременно в обоих каналах. Обратите внимание, что два канала должны быть смещены друг от друга в поперечном направлении (Рисунок 2D). Это смещение, будь то горизонтальное или вертикальное, может повлиять на скорость сбора данных. Для получения дополнительной информации обратитесь к руководству пользователя фотокамеры.
12. Запишите снимок шкалы прицельной сетки (чтобы позже использовать его при расчете общего увеличения). С помощью программного обеспечения камеры выберите нужную область интереса. Более высокая частота кадров, как правило, возможна для небольшой области интереса.

3. Лазерная юстировка

1. Включите считывание и активацию лазеров. (ВНИМАНИЕ: Лазеры следует использовать только после того, как операторы прошли обучение по технике безопасности работы с лазерами.) Все двери в лабораторию должны оставаться закрытыми, а во время юстировки лазеров в лаборатории должен находиться только обученный персонал. Используйте затворы SH1 и SH2 для блокировки считывающего и активирующего лучей соответственно, когда они не используются, и нейтральные фильтры для ослабления мощности лазера до безопасного уровня (<1 мВт). Полезно свести к минимуму все освещение помещения во время выравнивания, за исключением освещения, необходимого для безопасности.
2. Заблокируйте лучи активации и считывания. Удалите L1 с траектории лазерного излучения.
3. Положите белую карту вровень с M4. Большинство коммерческих составных микроскопов имеют встроенный затвор для блокировки входящего света. Если возможно, откройте затвор микроскопа и сфокусируйтесь до тех пор, пока изображение прицельной сетки не спроецируется на M4. Если внутренний затвор микроскопа недоступен, используйте внешний затвор в удобном месте, который блокирует попадание всех лазерных лучей в микроскоп.
4. Центрирующий лазер считывания в поле зрения. Разблокируйте луч считывания. Центрируйте считывающий луч на перекрестии изображения прицельной сетки на M4, регулируя M1.
5. Спроецируйте изображение прицельной сетки на M5 и настройте зеркальное отражение M4 до тех пор, пока луч не будет центрирован на перекрестии изображения на M5 таким образом, чтобы считывающий луч был центрирован с перекрестием прицельной сетки как в M4, так и в M5. Заблокируйте луч считывания.
6. Центрирование активационного лазера в поле зрения. Проецируйте изображение прицельной сетки на M3 и удалите расширитель луча (BE) из траектории лазера. Разблокируйте луч активации.
7. Отрегулируйте M2, чтобы центрировать активационный луч на перекрестии изображения прицельной сетки на M3. После центрирования установите БЭ между M2 и M3 и отрегулируйте положение БЭ до тех пор, пока луч не будет центрирован на перекрестии изображения прицельной сетки на M3.
8. Используя объектив с 10-кратным увеличением, спроецируйте изображение прицельной сетки на M5, при необходимости регулируя ручку фокусировки микроскопа для получения фокуса. Отрегулируйте угол DM1 до тех пор, пока луч активации не будет центрирован на изображении прицельной сетки. Заблокируйте оба луча.
9. Не устанавливая объектива и открыв затвор микроскопа, проецируйте считывающий лазер через заднюю апертуру микроскопа. (ВНИМАНИЕ: Этот шаг создает угрозу безопасности лазера, направляя параллельный лазерный луч по незаблокированной вертикальной траектории.) Регулируйте M5 до тех пор, пока луч не выйдет прямо из микроскопа и не упадет на потолок прямо над ним или не будет центрирован на карте, размещенной на креплении объектива в турели.
10. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Определение правильного выравнивания может быть облегчено использованием образца красителя в растворе (в данном случае родамина B при ~100 мкМ в воде или метанола глубиной >0,5 см для визуальных целей), помещенного на предметный столик с 60-кратным объективом. Если луч правильно выровнен, объектив будет проецировать конус флуоресценции, выровненный по оси объектива и микроскопа. Небольшие отклонения в размещении лазерного луча в задней апертуре объектива приведут к тому, что конус отклонится от чисто вертикального выравнивания.
11. Заблокируйте оба луча. Установите L1 в лазерный тракт на соответствующем расстоянии (т.е. на одно фокусное расстояние) от задней апертуры объектива. Установив объектив 60X, позвольте считывающему лучу проецироваться на потолок. Отрегулируйте горизонтальное и вертикальное положение L1 (перпендикулярно направлению распространения лазера) до тех пор, пока луч не будет центрирован над микроскопом. Примечание: на этом шаге луч образует большее пятно, чем на предыдущем шаге.
