Методическая статья

Использование системы 3D-слежения Автоматизированная для записи отдельных и косяки взрослых данио рерио

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50681

⸱

5 декабря 2013 г.

 ,  , 
1R&D, xyZfish

В этой статье

Краткое содержание

Описано использование автоматической 3D-видеосистемы, которая может отслеживать отдельных особей и группы рыбок данио. В качестве примера применения мы исследуем влияние антагониста NMDA-рецепторов MK-801 на косяки рыбок данио

.

Аннотация

Как и многие водные животные, рыбка данио (Danio rerio) перемещается в 3D-пространстве. Таким образом, предпочтительнее использовать систему 3D-записи для изучения его поведения. Представленная автоматическая система видеослежения достигает этого за счет использования зеркальной системы и процедуры калибровки, которая корректирует значительную ошибку, вносимую переходом света от воды к воздуху. С помощью этой системы можно фиксировать как одиночных, так и групповых взрослых рыбок данио. Перед использованием система должна быть откалибрована. Система состоит из трех модулей: «Запись», «Реконструкция траектории» и «Обработка данных». Представлены пошаговые протоколы калибровки и использования трех модулей. В зависимости от экспериментальной установки, система может быть использована для тестирования неофобии, отвращения к белым, социальной сплоченности, двигательных нарушений, исследования новых объектов и т.д. Это особенно перспективно в качестве инструмента первого шага для изучения влияния лекарств или мутаций на основные поведенческие модели. Система предоставляет информацию о вертикальном и горизонтальном распределении данио-рерио, о xyz-компонентах кинематических параметров (таких как локомоция, скорость, ускорение и угол поворота), а также предоставляет данные, необходимые для расчета параметров социальных связей при тестировании отмелей.

Введение

Рыбки данио-рерио стали важной моделью для биологических и фармакологических исследований1-3. Отслеживание моделей передвижения и пространственного распределения отдельных рыбок данио и косяков рыбок данио бесценно. В более старых исследованиях применялась ручная количественная оценка на основе записанных изображений4. В настоящее время широко используются 2D системы автоматического видеослежения5. Однако, поскольку рыбки данио и многие другие водные и неводные животные перемещаются в трехмерном пространстве, интерес к 3D-системамрастет. Описанная 3D-система была впервые опубликована в 2007году7. Технические детали и сравнения с другими системами см.в разделе 8. Основное преимущество этой системы по сравнению с другими системами заключается в том, что она получает два (опционально три) синхронных и независимых вида с помощью системы зеркалирования, то есть использует двухступенчатый протокол калибровки. На первом этапе происходит калибровка 3D-геометрии стереосистемы (сформированной камерой и зеркалами). На втором шаге корректируются нелинейные ошибки, вызванные преломлением света. При изучении водных животных влияние преломления света может быть значительным, если его не скорректировать. В других до сих пор опубликованных системах (даже более новыхразработках9) процедура двухступенчатой калибровки отсутствует. Для получения технических подробностей об идентификации объектов, окклюзии с отслеживанием нескольких объектов, шуме джиггинга и т.д. Читатель отсылается к оригинальным публикациям8,9. Система была валидирована для изучения тревожных поведенческих реакций10,11, стаи8,11,12 и, в предварительном исследовании, для антагонистического поведения у рыбок данио-рерио13. Он также был протестирован для других видов рыб (золотая рыбка8, меченосец, тигровый барбус) и для мышей9.

Ниже описаны протоколы калибровки и использования системы, а также представлены результаты эксперимента, проверяющего влияние неконкурентного антагониста NMDA-рецептора MK-801 на стаю данио-рерио на стаю данио-рерио

.

Как в естественной среде, так и в аквариумах, данио-рерио обычно плавает косяками14. Предпочтения в отношении косяков, по-видимому, зависят от нескольких факторов, таких как выращивание, пол и доступность пищи14,15. Интересно, что расстояние между отдельными рыбками данио-рерио в косяке становится меньше, когда присутствуют сигналы о потенциальной опасности, такие как феромоны тревоги16 или новизна11. Таким образом, парадигма отмели также используется для тестирования анксиолитических препаратов17. Иерархия доминирования18 и социальное научение19 являются увлекательным аспектом поведения рыбок данио. Из-за своего высокоразвитого социально-поведенческого характера рыбки данио также стали представлять интерес для исследований аутизма20,21.

MK-801, как сообщалось, изменяет социальное поведение у рыбокданио-рерио 5,22,23, что напоминает о его влиянии на млекопитающих24. Тем не менее, MK-801 также имеет много других эффектов на другие модели поведения (такие как поведение при плавании, избегание ингибиторов и предпочтение места25-27). Поэтому в начальных экспериментах крайне важно получить как можно больше информации из базовых наблюдений. Это послужит основой для разработки более целенаправленных экспериментов.

Обследование регистрирующей аппаратуры и программного обеспечения

В своей текущей конфигурации, контейнер для наблюдения (25 см x 25 см x 18 см, Д x Ш x В), в котором находятся рыбки данио, расположен в наблюдательной камере (91 см x 46 см x 56 см, Д x Ш x В). В камере также находится камера, зеркало, которое подвешено под углом примерно >45° над контейнером, и светодиодные световые полосы. На рисунке 1 показана упрощенная схема. Камера записывает как вид спереди, так и вид сверху (зеркало) для построения 3D-траекторий рыбки данио-рерио, определяя ее координаты x, y и z. Для целей ориентации векторы координат представлены в левом переднем углу контейнера наблюдения (положение относительно камеры), что соответствует векторам, представленным на 3D-видах (например, на рисунке 15), сгенерированных модулем реконструкции пути (см. ниже). Частота дискретизации зависит от камеры и компьютера. В наших экспериментах это примерно 40 кадров в секунду (fps). Пространственное разрешение записываемых кадров составляет 640 x 480 пикселей (такая конфигурация была выбрана как оптимальный баланс между пространственным и временным разрешением). Требуется Windows XP или более поздняя версия.

Перед первой записью система должна быть откалибрована для определения расположения стенок контейнера и водной поверхности, для определения коэффициента масштабирования записанных кадров и для корректировки значительной ошибки, вызванной преломлением света при переходе из воды в воздух. В принципе, калибровка должна выполняться только во время первоначальной установки и после перемещения или замены частей установки, таких как камера или зеркало. Тем не менее, хорошей практикой является периодическая проверка правильности калибровки и при необходимости повторная калибровка.

