$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Микроскопия сверхвысокого разрешения на основе локализации может быть применена для получения пространственной карты (изображения) распределения отдельных флуоресцентно меченых одиночных молекул в образце с пространственным разрешением в десятки нанометров. Используя либо фотоактивируемые (PAFP), либо фотопереключаемые (PSFP) флуоресцентные белки, слитые с представляющими интерес белками, или органические красители, конъюгированные с антителами или другими молекулами, представляющими интерес, флуоресцентная фотоактивационная локализация микроскопия (FPALM) может одновременно визуализировать несколько видов молекул в отдельных клетках. Используя следующий подход, популяции большого числа (от тысяч до сотен тысяч) отдельных молекул визуализируются в отдельных клетках и локализуются с точностью ~10-30 нм. Полученные данные могут быть применены для понимания наноразмерных пространственных распределений нескольких типов белков в клетке. Одним из основных преимуществ этого метода является резкое увеличение пространственного разрешения: в то время как дифракция ограничивает разрешение до ~200-250 нм в обычной световой микроскопии, FPALM может получать изображения в масштабах длины более чем на порядок меньше. Поскольку многие биологические гипотезы касаются пространственных отношений между различными биомолекулами, улучшенное разрешение FPALM может дать представление о вопросах клеточной организации, которые ранее были недоступны для традиционной флуоресцентной микроскопии. В дополнение к подробному описанию методов пробоподготовки и сбора данных, мы опишем здесь оптическую установку для FPALM. Еще одним фактором для исследователей, желающих проводить микроскопию со сверхвысоким разрешением, является стоимость: собственные установки значительно дешевле, чем большинство коммерчески доступных машин для визуализации. Ограничения этого метода включают необходимость оптимизации маркировки интересующих молекул в образцах клеток, а также потребность в программном обеспечении для последующей обработки для визуализации результатов. В данной работе мы описываем использование экспрессии PAFP и PSFP для визуализации двух видов белков в фиксированных клетках. Также описывается распространение метода на живые клетки.