12. Осевое положение L1 и его фокусное расстояние будут влиять на размер освещаемой области на образце. Строго говоря, расчет профиля освещенности образца должен учитывать дифракцию²³. Грубо говоря, однако, размещение L1 на осевом расстоянии, отличном на одно фокусное расстояние от задней фокальной плоскости объектива, во многих случаях приведет к меньшему, более интенсивному лазерному профилю освещения, чем когда L1 находится ровно на одно фокусное расстояние от задней фокальной плоскости. Меньшая освещенная область может быть использована для создания более высокой интенсивности лазера для определенных приложений, таких как высокоскоростная визуализация, например.
13. Измерение профиля луча считывания. Установив L1, поместите на сцену образец соответствующего концентрированного раствора красителя (в данном случае родамина B в концентрации ~100 мкМ в воде).
14. Когда активационный лазер заблокирован, спроецируйте считывающий лазер (отрегулируйте ND1 для получения мощности <<1 мВт для всех экспонируемых лучей) через объектив 60X на краситель и (с отключенным усилением ЭМ) отправьте это изображение в камеру.
15. Сфокусируйте объектив на образце. Для этого шага требуется достаточно большая апертура, позволяющая получить изображение профиля полного луча.
16. Переместите AP в горизонтальное положение так, чтобы центр профиля луча и AP были концентрическими. С помощью программного обеспечения камеры выберите интересующую область, чтобы обеспечить наименьшую область считывания камеры, охватывающую оба канала. Запишите эти координаты. Запишите один снимок (это профиль считываемого луча).
17. Изображения, которые более точно отражают профиль лазера в фокальной плоскости, будут получены, когда образец раствора красителя будет как можно более тонким. Такой тонкий образец можно создать, поместив каплю ~5 мкл раствора красителя между предметным стеклом микроскопа и покровным стеклом.
18. Измерение профиля активационного луча. Блокировка считывающего лазера. Проецируйте активационный лазер на образец; и проецируйте это изображение на камеру.
19. При необходимости используйте усиление ЭМ <100 и регулируйте DM1 до тех пор, пока луч не будет центрирован в каждом поле зрения. Запишите моментальный снимок профиля луча активации.
20. Измерьте мощность каждого луча. Удалите раствор красителя и поместите датчик измерителя мощности над объективом 60X (без иммерсионного носителя). Измерьте мощность каждого луча (активации и считывания) отдельно. Обратите внимание, что положение измерителя мощности должно быть тщательно отрегулировано, чтобы гарантировать, что вся излучаемая мощность лазера попадает на датчик измерителя мощности.
21. Для каждого лазера используйте фильтры нейтральной плотности (ND1 и ND2) для регулировки мощности в соответствии с интенсивностью образца, подходящего для эксперимента.
22. Интенсивность считывающего лазера для получения изображений. Интенсивность считывающего лазера должна быть достаточно высокой, чтобы возбуждать и фотоотбеливать отдельные молекулы в течение нескольких кадров. Типичные значения составляют 10,^3-10,⁴ Вт/^см2 (см. также Gould et al.⁴). Интенсивность на образце зависит от размера области изображения, поэтому мощность, необходимая для достижения желаемой интенсивности, будет варьироваться от системы к системе.
23. Интенсивность активации лазера. Интенсивность активационного лазера должна быть выбрана таким образом, чтобы число активных молекул было небольшим (например, 1-100) в любой заданной системе регистрации. Грубо говоря, желаемая плотность достигается, когда минимальное расстояние между активными молекулами немного больше, чем дифракционное ограниченное разрешение (см. также раздел 6, Визуализация). По мере уменьшения популяции неактивных одиночных молекул требуются более высокие интенсивности активационного лазера. Типичная интенсивность составляет ^{10-1-10 2} Вт/^см2.
24. Оптимизируйте четвертьволновую пластину. Четвертьволновая пластина (QWP) не является обязательной, но увеличение степени круговой поляризации считывающего и активационного лазеров с помощью QWP может увеличить плотность молекул на конечных изображениях. Чтобы оптимизировать QWP, поместите поляризатор между QWP и M5. Заблокируйте активацию лазера. Проецируйте считывающий лазер на измеритель мощности на сухой объектив 60X.
25. Запишите угол QWP. Отрегулируйте поляризатор до максимума, а затем будут достигнуты минимальные мощности. Запишите каждое из этих значений и рассчитайте соотношение минимума/максимума. Отрегулируйте угол QWP и повторите эти измерения. В то время как желательно получать значения, близкие к 1,0, для визуализации достаточно соотношения >0,8.