Программное обеспечение состоит из трех модулей. Модуль записи записывает кадры (два примера кадров показаны на рисунке 2). Модуль «Траектория» реконструирует пути для каждой рыбки данио. Модуль обработки данных рассчитывает ряд стандартных кинематических и пространственных параметров. С целью дальнейшего анализа данные могут быть импортированы в электронные таблицы или статистическое программное обеспечение.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Калибровка

  1. Поместите в камеру пустой контейнер для наблюдения так, чтобы ножки контейнера были вставлены в отверстия, предусмотренные для правильного выравнивания. Ориентируйте контейнер таким образом, чтобы полупрозрачные стенки (цель их конструкции – уменьшить отражения) были обращены к дальней стороне и справа от камеры.
  2. Откройте модуль записи, выберите 'Управление камерой' и отрегулируйте 'усиление' и 'затвор' (сняв с них выбор, окошки справа) так, чтобы изображение было четким. Расположите боковое зеркало под углом примерно 45° с левой стороны контейнера для наблюдения так, чтобы боковой вид контейнера на мониторе компьютера был полностью виден. Кроме того, зеркало должно быть выровнено таким образом, чтобы передняя стенка контейнера была видна как одна линия (как показано стрелкой на рисунке 3).
  3. Подключите панель калибровки к параллельному порту (карты камеры) и нажмите кнопку «Светодиодная панель вкл/выкл» в модуле записи, чтобы включить светодиоды.
  4. Поместите калибровочную панель в пустой контейнер для наблюдения таким образом, чтобы 5 светодиодов были видны спереди, сверху и сбоку на мониторе компьютера, как показано на рисунке 3 (иногда кабель перекрывает обзор, в этом случае переместите его). Убедитесь также, что светодиоды находятся ниже отметок для уровня воды (эти метки выгравированы на смотровых контейнерах на расстоянии 135 мм от внутреннего дна бака) и что положение панели стабильно (чтобы она не смещалась при заполнении контейнера водой в пункте 1.9).
  5. Выключите свет в камере наблюдения и закройте шторку (будьте осторожны, чтобы не прикасаться к кабелю калибровочной панели или боковому зеркалу).
  6. Нажмите кнопку «Местоположение данных» и создайте или выберите папку для файлов калибровки. Эти файлы будут использоваться для всех последующих записей (или экспериментов) до тех пор, пока не возникнет необходимость в повторной калибровке. Таким образом, в идеале данные калибровки должны быть частью имени папки калибровки.
  7. Настройте три красных прямоугольника на экране компьютера таким образом, чтобы каждый из них охватывал только 5 светодиодов в любом из трех видов (рис. 4, левая панель). Снова используйте 'усиление' и 'затвор' в разделе 'Управление камерой' для получения четких изображений светодиодов, без изображений других световых точек (которые возникают из-за шума, отражений или капель воды на стенке контейнера), как показано на рисунке 4, правая панель.
  8. Выключите светодиоды и нажмите кнопку «Собирать калибровку без воды». На экране компьютера появляются 5 тегов ('x'), пронумерованных от 0 до 4. Включите панель. Места расположения меток должны совпадать со светодиодами. Если нет, повторите шаг 1.7 (см. Рисунок 4 для иллюстрации неправильного назначения тегов на левой панели и правильного назначения тегов на правой панели).
  9. Заполните камеру наблюдения водой до отметки. Светодиоды должны находиться ниже уровня воды (как было описано в шаге 1.4). Если они находятся выше уровня воды, опорожните контейнер и вернитесь к пункту 1.4. Заливая воду в емкость, следите за тем, чтобы светодиодная панель не сдвинулась. Однако, если это произойдет, то опорожните контейнер и вернитесь к шагу 1.4. Это важно, потому что калибровка основана на определении разницы между зарегистрированными положениями светодиодов без воды и с водой.
  10. Нажмите кнопку «Собрать калибровку с водой». Опять же, как и в пункте 1.8, на экране появятся пять тегов, которые в большинстве случаев будут немного смещены от полученных при калибровке без воды. На этом шаге может потребоваться повторная регулировка усиления и затвора. Повторяйте эти действия до тех пор, пока метки не будут правильно размещены поверх светодиодов (как показано на рисунке 4, правая панель).
  11. Включите свет в камере наблюдения, отрегулируйте усиление и затвор (в разделе «Управление камерой»), чтобы изображение не было слишком ярким.
  12. На рисунке 5 показаны шесть точек, которые должны быть выбраны последовательно щелчком правой кнопкой мыши. Убедитесь, что точки находятся на обозначенных линиях: 1. уровень воды спереди, 2. левый верхний конек контейнера на виде сверху, 3. вертикальная линия, очерчивающая переднюю стенку на виде сбоку. Длина линии не имеет значения. Между нажатиями на позиции 1 и 2, 3 и 4, а также 5 и 6 появятся прямые линии (цифры фактически не появятся на экране). Нажмите «Собрать информацию о контейнере», чтобы сохранить эту информацию.
  13. Снимите боковое зеркало и светодиодную панель и наполните воду точно до отметки. Выберите «Начать запись». В новом окне запрашивается продолжительность в минутах. Для текущей цели достаточно 1 минуты. Нажмите OK.
  14. После записи выйдите из Record Module, откройте Trajectory Module, выберите папку для калибровки (сделано на шаге 1.6) с помощью 'Data Location' (загрузка файла может занять некоторое время). Эта папка содержит файлы калибровки и файлы только что записанных данных (шаг 1.13).
  15. Нажмите кнопку "Получить фон". Откроется новое окно, ничего не меняя, нажмите OK. Дождитесь, пока на мониторе появится (перевернутое) изображение наблюдательного танка. Затем нажмите «Загрузить фон». Фоновая картинка будет исправлена. Открывается новое окно, в котором предлагается отрегулировать коробки. Просто нажмите OK.
  16. Нажмите последовательно с третьей по седьмую кнопку: «Загрузить корреспонденцию без воды», «Калибровать виртуальную камеру(ы)», «Загрузить преломленную корреспонденцию», «Собрать геометрию контейнера», «Получить информацию о контейнере с животными». Этот последний шаг может занять несколько минут. Он завершается, когда на экране появляются три белые линии (которые и являются линиями, которые были нарисованы на шаге 1.12). Нажмите кнопку "Сохранить информацию о контейнере".
  17. Нажмите кнопку «Собрать громкость». Теперь, как показано на рисунке 6, последовательно отметьте 8 углов водоема, который представляет собой кубоид. Для каждой точки сначала нажмите на нее на виде спереди, а затем на виде сверху.
  18. Выберите «3D» в левом углу окна. Теперь открывается новое окно, показывающее контур коробки с белым дном (как на рисунке 15, но без траектории). Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать повороты и перемещения вида коробки. Если изображение отсутствует или не является изображением кубоида (т.е. на шаге 1.17 углы были свернуты правой кнопкой мыши в неправильном порядке), выполните следующие действия: выходя, но не закрывая модуль «Траектория», с помощью Windows перейдите в папку калибровки (сделано в шаге 1.6), выберите подпапку «Данные контейнера с животными» и удалите файл с именем TankVertices и повторите шаг 1.17.
  19. Поздравляем, калибровка завершена. В идеале следует провести тестовый прогон с рыбкой-пустышкой, чтобы проверить, все ли работает хорошо. Хорошей новостью является то, что повторная калибровка должна выполняться только в том случае, если положение зеркала или камеры было изменено (даже незначительно) или если есть проблемы с отслеживанием (см. раздел 3).

