Протокол для фагов и Affinity выделение с помощью рекомбинантного белка Приманки

Summary

Фаговый дисплей является мощным средством для захвата белки или белковые фрагменты, которые взаимодействуют с иммобилизованным интерес молекулы. Как только решение от типа фага библиотеки кДНК для создания и экран был сделан, протокол, описанный здесь позволяет эффективный выбор сродства, ведущие к идентификации interactors.

Abstract

Использование рекомбинантного фага в качестве каркаса, чтобы представить различные белковые части кодируемые направленно клонированных библиотеки кДНК в иммобилизованных молекул приманки является эффективным средством, чтобы обнаружить взаимодействия. Методика в основном используется, чтобы обнаружить белок-белковых взаимодействий, но молекула приманка будет вызов не должен быть ограничен белков. Протокол, представленные здесь была оптимизирована, чтобы позволить скромный количество приманок, которые будут показаны в повторах, чтобы максимизировать идентификацию независимых клонов, представляющих один и тот же белок. Это позволяет большую уверенность, что взаимодействующие белки, определенные законные interactors молекулы приманки. Мониторинг фага титр после каждого выбора аффинной круглый предоставляет информацию о том, как сродство выбора прогрессирует, а также от эффективности отрицательных контролей. Одним из средств титрование фаг, и как и к чему готовиться заранее, чтобы этот процесс прогрессировать так же эффективно, каквозможно, представлен. Атрибуты ампликонов, полученных После выделения независимого налета выделены которые могут быть использованы, чтобы установить, насколько хорошо сродство выбора прогрессировала. Устранение неисправностей методы, чтобы свести к минимуму ложные срабатывания или обойти упорно восстановлены фаг объясняются. Средства снижения вирусного заражения вспыхнуть обсуждаются.

Introduction

Зачем использовать фага дисплей и выбор сродства вместо множества других методик для выявления и расследования белковых взаимодействий с другими молекулами? Фаговый дисплей может претендовать некоторые уникальные преимущества по сравнению с другими методами обнаружения белка-лиганда взаимодействия ^1-3 включая следующие:

Очень широкий репертуар молекул приманки

Всего причина в том, в разнообразии молекул, способных действовать в качестве приманки в аффинной выбора ^4. Фаг дисплей является очень мощным средством выделения фрагменты белков, которые взаимодействуют с другими белками, нуклеотиды, углеводы и т.д. ⁵ существу, если полимер / молекула может быть присоединена к восстанавливаемой поддержки, он может быть подвергнуты скринингу на сродство фага с отображаемыми белков. Кроме того, молекула приманка может быть доступна, чтобы определить, если он сохраняет биологическую активность при иммобилизации ^6, если условия используется для Rразвиваются / устранить свою деятельность эффективны ⁶ или, ввести пост-трансляционные модификации к приманке до аффинной селекции.

Фага сопротивление внешних факторов

Вторая причина для использования фагового дисплея, является то, что не исключено, что некоторые приманки может потребовать экологического стресса (тепла, высокие концентрации осмолита, конкретные кофакторов, и т.д..), Чтобы привлечь их взаимодействующих белков, или фаг, отображаемые белки возможно, должны быть каким-то образом изменены до аффинной селекции. Основным фактором, изучается взаимодействие между приманки и белка, а не при условии, что позволяет взаимодействие происходит или, если это смертельным для тест-организма. Фага Т7 особенно хорошо подходит для таких исследований, поскольку он может выдерживать суровые условия эксперимента и неповрежденными и жизнеспособным (например, опубликованные тепловой максимум на Т7 жизнеспособности составляет ~ 60 ° C ^7). Как пример, изменяющего фага отображается пробелки, при рассмотрении арабидопсис семян протеома для белковых субстратов ремонта фермента, белка Isoaspartyl Метил Transferease (PIMT), вирус, используемый в этих исследованиях был "в возрасте" в течение одной недели, до каждого выбора аффинной круглые, способствующих внедрению из isoaspartate (isoAsp) остатки в подверженных белков ^6, которые не представляется возможным в организмах, которые могут признать и ремонт / усваивают такие нарушения.