4. Создание прочного образца бусин для выравнивания каналов

1. Разбавьте образец флуоресцентных шариков (диаметром от 40-100 нм) в соотношении 1:70 в воде класса ВЭЖХ. Далее разбавьте этот стоковый раствор в соотношении 1:15 в воде ВЭЖХ, до конечного объема 200 мкл суспензии гранул в воде.
2. Нанесите покровное покрытие жидким поли-L-лизином. Инкубировать при RT в течение 30 минут. Отсадите, чтобы удалить раствор, и промойте покровное стекло трижды водой класса ВЭЖХ. Отсасывайте все следы воды от покровного стекла и оставьте сохнуть при RT.
3. Пипеткой нанесите 200 мкл шариковой суспензии на покровное стекло. Оставьте этот покровный лист на 20 минут при температуре RT, прежде чем трижды промыть водой ВЭЖХ. В качестве альтернативы оставьте покровное стекло O/N в положении RT, чтобы суспензия высохла.
4. Используя ~20 μл воды ВЭЖХ или монтажной среды, установите защитное стекло на предметное стекло. Запечатайте периферию покровного стекла прозрачным лаком для ногтей. После того, как полироль высохнет, поместите покровное стекло (и соответствующий фильтрующий материал для объектива; воду или масло) на объектив 60X.

5. Получение изображений: образец бисера для выравнивания каналов обнаружения

1. Осветите образец шарика считывающим лазерным лучом с интенсивностью примерно в 10 раз ниже, чем будет использоваться для визуализации. Установив усиление ЭМ на 100, проецируйте изображение на камеру и регулируйте фокус до тех пор, пока в обоих каналах не станут видны бусины.
2. Если шарики тусклые, увеличьте либо мощность лазера, либо усиление ЭМ. Минимизация шума в изображениях бусин (за счет детектирования большого количества фотонов, т.е. не менее 5000 всего от каждой бусины) имеет решающее значение для точной регистрации канала. Настройте камеру на запись 100 кадров с тем же временем экспозиции, которое будет использоваться для последующих изображений FPALM.
3. Ищите области, где бусины распределены как в центре, так и по периферии каналов, и где плотность бусин достаточно низкая, чтобы отдельные бусины были хорошо разделены и могли быть идентифицированы по отдельности.
4. Получите от 10 до 20 наборов изображений различных областей с этой плотностью гранул. Подробные сведения об использовании изображений бортов для калибровки каналов см. в разделе «Результаты».