2. Запись

  1. Поместите заполненный до отметок водой контейнер для наблюдения в камеру наблюдения таким образом, чтобы ножки контейнера были вставлены в отверстия, предусмотренные для правильного выравнивания. Расположите контейнер таким образом, чтобы полупрозрачные стенки (или белые стены в нашем примере - см. Обсуждение) были обращены на дальнюю сторону и вправо, если смотреть с камеры.
  2. Включите свет в отсеке, положите рыбок (экспериментальных или пустышек) в контейнер и закройте шторы. Примечание: система может записывать несколько рыб (см. раздел «Репрезентативные результаты»); Тем не менее, рекомендуется получить некоторый опыт работы с системой, сначала записывая одну рыбу.
  3. Откройте модуль «Запись». На экране появляется изображение переднего и верхнего (зеркального) вида контейнера. Изображение может быть не идеальным (например, переэкспонировано, например, на рисунке 7) и, возможно, его придется скорректировать (следующие три шага) для получения хорошего контраста между рыбой и фоном (например, рисунок 8).
  4. Выберите пункт 'Управление камерой' и в открывшемся окне 'Общие настройки' отрегулируйте 'Затвор' и 'Усиление' (сняв выделение соответствующих окошек справа, см. рисунок 9) таким образом, чтобы изображение не пересвечивалось и был хороший контраст между рыбой и фоном.
  5. В левой части окна "Управление камерой" выберите "Баланс белого/Цвет" и в новом окне снимите флажок "Авто" и отрегулируйте значения "Красный" и "Синий" (см. Рисунок 10) для получения наилучшего цветового контраста как спереди, так и сверху.
  6. Возможно, потребуется несколько раз переключаться между настройкой цвета (в разделе «Баланс белого/цвет») и регулировкой усиления и затвора (в разделе «Общие настройки»), чтобы получить наилучшую настройку камеры. Имейте в виду, что даже если вы будете удовлетворены без какой-либо настройки, крайне важно снять флажки «Затвор», «Усиление» и «Авто» (как описано в шагах 2.4 и 2.5), в противном случае фон будет колебаться в течение записи, что сделает невозможным извлечение траекторий. Не изменяйте другие настройки. Когда закончите, закройте окно «Управление камерой».
  7. В главном меню модуля записи выберите «Местоположение данных», чтобы создать или открыть ранее созданную папку. Обратите внимание, что каждая запись (например, рыба или косяк) получает свою собственную папку, которая в идеале должна быть подпапкой папки эксперимента.
  8. Нажмите «Начать запись». Откроется окно, в котором запрашивается продолжительность записи в минутах (вводите только целые числа). Нажмите «OK», чтобы начать сеанс записи.
  9. Если запись завершена, выйдите из программы. Перед записью следующей рыбы рекомендуется перезагрузить компьютер. Используйте опцию «Перезагрузить» в Windows, чтобы сохранить настройки камеры (из шагов 2.4 и 2.5). Необходимость перезагрузки компьютера между записями связана с некоторыми проблемами с картой камеры.
  10. Перед переходом к модулю «Траектория» для реконструкции траектории скопируйте и вставьте подпапки «Данные о контейнере с животными» и «Данные соответствия» из папки калибровки (сделанной в разделе 1 настоящего протокола) во все папки, которые были созданы во время записи. В этих последних папках присутствуют еще две подпапки, а именно «Исходные данные» и «Временные метки». Первый содержит все записанные кадры в формате JPEG; Последний содержит информацию об общем количестве кадров и интервалах между кадрами (в MSC).

3. Реконструкция пути

  1. Откройте модуль «Траектория», нажмите «Местоположение данных», чтобы выбрать папку, созданную с помощью модуля записи, а затем нажмите кнопку «Настройка системы», чтобы открыть раздел «Параметры» (см. Рисунок 11).
  2. Выберите пороговые значения цвета в верхнем и нижнем представлениях. Хорошее начальное значение — 1 000. Если это значение низкое, программное обеспечение с большей вероятностью будет записывать шум. Однако, если значение слишком высокое, рыба может оказаться ниже дальности обнаружения. Позже (шаги 3.11 и 3.12) может потребоваться повторная настройка цветовых порогов. Также обратите внимание, что верхний и нижний цветовые пороги не должны совпадать.
  3. Выберите пороговые значения размера вида сверху и снизу. Хорошее начальное значение для среднего размера данио рерио составляет 10, для очень большого - 20, а для очень маленького - 5. Чем выше порог размера, тем меньше вероятность улавливания шума. Однако, если он слишком высок, программное обеспечение также может не обнаружить рыбу. Опять же, на шагах 3.11 и 3.12 может потребоваться повторная корректировка пороговых значений размера. Также обратите внимание, что верхний и нижний пороги размера не должны совпадать.
  4. Для параметра "Верхний порог размера" обычно является хорошим значением 3,000, а для параметра "Конкретная длина" оставьте его на уровне 220 (уже предустановленное). «Количество рыб» относится к количеству рыб в смотровом аквариуме. «Максимальное количество очков» относится к общему количеству кадров. Запомните (или запишите) это число или чуть меньшее (например, 45 703 может быть запомнено как 45 000). Нажмите OK.
  5. Последовательно нажимайте кнопки «Загрузить корреспонденцию без воды», «Калибровать виртуальную камеру» и «Загрузить информацию о контейнере для животных». Сообщение об ошибке будет сгенерировано, если подпапки калибровки 'Данные контейнера животного' и 'Соответствующие данные' не были скопированы в текущую экспериментальную папку (см. шаг 2.10). Если это так, скопируйте и вставьте эти подпапки сейчас и нажмите кнопки еще раз.
  6. Нажмите кнопку «Получить фон». В новом окне будет предложено заполнить поля 'from' и 'to' значениями по умолчанию 0 и 100 соответственно. Измените 100 на максимальное количество кадров (в примере, приведенном на шаге 3.4, это число может быть упрощено до 45 000). Нажмите OK.
  7. Подождите, пока не появится (искаженное) изображение. Затем нажмите «Загрузить фон», что приведет к созданию правильного фонового изображения. Рыбу не должно быть видно на этом фоновом изображении. Если рыба видна, попытайтесь получить лучший фон из других сегментов записи (например, попробуйте 0-1,000, 1,000-2,000 и т.д. на шаге 3.6).
  8. Если рыба вообще не двигалась во время сеанса записи, единственный способ получить фон — удалить рыбу и сделать новую короткую запись без рыбы, но с теми же настройками «Управления камерой» (это важно). Получите фон и скопируйте подпапку 'Background data' в текущую экспериментальную папку. Теперь нажмите «Загрузить фон», а не «Получить фон». Обратите внимание, что открытие и закрытие шторы часто приводит к некоторому изменению фона, поэтому может потребоваться регулировка пороговых значений в шагах 3.2 и 3.3 для снижения шума. На шаге 3.11 показано, как проверить наличие шума.
  9. После загрузки фона настройте три красных прямоугольника (с помощью мыши), как показано на рисунке 12. Квадратиками отмечены области, в которых программное обеспечение ищет рыбу. Закройте поле слева (т.е. уменьшите его до линии или точки), потому что вид сбоку используется только для калибровки (как было описано в шаге 1.7).
  10. Нажмите кнопку «Начать генерацию траекторий». Откроется окно с запросом номера начального кадра. Выберите значение по умолчанию '0'. После нажатия кнопки 'OK' открывается окно 'Присвоение тегов' (см. Рисунок 13). Нажимайте кнопку «Шаг вперед», пока на экране не появится тег (X0). Если метка не размещена на изображении рыбы, нажмите «Нет», пока она не будет размещена правильно. Затем нажмите «Перейти». Если она не назначена правильно (или вообще), все равно нажмите «Перейти» и найдите проблему (следующий шаг).
  11. Начинается реконструкция траектории. В идеале бирка всегда (или хотя бы большую часть времени) должна быть размещена на изображении рыбы. Если он часто размещается неправильно, откройте окно «Информация» (второй вариант над экраном видео). На рисунке 14А показан идеальный случай, когда видны только очертания рыбы. На рисунке 14B показан случай чрезмерного шума, который препятствует правильному назначению тегов. Если вы видите четкое изображение рыбы без шума (как на рисунке 14A), но метка никогда или редко будет назначена правильно, то наиболее вероятная причина заключается в том, что калибровка не выполнена. Повторите калибровку и повторите реконструкцию траектории. Если во время калибровки зеркало и камеры не перемещаются, новые данные калибровки могут быть использованы для ранее выполненных записей.
  12. В случае чрезмерного шума (как показано на рисунке 14B), нажмите кнопку "Стоп" в главном меню и выберите новые пороговые значения цвета и размера (шаги 3.2 и 3.3). Также проверьте, можно ли немного уменьшить количество красных прямоугольников (шаг 3.9) (например, чтобы исключить шум, создаваемый движениями воды наверху). Обратите внимание, что иногда программа «зависает» (если тег вообще не может быть назначен): в этом случае перезапустите программу.
  13. Наблюдайте за траекторией на 3D-экране (третий вариант над экраном). Рисунок 15. представляет собой пример траектории. Щелчком правой кнопкой мыши выберите между вращением и перемещением 3D-конфигурации.
  14. Когда траектория будет завершена, последовательно нажимаем кнопки «Сохранить» (а не «Стоп», которая удаляет траекторию!), «Очистка траектории» и «Сглаживание траектории». Открывается новое окно, в котором отображаются фильтры-параметры для сглаживания (Рисунок 16). Не изменяйте значения по умолчанию, пока не накопите больше опыта работы с системой. Нажмите «ОК».
  15. К этому моменту должно быть понятно, почему выбор хорошей настройки камеры (с хорошим контрастом между рыбой и фоном) перед записью (см. шаги 2.4-2.6) был так важен. Перейдите к разделу «Обработка данных».