Метаболически инертным

Кроме того, фаг, как правило, устойчивы к метаболическим ядам и вмешательства малых молекул, которые бы, по крайней мере, привести к плейотропных воздействия на метаболически активных тест-организмов. После промывки жесткости, яд удаляется перед большой объем бактерий вводятся для инфекции так яд разбавляют до диапазона безвредны дл бактерий или последующей репликации фага. Расследуя белковые мишени из ремонта PIMTфермент, S-Аденозил метионин (AdoMet) был использован для активации микро-титр-пластинчатый хорошо иммобилизованного фермента, чтобы разрешить захват белка целевой опираясь на S-аденозил гомоцистеина (AdoHcy) для инактивации фермента и обеспечить полезный отрицательный контроль обеспечения в знание того, что вирус не будет оказывать неблагоприятное воздействие либо AdoMet или AdoHcy ^6. Кроме того, члены определенных позднего эмбриогенеза Обильные (LEA) белковых семейств, исследованных в этой лаборатории, как известно, изменить их форму в присутствии добавок, таких как сахароза ^8, которые могут достичь концентрации столь же высоко как 200 мм в семенах сои в точке физиологического погашения ^9. Вирус не ожидается, будут зависеть от того 200 мМ сахарозы в каждом сродство выбора тура, возможно, необходимой для определенных белковых LEA-клиент взаимодействий, которая не относится к автономно жизнеспособных тест-организмов ^10.

Эта лаборатория была сосредоточена на discoverinг белок-белковых взаимодействий в зрелых, обезвоженных или прорастающих семян, лежащих в основе механизма, хранящейся защиты протеома во время обезвоживания ¹¹ или ремонта компонентов хранимой протеома, которые чувствительны к образованию isoAsp раз семя впитал ^6. Таким образом, производство и очистка рекомбинантных белков, необходимых в качестве приманки в активном состоянии, и обеспечение того, чтобы они по-прежнему так, до и после того как они обездвижены, хотя часто трудно, является краеугольным камнем нашей работы. Однако, так как каждый рекомбинантный белок сценарий производство отличается, оптимизируя условия для рекомбинантного белка не будет рассматриваться здесь. Пользователи, настоятельно рекомендуется пытаться, насколько это возможно, чтобы определить, если иммобилизованный белок по-прежнему функционирует (например, если он является ферментом, сделать ферментного анализа в микропланшетном планшета). Это даст некоторую уверенность, что приманка биологически активными и поэтому, что любые обнаруженные взаимодействиянесколько чаще обладают биологической значимости.

Protocol

Графическое отображение с процедурой, описанной ниже (рис. 1) выделяет два основных компонента для аффинной селекции с использованием библиотеки фагового дисплея: A) фагов библиотеку кДНК вероятно, кодируют белки, обладающие сродством к приманке и, B) очищенный рекомбинантный приманки белок. Производство приманки (рекомбинантного белка) была широко рассмотрены и литература с изложением передового опыта в области обеспечения растворимую активную рекомбинантного белка из Е. палочка ^12-13, эукариотической дрожжи ^14, насекомое ^15-16, завод ^17-18 или млекопитающих ^19-20 клеток предостаточно.

В следующем протоколе Помеченный гексагистидиновой меткой рекомбинантный белок был использован в качестве приманки. Это позволяет проверка, что приманка белки остаются в лунках после инкубации в течение ночи и промывки.