6. Получение изображения: Multicolor FPALM

1. Важно визуализировать клетки, которые были трансфицированы только с одной из каждой из конструкций, а также записывать изображения клеток со всеми конструкциями. Эти данные помогут в построении альфа-гистограмм каждого из используемых зондов и необходимы для интерпретации многоцветных данных.
2. Найдите ячейки, экспрессирующие фотопереключаемые зонды, если они используются. Исключите все освещение в комнате. Спроецируйте ртутную лампу с помощью откидного крепления (FM) на образец (содержащий трансфицированные клетки). Замените куб револьверного фильтра на куб, содержащий соответствующую комбинацию дихроичного зеркала/фильтра, чтобы обеспечить возбуждение предварительно фотокоммутируемого состояния метки. Например, для визуализации предварительно фотокоммутируемого Dendra2 или зондов с зеленым предварительно коммутируемым излучением, одним из вариантов для DM4 является дихроичный, отражающий синий свет (<488 нм), а для F5 — фильтр, пропускающий свет от ~500-570 нм, блокируя свет за пределами этого диапазона.
3. С помощью окуляра найдите клетки, которые экспрессируют предварительно отфотосоотвергнутый зонд. Например, клетки, экспрессирующие Dendra2, будут отображаться зеленым цветом. Обратите внимание, что не все преобразователи являются фотопереключаемыми, и, в зависимости от их предварительно коммутируемых спектров излучения, для тех, которые являются таковыми, могут потребоваться комбинации DM4/F5, отличные от перечисленных здесь.
4. После того, как ячейка выбрана, переместите FM вниз, чтобы позволить лазерам пройти в микроскоп (блокируйте ртутный свет от пути). Замените револьверную головку фильтра на ту, которая содержит подходящий дихроичный для визуализации (в этом случае DM2 должен отражать как считывающий, так и активационный лазер, пропуская при этом более длинные волны, а F1 должен передавать длины волн в красный цвет лазера и в идеале иметь высокую степень подавления на длине волны лазера).
5. Если клетки не экспрессируют фотопереключаемый зонд, ищите ячейки, проецируя изображение на камеру и используя считывающий лазер для освещения образца. Отдельные молекулы, вероятно, будут видны (см. рисунок 3) во многих клетках.
6. Чтобы отличить трансфицированные клетки от фоновой флуоресценции (которая все еще может проявляться в виде отдельных мигающих молекул) и подтвердить, что молекулы фотоактивируются, кратковременно осветите образец с помощью лазера активации низкой мощности (обычно порядка микроватт). Количество фотоактивируемых молекул, видимых под считывающим лучом, должно резко увеличиться и оставаться высоким в течение короткого времени даже после того, как активационное освещение будет снова заблокировано. Обратите внимание, что разные зонды могут значительно различаться по своей яркости, эффективности фотопреобразования и мощности лазера, необходимой для активации^24-27.
7. Подготовьте программное обеспечение камеры к серийной съемке кинетических серий, установив коэффициент усиления ЭМ на 200 и выбрав желаемое количество кадров (обычно 5 000-10 000) и время экспозиции (обычно рекомендуется 10-30 мс). В то время как коэффициент усиления ЭМ может быть установлен выше 200, после определенного момента увеличение коэффициента усиления ЭМ может привести к увеличению шума.
8. Заблокируйте луч активации. Разблокируйте луч считывания и спроецируйте изображение освещенной ячейки на камеру.
9. Убедитесь, что клетка трансфицирована (шаг 6.6). Во время просмотра клетки регулируйте фокус до тех пор, пока в поле зрения не появится нужная фокальная плоскость, а молекулы не окажутся в четком фокусе.
10. Чтобы выбрать фокальную плоскость, которая будет отображать изображение вблизи нижней клеточной мембраны, сместите фокус вниз до тех пор, пока отдельные молекулы не перестанут быть видны. Затем постепенно перемещайте фокус вверх, пока молекулы не станут впервые видимыми.
11. Чтобы получить изображение вблизи верхней клеточной мембраны, продолжайте смещать фокус вверх на желаемую величину, отмечая расстояние с помощью ручки фокусировки микроскопа или автоматической фокусировки. Выбор области фокусировки между этими двумя пределами приведет к тому, что область будет находиться в центре клетки, для которой будет получено изображение.
12. Разблокируйте активирующий луч и осветите образец с низкой интенсивностью (используйте фильтры ND2 для ослабления луча до очень низкой интенсивности, примерно <1 Вт/^см2 на образце).
13. Начните сбор данных. Желательна высокая плотность активных молекул; Однако для этапов анализа крайне важно, чтобы эти молекулы не перекрывались пространственно.
14. Попытайтесь поддерживать плотность видимых фотоактивируемых молекул ~0,1-1 ^мкм-2 путем регулировки ND2. Как правило, для области изображения диаметром ~10-20 мкм одновременно будет видно ~10-100 молекул (для справки см. рисунки 3 и 4). Поскольку количество оставшихся неактивных молекул уменьшается в ходе регистрации, мощность активационного лазера может потребоваться постепенно увеличивать для поддержания плотности.
15. Если требуется визуализация TIRF*, M5 и L1 должны быть установлены на одном столике для трансляции (TS, рис. 1) и перемещаться в горизонтальном направлении (т. е. в направлении, перпендикулярном лазеру сразу за входом в микроскоп). По мере перемещения M5 и L1 лазеры, выходящие из объектива вверх через образец, будут постепенно наклоняться в одну сторону (ВНИМАНИЕ: угроза безопасности лазера).
16. Когда угол наклона лазеров достигает 90° от вертикали, сам возникающий лазер исчезает, входящий лазер считывания будет отражаться обратно, появляясь в виде луча, выходящего из задней апертуры объектива, антипараллельного входящему лучу, и смещенного в сторону.
17. В то же время фоновая флуоресценция станет почти полностью ослабленной, и толщина области образца, содержащей различимые, сфокусированные одиночные молекулы, значительно уменьшится.
    *TIRF позволит получить изображение тонкого участка образца, который находится на ~100-500 нм выше покровного стекла. Изображение фокальных плоскостей, которые находятся дальше в образце, легко достигается с помощью широкопольного освещения (раздел 3), но не подходит для TIRF.
    