4. Обработка данных

  1. Во-первых, взгляните на папку, которая использовалась для записи рыбы (рис. 17). Он содержит подпапки «Данные о контейнере с животными» и «Данные соответствия», которые были скопированы из папки калибровки (шаг 2.10), подпапки «Временные метки» и «Исходные данные», которые были созданы во время записи рыбы, а также подпапки «Фоновые данные» и «Траектории», которые были созданы при реконструкции пути.
  2. На рисунке 17 также показано, что подпапка 'Trajectories' содержит три файла. Файл point.smoothed — это файл, который будет использоваться для дальнейшей обработки данных. В случае записи нескольких рыб (например, эксперимент по стайне), для каждой рыбы будет сгенерирован отдельный файл point.smoothed.
  3. На рисунке 18 показана верхняя часть примера файла point.smoothed. В первой строке указано общее количество выборок или кадров, во второй строке — продолжительность записи (в минутах) и в третьей строке — координаты (последовательность: x, z, y) центра водоема относительно камеры. За этим следует одна строка для каждого кадра, указывающая координаты x, y, z (в мм) для рыбы и продолжительность этой выборки (в секундах).
  4. Существует два способа обработки данных, представленных в файлах point.smoothed: использование Модуля обработки данных или использование другого программного обеспечения, такого как Excel или MATLAB, для выполнения расчетов, которые (пока) не включены в Модуль обработки данных.
  5. Откройте модуль обработки данных, выберите «Проект» на панели инструментов, затем в выпадающем меню выберите «Новый», а затем введите название эксперимента. Выберите «Редактировать проект» на панели инструментов, выберите «Добавить в проект» из выпадающего меню, затем «Новая группа» и введите имя группы (например, «Элементы управления»). Обратите внимание, что в данный момент названия проектов и групп на самом деле не используются, но имена должны быть заполнены. Созданные папки могут быть использованы для хранения выходных файлов (см. шаг 4.10).
  6. Выберите группу (например, 'Controls') в правом окне (см. рисунок 19). Панель инструментов изменится. Выберите «Редактировать группу», затем «Добавить в группу» в раскрывающемся меню, затем «Новые измерения». Откроется браузер. Откройте папку, сделанную во время записи (шаг 2.7), выберите подпапку 'траектории', а затем point.smoothed-файл. В примере, представленном на рисунке 19, для группы А было загружено шесть файлов, для группы В — четыре файла. (Обратите внимание, что в проиллюстрированном примере сглаженные файлы имеют расширения 0 и 1, потому что в этом эксперименте одновременно тестировались две золотые рыбки).
  7. Для анализа выберите файл point-smoothed-file в правом окне, выберите «Обработка данных», выберите «Single Endpoints» из выпадающего меню и, в качестве примера, выберите «Duration freezezing» (рис. 20). Откроется окно для указания зависания в терминах порога скорости и порога длительности. В данном примере рыба тратит на заморозку 25,86 % времени наблюдений.
  8. Чтобы ознакомиться с программой, попробуйте другие примеры, такие как Расстояние перемещения, Распределение глубины (которое позволяет определить количество уровней глубины) и Частота всплесков.
  9. Существуют и более сложные расчеты, такие как спектральный анализ, например, z-компонента ускорения. В этом случае выберите «Функции временных рядов», затем «Анализ частотной области TD», «Спектральный анализ» и «Спектр ускорения Z». Анализ Фурье будет выполнен по указанному параметру (для пояснения7). Не все опции, отображаемые в меню, еще полностью реализованы. Например, «Извилистость пути» была добавлена только экспериментально.
  10. При выборе опции «Пакетная обработка с использованием порога по умолчанию» будет рассчитано около 200 конечных точек. В данном контексте «по умолчанию» означает, что были установлены разделители. Например, в настоящее время распределение по глубине рассчитывается для трех уровней глубины, угловое распределение вычисляется для четырех сечений (т.е. квадрантов) и т.д. После генерации параметров открывается новое окно, в котором запрашивается местоположение и имя файла, который будет создан. Они будут сохранены в формате CSV и могут быть импортированы в другие программы, такие как Excel, для дальнейшей обработки.
  11. В отличие от модуля записи и модуля траектории, модуль обработки данных представляет собой развивающийся модуль, который в дальнейшем будет адаптирован к требованиям исследователей.

Результаты

Самки данио-рерио (Danio rerio) в возрасте шести месяцев неопределенного штамма дикого типа («короткий плавник») были приобретены в компании Aquatica Tropicals, Inc. Всего было использовано 120 особей. Перед началом экспериментов рыбы подвергались акклиматизации к лабораторным условиям в аквариумах объемом 38 L в течение примерно 8 недель. Температура воды соответствовала комнатной (~23° C). Световой режим: 14 ч свет (6:00–20:00), 10 ч темнота. Кормление проводилось три раза в день: в 8:00 — тропическими хлопьями Tetra; в 12:00 — живыми личинками артемии; в 15:00 — тропическими хлопьями Tetra. В дни проведения экспериментов рыб кормили хлопьями только в 8:00. Сразу после второй записи рыб подвергали эвтаназии с использованием 300 mg/L трикаина метансульфоната (MS-222).