1. ИФА для рекомбинантного белка удержания в поверхности лунок планшета Уэллс

1. Маркмикротитрационный планшет с несмываемыми чернилами, и определить, какие скважины будет содержать, какие концентрации белка. Выполните это в 3 повторений скважин. Включите 3 репликаций концентрационный серии отрицательный контроль (не гексагистидиновой с метками белка; BSA работает также этой проверки сведений).
2. Промыть пластины большим количеством воды и удаления воды порка тарелку вверх дном на 4-х слоев бумажных полотенец между стирок.
3. Остановите, в первые 3 скважин, в 100 мкл Трис, рН 7,5, буфер (или по выбору) самую высокую концентрацию рекомбинантного белка (10 мкг / мл). Добавить в следующих трех скважин рекомбинантного белка в точке (1,0 мкг / мл), и т.д., вплоть до 1,0 нг / мл. Сделайте то же самое с концентрацией серии BSA.
4. Обложка блюда полиэтиленовой пленкой и оставить на ночь при 4 ° C.
5. На следующее утро, удаления белка порка тарелку вверх дном на 4-5 слоев бумажным полотенцем.
6. Вымойте скважин 5x 200 мкл 1x TBS каждый раз, оставляя буферв скважинах для ~ 1 мин каждый раз и удаления промывочного буфера порка тарелку вверх дном на бумажные полотенца после каждого мытья.
7. Блокировать ELISA пластины на роторном шейкере с использованием 200 мкл 5% (вес / объем) БСА или 200 мкл 5% (вес / объем) блокирующий реагент в TBS при комнатной температуре в течение 2 часов (или сидя стационарное течение ночи при 4 ° С, если удобно ), завернутые в полиэтиленовую пленку.
8. Удалите излишки раствора блокирующий порка тарелку вверх дном на бумажные полотенца. Вымойте 4x 1 мин каждый раз с 200 мкл 1x TBS, удаления промывочного раствора порка тарелку вверх дном.
9. Развести пента-HIS первичного антитела 1/2, 000 в блокирующем буфере и доставить 100 мкл в каждую лунку. Выдержите 1-2 ч при комнатной температуре с пластиной стационарных.
10. Снимите первичное антитело порка тарелку вверх дном на бумажные полотенца. Вымойте 4x 1 мин каждый раз с 200 мкл 1 × TBST. Удалите каждую стирку порка тарелку вверх дном.
11. Развести вторичного антитела(Антимышиного конъюгат щелочной фосфатазы), в блокирующем буфере и инкубируют 100 мкл в каждую лунку в течение 1 часа при комнатной температуре с пластины в неподвижном состоянии.
12. Снимите вторичного антитела порка тарелку вверх дном на бумажные полотенца. Вымойте 4x 1 мин каждый раз с 200 мкл 1 × TBST. Удалите каждую стирку порка тарелку вверх дном.
13. Поместите 200 мкл пара-нитрофенилфосфат (ПНТЗ) раствора субстрата в каждую лунку. Подложка является твердым при температуре -20 ° С, поэтому сделать аликвоты и получить необходимое количество аликвоты, необходимых для обнаружения из морозильника хорошо загодя поэтому она полностью оттаять на данном этапе.
14. В 30 мин остановить реакцию, добавив 50 мкл 3 М NaOH в каждую лунку.
15. Измерить абсорбцию при 405 нм непосредственно на планшет-ридере ELISA.

Примечание: Если рекомбинантный белок интерес не присоединяться к лункам, можно изменить тыс.е композиция / рН буфера значительно (карбонатном буфере рН 10,0), либо добавить хаотропов (мочевина), чтобы попытаться помочь вложение белка в микротитровальных лунок планшета. Тем не менее, восстановлению, что рекомбинантный белок: 1) остается связанным с поверхности лунок планшета скважин в условиях отбора аффинной и, 2) сохраняет свою биологическую активность после удаления высоким рН / хаотропа рекомендуется.