18. По завершении съемки немедленно закройте затвор микроскопа и заблокируйте оба луча. Отключите усиление ЭМ, настройте камеру на запись одного кадра и установите максимальный размер области считывания камеры.
19. Заблокируйте один канал, поместив карту поверх F3 или F4. С помощью длинночастотного фильтра (>580 нм), установленного на лампе микроскопа, осветите образец и проецируйте это изображение на камеру. Запишите снимок ячейки.
20. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Когда один канал все еще заблокирован, откройте апертуру так, чтобы большая площадь образца была видна благодаря проходящему световому освещению. Запишите моментальный снимок. Эти изображения в проходящем свете очень полезны для просмотра контекста соответствующих изображений FPALM.
21. Визуализация живых клеток. Чтобы получить изображение живых клеток, трансфектируйте клетки в соответствии с шагами 1.1-1.3, но не фиксируйте эти образцы. Вместо этого полностью выровняйте установку, как описано выше, но перед визуализацией образцов удалите их при температуре 37 °C и 5%_CO2, промойте 3x в PBS и погрузите образец в среду визуализации (например, PBS с глюкозой 20 мМ). Удаление питательных сред и промывка уменьшит фон, связанный с большинством клеточных сред.
22. При желании образцы могут быть визуализированы в режиме ОТ, как в случае с фиксированными клетками, или при 37 °C и 5%_CO2 с использованием инкубационного столика, установленного на предметном столике микроскопа. Один образец клеток NIH 3T3 должен быть погружен в среду визуализации не более чем на 1 час. Может быть полезно следить за тем, как клетки реагируют на погружение в визуализирующие среды, прежде чем готовиться к экспериментам такого рода, чтобы оптимизировать время погружения и, возможно, состав визуализирующих сред для уменьшения возмущения клеток.

Results

Гемагглютинин гриппа (HA) образует кластеры порядка от десятков нанометров до микрометров, и эти кластеры вариабельно колокализуются с актином (Рисунок 5). Эти пространственные распределения подтверждают более грубую визуализацию этих двух белков²⁸ и зависимость пространственных распределений HA от актина¹⁹. Многоцветные изображения FPALM могут быть дополнительно использованы для описания плотности, площади и периметра этих кластеров, а также степени колокализации между двумя видами...

Discussion

Визуализация сверхвысокого разрешения на основе локализации предоставляет множество мощных возможностей для биологической визуализации. Переход от отдельных оптических компонентов, размещенных на столе, к функциональному микроскопу сверхвысокого разрешения, способному одновременно визуализировать несколько флуоресцентных веществ в биологическом образце, сопряжен с рядом проблем. Некоторые аспекты выравнивания более важны, чем другие; Ниже мы постараемся предоставить рекомендации потенциальным пользователям, имеющим дело ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Камеры LabTek II Nunc
Флуоресцентные бусины	Invitrogen	F-8801	Бусины для калибровки Бусины
Tetraspeck	Invitrogen	T-7279	Четырехцветные бусины для калибровки
Объектив Иммерсионное масло	Zeiss	518F	Иммерсионное масло для высокого NA объектива (в зависимости от выбора объектива)
ВЭЖХ вода	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	Or Cellgro 10-090
Антибиотики	GIBCO	15070-063
сыворотка	Thermo Scientific	SH30087.03
Липофектамин	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Трипсин	MPBiomedicals
параформальдегид	Fisher Scientific	AA433689M	ВНИМАНИЕ: Токсичен