Для контрольной группы использовали 14 квадруплетов (т.е. групп по четыре особи данио-рерио) (n = 14), для группы MK-801 — 16 квадруплетов (n = 16). После 1 ч воздействия 10 µM MK-801 (начиная с 9:30) в контейнерах объемом 1 L квадруплеты переносили в смотровые контейнеры. Запись начинали немедленно (в 10:30), она длилась 20 мин. Впоследствии данио-рерио оставляли в контейнерах на 3,5 ч. В течение этого периода обеспечивали аэрацию с помощью трубки, подключенной к воздушному насосу. В 14:00 проводили вторую 20-минутную запись. Целью двух записей было изучение эффектов габитуации и/или снижения действия препаратов (период полувыведения MK-801 у крыс составляет около 2 ч28). Мы анализировали (1) средние социальные дистанции (также называемые межиндивидуальными дистанциями11,29) как меру социальной сплоченности, (2) вертикальное распределение по десяти уровням глубины, (3) горизонтальное распределение по четырем радиальным зонам (см. Figure 24A, вставка с расположением зон) и по квадрантам (см. Figure 24B, вставка с расположением квадрантов), а также (4) три компонента (x,y,z) пройденного расстояния. Данные усредняли по каждой стае. После того как тесты Шапиро-Уилка показали, что не все переменные распределены нормально, для всех переменных применяли U-критерий Манна-Уитни для сравнения средних значений в контрольной группе и группе MK-801. Эти сравнения проводились отдельно для утренних и дневных сессий. Мы приняли α = 0,05/4 = 0,0125, поскольку использовались четыре (группы) переменных (см. выше).

Рисунок 2A демонстрирует типичный кадр для контрольных рыбок данио-рерио, а Рисунок 2B — типичный кадр для рыбок данио-рерио, обработанных MK-801; оба кадра были записаны во время утренней сессии. Обратите внимание, что контрольные рыбки находились у дна, близко к передней стенке (т. е. к стороне, ближайшей к камере) и держались вместе (т. е. наблюдалась высокая социальная сплоченность). Напротив, рыбки, обработанные MK-801, находились ближе к поверхности, не проявляли предпочтений в горизонтальной плоскости и плавали на значительном расстоянии друг от друга (т. е. социальная сплоченность была низкой). Рисунок 21 показывает репрезентативные траектории. Контрольные рыбки проявляли явную тенденцию оставаться у передней стороны смотрового контейнера. Более того, большую часть времени они находились у дна. Рыбки, обработанные MK801, напротив, плавали в любой точке горизонтальной плоскости. Однако в 10:30 у них наблюдалось явное предпочтение верхних уровней глубины. К 14:00 их вертикальное распределение стало более однородным.

Количественный анализ данных подтвердил наше описание. На рисунке 22A показано, что средняя социальная дистанция (т.е. средние межиндивидуальные расстояния между четырьмя особями данио-рерио в группе из четырех рыб) для рыб, получавших MK-801, была более чем в три раза больше, чем для контрольных рыб в утренние часы (в 10:30), при U = 0 и p<0.00001. После 3,5 ч привыкания (в 14:00) социальная дистанция у контрольных рыб увеличилась, тогда как у рыб, получавших MK-801, она осталась практически неизменной. Тем не менее, она оставалась значимо различной для обеих групп (U = 19, p<0.0005). На рисунке 22B представлены временные шкалы социальной дистанции для двух экспериментальных групп как для 10:30, так и для 14:00.

Вертикальное распределение также существенно различалось для обеих групп. На рисунке 23 показано, что и утром (10:30), и днем (14:00) контрольные особи zebrafish проводили большую часть времени на двух-трех нижних уровнях глубины (т. е. на уровнях, ближайших к дну наблюдательного контейнера). С другой стороны, zebrafish, получавшие MK-801, в 10:30 большую часть времени плавали близко к поверхности воды (рисунок 23A). После 3.5 hr привыкания, в 14:00 они были распределены более или менее равномерно по всем уровням глубины.

Горизонтальное распределение также существенно различалось для обеих экспериментальных групп. На рисунке 24A видно, что рыбки данио-рерио, получавшие MK-801, проводили меньше времени во внешней зоне и больше времени в средней и центральной зонах по сравнению с контрольной группой. Различия между группами в отношении квадрантов были еще более очевидными (рисунок 24B). Контрольные рыбки данио-рерио проявляли очень сильное предпочтение к двум передним квадрантам (1 и 4), т. е. к стороне контейнера, расположенной ближе к камере. С другой стороны, рыбки данио-рерио, получавшие MK-801, были распределены по четырем квадрантам более или менее равномерно.

Что касается кинематических параметров, мы ограничим обсуждение здесь пройденным расстоянием (Рисунок 25). Зебрадани, которым вводили MK-801, перемещались больше, чем контрольные рыбки. Интересно, что эта разница была особенно значимой для компоненты пройденного расстояния по оси y. Это направление в сторону камеры (см. Рисунок 1). Действительно, контрольные особи зебрадани большую часть времени находились близко к передней стенке в квадрантах 1 и 4 (как видно на Рисунках 24A и 24B). С другой стороны, рыбки, получившие MK-801, перемещались взад и вперед между передней и задней половинами контейнера.

Здесь мы представили лишь некоторые из возможных способов анализа данных, полученных в ходе эксперимента. На данном этапе мы воздерживаемся от какой-либо конкретной биологической интерпретации результатов. Однако стоит отметить, что было установлено, что MK-801 вызывает социальную изоляцию30 и снижает исследовательское социальное поведение у крыс31, а также изучался в качестве модели негативных симптомов шизофрении30. Он также вызывал гиперактивность31, круговое поведение32, сенсорные нарушения33 и снижение препульсного торможения34 у млекопитающих. Хотя мы специально не проверяли наличие этих нарушений, наши результаты представляются согласующимися с ними. Для определения того, сопоставимы ли описанные эффекты MK-801 у zebrafish с эффектами, описанными у млекопитающих, требуются более специфические экспериментальные установки. Также будут необходимы дальнейшие анализы и эксперименты, чтобы решить, играли ли тревожность, проблемы с дыханием, пространственная дезориентация, дефицит внимания, стереотипия и т. д. значительную роль в изменении поведения, вызванном действием MK-801 у zebrafish.