2. Выращивание бактериальном хозяине (BLT5403) для титрование

1. Автоклав (рис. 2А) десять 250 мл колбы Эрленмейера и 3 культура трубы. Сделать LB жидкость и LB агар для заливки чашках с твердой средой. Холодный LB-агар до 50 ° С и добавляют ампициллин 100 мкг / мл до asceptically вливаются в чашках Петри на блок крышки (рис. 2В).
2. Кроме того, в блок-крышки (фиг. 2В) полоска LB, 100 мкг / мл ампициллина (LB ^AMP100) агаром для одиночных колоний BLT5403 со склада хранится в 15% (объем / объем)глицерин при -80 ° С (рис. 2в). Поместите пластину вверх дном при 37 ° С в течение ночи в инкубаторе для роста (рис. 2D).
3. Утром инокуляции 50 мл LB ^AMP100 в колбу Эрленмейера на 250 мл с одной колонии собирали с пластиной. Инкубировать при 37 ° С, 200 оборотов в минуту в горизонтальном шейкере (фиг. 2Е и 2F), и использовать спектрофотометр для контроля плотности клеток на OD ₆₀₀ = 0,5 до 0,6 (рис. 2H).
4. Налейте клеток в 50 мл сокола трубы или подобное, и держать при температуре 4 ° С до использования (рис. 2 г). Клетки, как правило, остаются жизнеспособными в течение ~ 1 неделю.
5. Сделать 500 мл LB, поместить его в перегородками FERNBACH колбу и автоклав его. Как только он стерилен, не колбу помещают при 4 ° С (рис. 2G) или при комнатной температуре до ночи "День первый" ниже.

Примечание: Хозяин бактериальных клетокBLT5403, экспрессирующих плазмиды переносимых источник Т7 родной капсидного белка, без которого T7 среднего и низкого копирования векторы не может реплицировать успешно, чрезвычайно восприимчивы к вирусу. Крайне важно, чтобы избежать загрязнения. Загрязнение со временем произойдет и в этот момент все поверхности в контакте с вирусом / инфицированных бактерий должен быть стерт с 70% (объем / объем) этанола или промывали с помощью моющего средства (рис. 2i). Если это неэффективно, тщательное обеззараживание всех поверхностей, которые могут выдерживать Envirocide (Рисунок 2j) не требуется. Начните BLT5403 клетки от морозильной складе каждый новый раунд сродства выбора, чтобы помочь смягчить загрязнения складе в 4 ° С, а также обеспечить энергичные клетки используются в протоколе. Фильтр барьерные наконечники имеют важное значение.

3. Affinity Выбор

ДЕНЬ ПЕРВЫЙ

1. Марк микротитровальный планшет с несмываемыми чернилами, и определить, какие скважины будет содержать какой протEins / поправки. (Из-за проблем загрязнения, тарелки никогда не повторно). Выполните это в 3 повторений скважин для каждого белка и лечения.
2. Промыть пластины большим количеством воды и удаления воды порка тарелку вверх дном на 4-х слоев бумажных полотенец между стирок. Остановите, в 100 мкл Трис, рН 7,5, буфер (или по выбору) рекомбинантного белка (10 мкг / мл) в шести скважинах, или BSA (10 мкг / мл) в трех лунках, в общей сложности 9 скважин для первого раунд сродства выбора. Обложка блюдо с полиэтиленовой пленкой и оставить на ночь при 4 ° С (рис. 2G).
3. Убедитесь, что есть 9 х 250 мл колбы Эрленмейера (см. 2.1 выше), очищенные, автоклавного и меченые соответствующим (кодирование с цветной лентой работает хорошо, рисунок 2F).
4. Рассчитать объем лизата фага использовать для каждой лунки на основе титра библиотеки и используемого количества фага быть экранированным.
5. Убедитесь, что свежие BLT5403 клетки готовы к использованиюдля титрование этот выбор сродства круглый завтра (рис. 3а).
6. Обеспечить достаточную 1x TBS (150 мМ NaCl, 50 мМ Трис базы, рН 7,6) и 1x БВУ ​​(1x TBS + 0,05% (объем / объем) Твин 20) доступны для выполнения 10 х 200 мкл моет для числа скважин используется . Кроме того, preincubate в БВУ при температуре отбора сродство. Убедитесь, что резервное копирование, герметичный, 50 мл Сокол трубки 1x TTBS существует при температуре отбора сродство с достаточной 1x TTBS.
7. Подготовьте 3 процедуры х 3 повторений х 3 трижды по 1,5 мл пробирки Эппендорф (27 всего) с 990 мкл LB ^{100 AMP} каждого и маркировать соответствующим образом (например, 10 ^-2). Они предназначены для зараженных бактерий, полученных из поверхности лунок планшета скважин завтра. Отметить разбавление на одной стороне трубы (10) ^-2 и число возрастанию на другой стороне ("1"). Для каждого пробирку Эппендорф, также маркировать один боросиликатного трубки и один LB ^{100 AMP} пластину. В этом WAY, пластины и тестовые пробирки из боросиликатного пронумерованы 1, 2, 3, 4, 5, и т.д.. сделать титрование идти быстрее. После простой номер может быть согласована с разбавлением и обработки на пробирку Эппендорфа (например, # 12 трубка была третьей трех экземплярах первого репликации контролем BSA для разбавления 10 ^-5). Храните Эппендорф труб и LB ^{100 AMP} пластины в течение ночи при 4 ° С (рис. 2G и 3В).