Схема установки для оптических измерений с камерой, компьютером, кубом и зеркалом; исследование в области фотоники.
Рисунок 1. Схематическое изображение установки. Камера фиксирует кадры (т. е. статичные изображения), демонстрирующие вид наблюдательного резервуара спереди и сверху. Кадры сохраняются в компьютере для последующей обработки. Обратите внимание на расположение осей xyz, которые важны для описания 3D-характеристик перемещений и местоположения zebrafish. Две затененные стенки на рисунке (а также дно резервуара) в нашем эксперименте (см. Типичные результаты) были окрашены в белый цвет, в то время как две другие стенки были прозрачными. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Эксперимент по изучению поведения рыб в аквариуме, два аквариума с распределением рыб, установка для поведенческого исследования.
Рисунок 2. Примеры кадров. Обратите внимание, что при использовании только видов спереди или сверху происходит потеря информации. Это особенно заметно на панели B, где три zebrafish слева при взгляде спереди кажутся расположенными близко друг к другу, в то время как вид сверху показывает, что это не так. С другой стороны, вид сверху не дает представления о расстоянии до дна. A) Контрольные zebrafish. B) Zebrafish, обработанные 10 µM MK-801. Обратите внимание, что цвет (синий) фона был создан программным обеспечением для записи и выбран для обеспечения хорошего контраста. Реальный цвет задней, правой стенок и дна был белым. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Система отслеживания поведения водных животных; установка для видеоанализа; калибровочная панель; процесс мониторинга.
Рисунок 3. Юстировка бокового зеркала. Белая стрелка слева указывает на переднюю стенку (ближайшую к камере) в боковом зеркале. Если видны две линии, скорректируйте положение бокового зеркала до тех пор, пока не останется одна линия (шаг 1.2). 5 светодиодов калибровочной панели четко видны на всех трех проекциях. Обратите внимание, что из-за включенного освещения в камере на светодиодной панели видны многочисленные другие отражения (шаг 1.4). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Процесс детектирования частиц, отмеченные красные рамки, диаграмма оптического анализа, условия низкой освещенности.
Рисунок 4. Маркировка светодиодов (LED). На левой панели показано, что пять меток (пронумерованных от 0 до 4), определенных в ходе процедуры калибровки, не совпадают с реальными светодиодами. Помимо светодиодов видны другие световые пятна (фактически отражения). На правой панели усиление и выдержка затвора были уменьшены так, чтобы были видны только светодиоды. Теперь пять меток назначены правильно (как описано в шагах 1.7–1.10). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Интерфейс программного обеспечения для отслеживания поведения водных животных, демонстрирующий управление камерой и настройку калибровки.
Рисунок 5. Сбор информации о контейнере. Представлена последовательность шести точек, которые необходимо выбрать (щелчком правой кнопки мыши). Линии будут проведены автоматически. Обратите внимание, что указанные здесь цифры на экране не отображаются. По завершении нажмите «Collect container info» (как описано в шаге 1.12). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Схема эксперимента по гидродинамике; установка с баком для изучения динамики жидкостей и плавучести; аннотированные компоненты.
Рисунок 6. Определение объема. Нажмите правой кнопкой мыши в указанных точках, отмечающих углы водного объема: сначала отметьте угол в виде спереди, а затем в виде сверху. Затем перейдите к следующему углу (от 1 до 8). Обратите внимание, что восемь точек обозначают контур водного объема, а не бака. Также отметьте, что при нажатии правой кнопкой мыши появляется только «x0», которое снова исчезает при нажатии в следующей точке (таким образом, цифры 1–8 на экране фактически не отображаются). Процедура описана в шаге 1.17. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Установка для отслеживания поведения водных животных с управлением камерой, мониторинг перемещения животных в резервуаре с водой.
Рисунок 7. Нескорректированный контраст. Изображение переэкспонировано, и контраст между рыбой и фоном (особенно при виде спереди) низкий. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Аквариумная установка с рыбами, использованными в исследовании статического равновесия; эксперимент по гидродинамике.

Рисунок 8. Скорректированный контраст. Контраст улучшен по сравнению с Рисунком 7. Обратите внимание, что цвета на экране являются ложными цветами. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Интерфейс настроек камеры Bumblebee2 BB2-03S2C, демонстрирующий регулировку яркости, экспозиции и насыщенности.
Рисунок 9. Общие настройки. После выбора пункта «Camera control» (Управление камерой) в главном меню открывается окно «General Settings» (Общие настройки). Снимите флажки с пунктов «Shutter» (Затвор) и «Gain» (Усиление) и используйте ползунки, чтобы добиться оптимального контраста между рыбой и фоном. Нажмите здесь для просмотра изображения в большем размере.

Графический интерфейс настройки баланса белого камеры; красные/синие ползунки; оптимизация обработки изображений.
Рисунок 10. Настройки цвета. В окне «White Balance/Color» снимите флажок «Auto» и используйте ползунки «Red» и «Blue», чтобы подобрать оптимальное сочетание для обеспечения хорошего контраста между рыбой и фоном. Параметры. После открытия Trajectory Module выберите файл эксперимента с помощью «Data location», а затем откройте окно «Parameters» через «System Setup». Здесь параметрам присвоены подходящие начальные значения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Интерфейс программного обеспечения для отслеживания поведения водных животных; параметры калибровки; настройка видеоанализа.
Рисунок 11. Параметры. После открытия модуля Trajectory Module выберите экспериментальный файл с помощью «Data location», а затем откройте окно «Parameters» через «System Setup». Здесь приведены подходящие начальные значения параметров. .Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Установка для отслеживания поведения в водной среде, калибровка 3D-системы, интерфейс программного обеспечения, анализ траекторий.
Рисунок 12. Выравнивание рамок. Обратите внимание, что красные рамки для вида сверху и спереди определяют области, в которых могут находиться рыбы. Рамка слева сокращена до линии, чтобы исключить эту область из поиска. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Интерфейс программного обеспечения для отслеживания водных животных, демонстрирующий настройку калибровки и мониторинга для анализа поведения.

Рисунок 13. Назначение меток. После нажатия кнопки «Start generating trajectories» (Начать генерацию траекторий) и выбора начального кадра (обычно кадр №0) открывается окно «Tag assignments» (Назначение меток). Нажимайте «Step forward» (Шаг вперед), пока на экране не появится метка («X0»). Если метка не расположена на изображении рыбы, нажимайте «No» (Нет), пока она не будет установлена правильно. Затем нажмите «Go» (Пуск). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Диаграмма динамического анализа с вектором силы, концентрацией напряжений; компоненты обозначены A, B.
Рисунок 14. Информационный экран. Панель (A) демонстрирует правильное назначение тега. Тег («X0») размещен на изображении рыбы в обоих ракурсах. Обычно через тег проходит линия. Панель (B) демонстрирует избыточный шум и отсутствие назначения тега. Кадры были получены из одной и той же записи путем изменения цветовых порогов и порогов размера (на этапе 2.2) с 1,000-50 и 10-5 соответственно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

3D-анализ траектории, векторная диаграмма, иллюстрирующая движение частиц в декартовых координатах.
Рисунок 15. Трехмерное представление реконструированного пути. Начало стрелок расположено в переднем левом углу резервуара для целей ориентации (см. также Рисунок 1). Таким образом, в данном примере рыба остается близко к левой стенке (относительно камеры). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Окно настройки параметров сглаживания траектории; настройки фильтра: пороги шума, размер окна.
Рисунок 16. Сглаживание траектории. Это окно открывается после нажатия кнопки «Trajectory smoothing». На данном этапе примите значение по умолчанию, нажав «OK». Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в более крупном масштабе.

Диаграмма организации файлов, демонстрирующая перенос данных из папки «fish1» в подпапку «Trajectories».
Рисунок 17. Подпапки. Выше показана папка, созданная во время записи. После реконструкции путей она содержит шесть указанных подпапок. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Числовые данные в текстовом формате для статистического анализа.
Рисунок 18. Сглаженный файл. Показана верхняя часть примера файла point.smoothed-file, в котором указаны количество кадров, продолжительность записи (в min), координаты центра водного объекта относительно камеры, а также координаты и длительность для каждого кадра. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Интерфейс программного обеспечения для обработки данных при анализе траекторий; настройка проекта и назначение групп.
Рисунок 19. Обработка данных. Выбор файлов для анализа (правое окно). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Интерфейс обработки 3D-данных ABMT, отображающий настройки анализа замирания для оценки траектории.
Рисунок 20. Пример анализа. Рассчитываемые конечные точки можно выбрать в меню. В данном примере был выбран параметр «Duration Freezing» (продолжительность замирания). Программа запрашивает значения порогов скорости и продолжительности, которые определяют замирание. Результат выражается в процентах от общей продолжительности записи. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Схема анализа локомоции, траектории перемещения контрольных мышей и мышей, получавших MK-801, в разные интервалы времени.
Рисунок 21. Репрезентативные траектории. Представлены две репрезентативные траектории для контрольных zebrafish и две репрезентативные траектории для zebrafish, подвергнутых воздействию 10 µM MK-801, для утренней сессии, начавшейся в 10:30 (верхний ряд), и для дневной сессии, начавшейся в 14:00 (нижний ряд). Траектории отдельных особей zebrafish в каждой четверке выделены разными цветами. Однако следует отметить, что могла произойти смена меток. Если принципиально важно отслеживать отдельные линии, требуется ручная коррекция. Левая передняя сторона (начало стрелок на вставке) изображенного контейнера — это сторона, расположенная ближе всего к камере (см. Рисунок 1 для уточнения расположения аквариума). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Анализ социальной дистанции; график; контроль против эффекта MK-801; результаты сравнительных сессий; временные ряды.
Рисунок 22. Средняя социальная дистанция между рыбами. A) Представлены средние социальные дистанции для контрольных zebrafish и zebrafish, обработанных 10 µM MK-801, для утренних и дневных сессий. Указаны среднее значение и S.E.M. ***, p<0.001. B) Представлены временные шкалы средней межиндивидуальной дистанции для обеих групп. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Анализ глубины; многомерный график; сравнение контрольной группы и группы MK-801; процент времени в зависимости от уровней глубины.
Рисунок 23. Распределение по глубине. A) Распределение Danio rerio по десяти равным уровням глубины (где уровень 1 — уровень, ближайший к дну) во время утренней сессии. B) Распределение Danio rerio во время дневной сессии. Представлены среднее значение и S.E.M. *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