Например: Начните маркировка 1,5 мл Eppendorf трубки в течение трех 10 ^-2 разведения фага от BSA репликации один также 1, 2 и 3 (трех чтениях тройные фага титра для репликации одной), а затем отметьте боросиликатного пробирки 1, 2 и 3, в которых зараженные бактерии будут смешаны с неинфицированными бактерий и верхней агарозы перед заливкой на LB ^{100 AMP} чашках с агаром (фиг.3С).

8. Для последовательного гilutions, этикеток Эппендорф труб и, в каждой, добавить 900 мкл LB ^{100 AMP.} После того, как исходные разведения (10 ^-2) зараженных бактерий выполнены для каждого белка / лечения, репликации и трех экземплярах, завтра, они будут хорошо перемешивают и 100 мкл взят от них и добавляется в соответствующий пробирку Эппендорфа, содержащую 900 мкл ^{LB-100 AMP} для разбавления 10 ^-3 (труб 4, 5, и 6 для репликации одного элемента управления BSA). Они будут хорошо перемешивают в свою очередь и 10 ^-3 разведения будет использоваться, чтобы сделать 10 ^-4 разведений (7, 8, 9). Используйте 10 ^-4 разведения для 10 ^-5 разведениях (10, 11, 12), и т.д.. чтобы получить титр для первого из трех повторностях BSA (скважины).
9. То же самое будет сделано для BSA репликации два (ну 2), БСА репликации три (ну 3), три копиями отравленной приманки, и, наконец, три копиями удочку скважин. В конце концов, должно быть трубы меченые еROM 1-135 (135 является последним трех экземплярах из последней репликации приманки при максимальном разведении 10 ^-6). Хранить эти пробирки Эппендорфа в течение ночи при 4 ° С (Фигура 3С показывает Eppendorf и боросиликатного трубы для всех разведений в трех повторах трех повторностях (три скважины) БСА.
10. Начните 2 или 3 культуры трубки BLT5403 клеток (определена из отдельных колоний из только что прожилками ночь LB ^AMP100 пластины, из стадии 2.2 выше), растущие в инкубационной шейкере (рис. 2E и 2F) в качестве ночной культуры. К 500 мл LB (точка 2,5) выше, добавляют ампициллин в концентрации 100 мкг / мл и колбу помещают FERNBACH в зажиме в инкубаторном шейкере так что будет при 37 ° С и газированные на следующее утро (рис. 2F).

Примечание: Круглый три и четыре может потребовать приблизительные разведения целых 10 ^-10 объема рХадж к объему Л.Б. ^AMP100.

ДЕНЬ ВТОРОЙ

11. На следующее утро, поместите автоклавного, пустые 9 х 250 мл колб Эрленмейера (по одному на планшете для микротитрования а) в зажимах в инкубации шейкере. Привить 500 мл LB ^{100 AMP} с 500 мкл от одного из ночных культур BLT5403 клеток начали вчера вечером (см. шаг 3.8 выше), запечатать и начать это растет (37 ° C, 220 оборотов в минуту). Включите спектрофотометра (Рисунок 2H) и установить его на измерить оптическую плотность при 600 нм.
12. Удалить планшет от 4 ° С, удалите пластиковую пленку, и удаления несвязанного белка из пластины промывкой 10x 200 мкл каждый раз из 1x TBS рН 7,5 и чмокает тарелку вверх дном на бумажное полотенце между стирок. Блок 200 мкл 5% (вес / объем) БСА или 200 мкл 5% (вес / объем) блокирующий реагент в TBS в течение 1 часа (или на ночь, если удобно) с пластиной, обернутой в полиэтиленовую пленку.
13. Смыть блокирующий секЕШЕНИЕ 10x 200 мкл каждый раз из 1 × TBST, чмокает тарелку вверх дном на 4 слоев бумажным полотенцем между стирок. Можно пополнить скважин с 200 мкл воды на этом этапе, покройте их полиэтиленовой пленкой и поместить их при 4 ° С для хранения для максимальной 1 недели.

Примечание: Запустите культуру достаточно скоро, что, к тому времени, фаг заражен-BLT5403 от завершения выбора аффинной готовы добавить, клетки в 500 мл составляет от 0,6 до 1,0 OD _600. Если они растут далеко за пределы 1,0, лизис может не произойти из-за ресурсных ограничений, как клетки подойти неподвижной фазы. Если клетки не достигают наружный диаметр ₆₀₀ 0,6 крайней мере до введения фага, множественность инфекции может быть слишком высокой, быстро убивать клетки, которые могут влиять на представление лизата. Если клетки еще не приближается к OD ₆₀₀ 0,6 по завершении отбора сродство, ИНОКУлате колбу с более BLT5403 от второго (или даже от обоих второй и третий) пробирки встряхивании при 37 ° C (рис. 2F). Если ОП ₆₀₀ 1,0 приближается слишком быстро, выключите обогреватель и шейкер и откройте крышку, чтобы охладить культуры и голодать бактерии для кислорода. Возобновить отопление / встряхивая раз фага были добавлены.

Отсюда использовать фильтр барьерные советы, чтобы избежать фага перекрестного загрязнения.