График пропорционального времени в радиальных зонах и квадрантах; анализ данных; результаты психологического эксперимента.
Рисунок 24. Горизонтальное распределение. (A) Представлено временное распределение экспериментальных групп по четырем радиальным зонам. На врезке показано расположение зон от центра к периферии: центральная, средняя, внешняя и комбинированная угловая зоны. (B) Представлено временное распределение экспериментальных групп по четырем квадрантам. На врезке показано расположение квадрантов. Стены, обозначенные двойными линиями, представляют собой белые стены, обозначенные одинарными линиями — прозрачные стены. Камера расположена слева от врезки, т.е. ближе всего к квадрантам 1 и 4 (см. также Рисунок 1). Представлены среднее значение и S.E.M. Черные звездочки обозначают сравнения между группами для утренней сессии, а серые звездочки — для дневных сессий: *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

График статического равновесия; пройденное расстояние в зависимости от координат; контрольная группа против MK-801; анализ данных.
Рисунок 25. Пройденное расстояние. Представлены xyz-компоненты пройденного расстояния для zebrafish во время утренних и дневных сессий. Указаны среднее значение и S.E.M. Черные звездочки обозначают сравнения между группами для утренней сессии, а серые звездочки — для дневных сессий: *, p<0.0125; ***, p<0.001. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Обсуждение

Показанная здесь экспериментальная процедура позволяет регистрировать отдельных рыбок данио, пары рыбок данио (например , для изучения спаривания или агрессии) и косяки рыбок данио (как показано в репрезентативном примере). Система особенно подходит для одновременного получения информации о 3D (вертикальном и горизонтальном) распределении, кинематических характеристиках (например, скорости, ускорении, угле поворота) и социальных параметрах (например, социальной сплоченности). Ниже мы перечислим несколько важных вопросов, которые следует учитывать при планировании экспериментов.

В зависимости от экспериментальной методики могут быть изучены различные поведенческие системы. Например, для изучения неофобии (т.е. боязни перед новой средой) запись должна быть начата сразу после введения рыбок данио в аквариум для наблюдения (после ожидания всего нескольких секунд, пока вода успокоится, чтобы уменьшить шум), без предварительного привыкания11,17,37. С другой стороны, некоторые темы исследований могут потребовать от рыбок данио хорошей адаптации, например, при изучении эффектов феромонов тревоги16. Изучая группы рыбок данио, экспериментатор должен знать, что, хотя программное обеспечение сводит к минимуму переключение меток, в данный момент невозможно проследить за отдельными рыбками данио. Это также не важно для исследований отмеливания, где акцент делается на социальной сплоченности, но будет иметь решающее значение при изучении агрессии или спаривания. Ручное переназначение тегов является вариантом, но может занять очень много времени.

Цвет стенок смотрового контейнера и наблюдательной камеры может оказывать большое влияние на поведение рыбок данио. Например, было описано, что белые стены вызывают реакцию отвращения36, 37. Пробуя разные цвета, помните о двух вещах: 1) важно, чтобы передняя стенка (т.е. стена, ближайшая к камере) оставалась прозрачной, и что крышка (если она используется) также должна быть прозрачной; 2) При выборе цвета, который никогда ранее не использовался, сначала определите, подходит ли контраст между рыбками данио и фоном для записи. Проведите тестовый прогон. Изменение настроек камеры для записи (усиление, затвор, красный и синий, как описано в шагах 2.5 и 2.6) и настроек для реконструкции траектории (например, пороговые значения цвета и размера, как описано в шагах 3.3, 3.5, 3.11 и 3.12) может иметь большое значение. Опять же, опыт работы с системой будет иметь большое значение для принятия решения о том, что возможно.

В зависимости от цели эксперимента может быть желателен источник света с различными характеристиками (например, спектром, интенсивностью). Светодиодные полосы можно легко заменить. Убедитесь, что свет достигает каждой части контейнера.

Если эксперимент требует, чтобы рыбка данио оставалась в контейнере для наблюдения в течение нескольких часов, обязательно обеспечьте аэрацию. Воздушная трубка может быть прикреплена к правому заднему углу с помощью зажима. Проверьте на экране компьютера, что клип не мешает записи, т.е. что данио рерио ни в коем случае не скрывается от глаз. На рисунках 2А и 2В черный зажим можно увидеть на виде сверху. В идеале аэрация должна быть обеспечена до или между записями, но не во время записи, чтобы предотвратить шум. Также обратите внимание, что включение или выключение сильной аэрации может напугать рыбок данио.

Если эксперимент требует содержания рыбок данио в контейнере на ночь, полезно накрыть камеру наблюдения прозрачной крышкой, чтобы рыбки данио не выпрыгнули (что является очень распространенным явлением). Если крышка не снимается перед записью (чтобы не беспокоить рыбок данио), обратите внимание на следующие два момента: 1) убедитесь, что зеркальные отражения источников света не препятствуют записи (например, путем смещения источников света или выбора крышки, которая отражает свет минимально); 2) учтите, что крышка может запотеть при использовании в течение ночи, тем более что в этом случае также должна быть предусмотрена аэрация; Один из способов уменьшить это – выбрать крышку с небольшими отверстиями в ней.

Для некоторых экспериментов может быть важно определить исходное поведение рыбок данио-рерио перед введением препарата. В этом случае препарат может быть добавлен между сеансами с помощью трубки (аналогично аэрационной трубке, о которой говорилось выше).

Несмотря на то, что основное внимание здесь уделялось регистрации данио-рерио (Danio rerio), другие виды рыб, конечно, также могут быть зарегистрированы с помощью системы. Он был использован для изучения поведения (молоди) золотых рыбок (Carassius auratus), тигрового барбуса (Barbus tetrazona) и зеленого меченосца (Xiphophorus helleri).

Наконец, следует отметить, что в принципе возможны и другие размеры обзорных танков. Тем не менее, это потребовало бы перенастройки системы и поиска хорошего баланса между пространственным и временным разрешением при использовании гораздо больших контейнеров для наблюдения. Кроме того, форма контейнера должна быть прямоугольной. Количество рыбок данио или других подопытных теоретически не ограничено; Однако замена тегов увеличивается с увеличением количества субъектов.