14. После колбу засевают, положить фаговой библиотеки (100 мкл) в с белками, запечатать табличку с пластмассовой оберткой и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
15. На 55 мин, запись OD ₆₀₀ клеток. Время удвоения примерно каждые 20 минут. Закон соответственно (см. "Примечание" выше).
16. В конце одного часа удалить пластмассовую обертку из пластины и сразу же мыть при встряхивании из фаг в преобразованной отходов, а затем быстро добавлением 200 мкл 1х ТБST. (Используйте multipipettor с мкл головы 1 = 100 и пипетки набор на 2 [т.е. обеспечивает 200 мкл / поршень депрессия] для этого, и это идет быстро). Установите таймер в течение 1 мин. После 1 мин, вытряхнуть буфер в преобразованной отходов, привкус пластины с ног на голову на бумажном полотенце и положите обратно на скамейке (25 ° С пластины). Повторите промывание шаги 10x.
17. После ^10-го мытья, возьмите 200 мкл BLT5403 клеток из 50 мл трубки Сокол при 4 ° С и положить их в нижней части скважины, из которых последний мыть TTBS была удалена. Оберните пластин в пищевую пленку и положить на 37 ° С в течение 20 мин, чтобы получить любую фаг еще застряли на приманку, чтобы заразить бактерии (см. примечание в обсуждении по поводу упорно извлекается фага и / или высокий фон от разбора связывания фага).
18. В конце 20 мин, развернуть тарелки и занять 10 мкл бактерий из BSA при 25 ° C репликации один скважины и положить его в 990 мкл LB ^{100 AMP} отмеченных"1". Повторите еще два раза по этой скважине (трубки 2 и 3), в результате 3 трех повторах в 1/100 разбавлений фага с, что хорошо. Это БСА репликации один пробы три раза. Эти разведения будет использоваться для оценки среднего титра ± SEM для этого репликации BSA.
19. Сделайте то же самое для репликации 2 и 3 BSA (три три образца из 10 мкл каждого), за три реплицированными скважин отравленной белка приманки, и для белка приманки. Установите эти 27 Эппендорф труб в сторону и получить оставшиеся 170 мкл зараженных бактерий в скважинах растущих к лизису.
20. Если бактерии в колбе при OD ₆₀₀ = 0,6-1,0, декантируют 50 мл клеток из FERNBACH колбу в каждой из девяти 250-мл колбы Эрленмейера. Возьмите оставшиеся 170 мкл инфицированных фагом BLT5403 бактерий в репликации BSA 1 хорошо и добавить его в 50 мл клеток, помеченных "БСА Вес 1" (желтая лента). Делайте это в течение всех девяти скважин и положить их встряхивании в инкубаторе ( Рисунок 2F).
21. Монитор ячейки в 37 ° C инкубации шейкере от времени до времени лизиса (около 3 ч с момента прививки). Внесите разведения от 27 начальных разведениях (10 ^-2) в соответствующих случаях, помеченных Эппендорфа в течение этого времени.
22. Для выполнения этих разведения из начальных 27 разведений от 3,12 выше, принять 100 мкл LB с бактериями из трубки Эппендорф 1 (БСА репликации одной, первой из трех параллельных пробах из этой разведение 1/100 от этого хорошо) и добавить его в 900 мкл LB в пробирку Эппендорфа 4 (1 х 10 ^-4 разбавление BSA репликации один, первый из тройных образцов из этого хорошо).
23. Откажитесь кончик фильтра барьер на новый прежде, чем получить 100 мкл LB с бактериями из трубки Эппендорф 4 добавить к 900 мкл LB в пробирку Эппендорф 7 (1 х 10 ^-5 разбавление BSA репликации одной, первой из трех экземплярах образцы из этой скважины). Продолжить разведения (Dсамостоятельно до 1 х 10 ^-6) для всех трех повторах всех повторений всех белков и лечения (135 пробирки).
24. Как только клетки лизировали, довести культуру до 0,5 М NaCl добавлением 5 мл из 5 М NaCl складе и передачи с меченым центрифуги бутылки.
25. Центрифуга при 8000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Слейте супернатант (вирус) в чистую, стерильную 50 мл трубки Сокол.
26. Добавить несколько капель хлороформа, декантированной супернатанта в трубки Сокол.
27. Хранить при температуре 4 ° С в течение следующего раунда аффинной селекции.

4. День третий

1. Автоклаве или отбелить все лабораторное оборудование, которое использовалось в производстве этот выбор сродства вокруг, чтобы подготовиться к следующему раунду.