Раскрытие информации

Ханс Маасвинкель, Лицюнь Чжу и Вэй Вэн являются сотрудниками компании xyZfish, Ронконкома, штат Нью-Йорк, которая производит систему слежения, используемую в этой статье.

Благодарности

У авторов нет благодарностей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AABT-3D Аппаратура слеженияxyZfishAABT IIВключает камеру, видеокарту, наблюдательный отсек с зеркалом и подсветкой
AABT-3D Калибровочное оборудованиеxyZfishкалибрСодержит калибровочную панель и боковое зеркало
AABT-3D Контейнеры для наблюденияxyZfishкубики 
Программное обеспечение для отслеживания AABT-3DxyZfishv.1.0 
КомпьютеропциональноН/ДWindows XP или выше
(+)-MK-801 малеат водородаSigmaM107 
Воздушный насосFusion500 
Трубка воздушная 3/16"Ли s Товары для аквариумов и домашних животных14508 
Зажимы для среднего связующегоOfficeDepot561339Для крепления авиалинии к контейнеру для наблюдения

Ссылки

  1. Brennan, C. H. Zebrafish behavioural assays of translational relevance for the study of psychiatric disease. Rev. Neurosci. 22, 37-48 (2011).
  2. Kabashi, E., Brustein, E., Champagne, N., Drapeau, P. Zebrafish models for the functional genomics of neurogenetic disorders. Biochim. Biophys. Acta. 1812, 335-345 (2011).
  3. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth. Defects. Res. C. Embryo Today. 93, 67-114 (2011).
  4. Kurta, A., Palestis, B. Effects of ethanol on the shoaling behavior of zebrafish (Danio rerio). Dose-Response. 8, 527-533 (2010).
  5. Sison, M., Gerlai, R. Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 220, 331-337 (2011).
  6. Delcourt, J., Denoël, M., Ylieff, M., Poncin, P. Video multitracking of fish behaviour: a synthesis and future perspectives. Fish Fish. 14, 186-204 (2013).
  7. Zhu, L., Weng, W. Catadioptric stereo-vision system for the real-time monitoring of 3D behavior in aquatic animals. Physiol. Behav. 91, 106-119 (2007).
  8. System for 3D monitoring and analysis of motion behavior of targets. US patent. , 8306260 (2012).
  9. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6, e17597(2011).
  10. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: a 3-D approach. Behav. Brain Res. 234, 365-374 (2012).
  11. Maaswinkel, H., Le, X., He, L., Zhu, L., Weng, W. Dissociating the effects of habituation, black walls, buspirone and ethanol on anxiety-like behavioral responses in shoaling zebrafish. A 3D approach to social behavior. Pharmacol. Biochem. Behav. 108, 16-27 (2013).
  12. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The advantages of a 3D-automatic recording system for the study of shoaling behavior in zebrafish. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  13. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. An automatic recording system to quantify antagonistic interactions between zebrafish. Abstract. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  14. Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol. Rev. Camb. Phil. Soc. 83, 13-34 (2008).
  15. Krause, J., Hartmann, N., Pritchard, V. L. The influence of nutritional state on shoal choice in zebrafish, Danio rerio. Anim. Behav. 57, 771-775 (1999).
  16. Speedie, N., Gerlai, R. Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 188, 168-177 (2008).
  17. Gebauer, D. L., Pagnussat, N., Piato, A. L., Schaeffer, I. C., Bonan, C. D., Lara, D. R. Effects of anxiolytics in zebrafish: similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and. 99, 480-486 (2011).
  18. Paull, G. C., Filby, A. L., Giddins, H. G., Coe, T. S., Hamilton, P. B., Tyler, C. R. Dominance hierarchies in zebrafish (Danio rerio) and their relationship with reproductive success. Zebrafish. 7, 109-117 (2010).
  19. Engeszer, R. E., Ryan, M. J., Parichy, D. M. Learned social preference in zebrafish. Curr. Biol. 14, 881-884 (2004).
  20. Mathur, P., Guo, S. Use of zebrafish as a model to understand mechanisms of addiction and complex neurobehavioral phenotypes. Neurobiol. Dis. 40, 66-72 (2010).
  21. Tropepe, V., Sive, H. L. Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autism. Genes Brain Behav. 2, 268-281 (2003).
  22. Echevarria, D. J., Hammack, C. M., Pratt, D. W., Hosemann, J. D. A novel behavioral test battery to assess global drug effects using zebrafish. Int. J. Comp. Psychol. 21, 19-34 (2008).
  23. Seibt, K. J., Piato, A. L., Luz Oliveira, da, Capiotti, R., Vianna, K. M., R, M., Bonan, C. D. Antipsychotic drugs reverse MK-801 induced cognitive and social interaction deficits in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain. Res. 224, 135-139 (2011).
  24. Zou, H., et al. Low dose MK-801 reduces social investigation in mice. Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 753-757 (2008).
  25. Ng, M. C., Hsu, C. P., Wu, Y. J., Wu, S. Y., Yang, Y. L., Lu, K. T. Effect of MK-801-induced impairment of inhibitory avoidance learning in zebrafish via inactivation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in telencephalon. Fish Physiol. Biochem. 38, 1099-1106 (2012).
  26. Sison, M., Gerlai, R. Associative learning performance is impaired in zebrafish (Danio rerio) by the NMDA-R antagonist MK-801. Neurobiol. Learn. Mem. 96, 230-237 (2011).
  27. Swain, H. A., Sigstad, C., Scalzo, F. M. Effects of dizocilpine (MK-801) on circling behavior, swimming activity, and place preference in zebrafish (Danio rerio). Neurotox. Teratol. 26, 725-729 (2004).
  28. Vezzani, A., et al. Kinetics of MK-801 and its effect on quinolinic acid-induced seizures and neurotoxicity in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 249, 278-283 (1989).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. J. Neurosci. Methods. 210, 266-271 (2012).
  30. Rung, J. P., Carlsson, A., Rydén Markinhuhta, K., Carlsson, M. L. (+)-MK-801 induced social withdrawal in rats; a model for negative symptoms of schizophrenia. Prog. Neuro-psychopharmacol. Biol. Psych. 29, 827-832 (2005).
  31. Gururajan, A., Taylor, D. A., Malone, D. T. Cannabidiol and clozapine reverse MK-801-induced deficits in social interaction and hyperactivity in Sprague-Dawley rats. J. Psychopharmacol. 226, 1317-1332 (2012).
  32. Burket, J. A., Cannon, W. R., Jacome, L. F., Deutsch, S. I. MK-801, a noncompetitive NMDA receptor antagonist, elicits circling behavior in the genetically inbred Balb/c mouse strain. Brain Res. Bull. 83, 337-339 (2010).
  33. Saunders, J. A., Gandal, M. J., Roberts, T. P., Siegel, S. J. NMDA antagonist MK801 recreates auditory electrophysiology disruption present in autism and other neurodevelopmental disorders. Behav. Brain Res. 234, 233-237 (2012).
  34. Brosda, J., et al. Pharmacological and parametrical investigation of prepulse inhibition of startle and prepulse elicited reactions in Wistar rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 99, 22-28 (2011).
  35. Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 208, 450-457 (2010).
  36. Maximino, C., et al. Parametric analyses of anxiety in zebrafish scototaxis. Behav. Brain Res. 210, 1-7 (2010).
  37. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, e36931(2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3Dzebrafish

Похожие статьи