5. Титрование

1. Количество столько твердых LB ^{100 AMP} пластин, поскольку есть разведения в порядке возрастания (там должны теперь быть 1 пластина для каждого боросиликатного трубки и трубки Эппендорф, каждый с тем же номером). Рут пластин в 37 ° С инкубатор (рис. 3D).
2. Растопить верхнюю агарозы (1,0 г бактотриптон, 0,5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl, 0,6 г агарозы, сделать на 100 мл, автоклав), ослабив верхнюю агарозы крышку бутылки и поочередно в микроволновой печи бутылку и закрученной не смешивать его до верхней агарозном полностью растают. Поместите бутылку в водяной бане остыть до 50 ° C (рис. 3Е).
3. Возьмите мл пипетки из боросиликатного 10 с пипетки насоса прилагается. Зажгите горелку. Поверните держатель пенополистирол трубки сокола или кулер крышку вверх дном на скамейке и положите пластины LB100 AMP с 1 по 6 (только что из инкубатора 37 ° C) на нем, плиты 1 верхний (рис. 4А). Пенополистирол сохраняет пластин тепло.
4. Поместите 250 мкл клеток BLT5403 от 4 ° С в каждый из пронумерованных тестовых трубках из боросиликатного приготовленных в один день выше (раздел 3.7 и фиг.4В и 4С). Арканзасдиапазоне пронумерованные боросиликатного трубы в той же серии, как восходящего разведений в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл (фиг.4А).
5. Положите 100 мкл от разведения в пробирку Эппендорф 1 в 250 мкл клеток в боросиликатного пробирке 1 (рис. 4D и 4E). Нагрейте первые 5 в пипетки над огнем немного (не слишком много! ~ 3 пойло, рис 4F) и окунуться в расплавленном верхней агарозы. Потяните вверх 3 мл и доставить БЫСТРО в пробирку в верхней части клеток / фага (рис. 4G).
6. Смешайте, щелкая пальцем, держа трубку с другой стороны (рис. 4H) и вылейте содержимое на тарелку (рис. 4I). Наклоните тарелку и использовать пробирку, чтобы преследовать пузыри и сухие пятна, пока вся пластина не покрыта верхней агарозы. Установите его в сторону, прямо на скамейке, чтобы охладиться.
7. Откажитесь от боросиликатного трубки, извлеките наконечник фильтра барьер, получитьсвежий один и продолжать, пока все разведения не были покрытием. Получение LB ^{100 AMP} пластины из инкубатора, поскольку они не будут исчерпаны, но не более 6 в то время, или они охлаждаются и верхней агарозы слишком быстро затвердевает.
8. Как только верхний агарозы является твердой, включите пластины с ног на голову (ВАЖНО СДЕЛАТЬ ЭТО). В противном случае, агар / агарозы "плачет", конденсируется на крышке, падает на верхнем агарозы и работает над ним, принимая фаг с ним делает невозможным титр точно) и либо: 1) поставить тарелки в 37 ° С инкубатор [вернуться 4 ч спустя подсчитать титр как Т7 агрессивен] ИЛИ: 2) Оставьте их с ног на голову на скамейке, и они готовы на следующее утро рассчитывать титр.
9. Принимая все необходимые меры предосторожности для защиты от стеклянной разрушения или повреждения, если он, поместите верхнюю агарозы бутылки крышку на свободно и микроволновой верхней агарозы, пока не закипит. Сделайте это в два раза. Пусть это круто, затянитеКрышка и спрятал его. Поверните водяной бане до своей обычной температуре или отключить его. Положите разведения в 4 ° C холодильник. Они будут необходимы для интерпретации титры и / или повторить некоторые из титрование.

6. Определение и расчета титра

1. Осмотрите мемориальную доску, выполненную на пластинах и отбросить те, с конфлюэнтного лизиса (5А например 10 ^-2 разведения). Определите, какие из оставшихся серийных разведений дали достаточно несколько налет чтобы можно было правильно подсчет (5А-й 5B). Записать число бляшки с этими пластинами (табл. 1; фиг.5В).
2. Умножьте количество налета на разведении, а затем умножить это число на 100, чтобы получить число бляшкообразующих единиц на мл зараженных бактерий, взятых из скважин (т.е. всего 10 мкл инфицированных бактерий были взяты для каждого из трех повторах и со это следует умножить на 100, чтобы получить рассчитывает на мл). Нормальное количество бляшкообразующих единиц (PFU) на миллилитр (PFU / мл неразбавленного инфицированных бактерий, взятых из лунок планшета также), по трем трижды, взятых из этого хорошо.
3. Форма Гранд среднем из бирок для трех повторных скважин и рассчитать стандартную ошибку этого среднего (табл. 1). Это то, что будет записано в фигуре увеличением фага титра для каждого выбора аффинной раунда и лечения (рис. 5C).

7. Налет Изоляция, ПЦР и секвенирование

1. В конце сродства отборочного тура 4 выберите 18 человека, вполне определенной, бляшки колонии и, с помощью стерильной пипетки Пастера зубочистку, желтый пипетки или аналогичное устройство, основные эти бляшки от титрование пластин. При использовании трубки или советы, первый смачивать внутри с Трис-HCl, рН 8,5 в пробирку Эппендорфа (рис. 5D).
2. При использовании трубки, убедитесь, что боросиликатного трубки не владеет лишние капли Трис, нажмите на лампу и, с его по-прежнему сжаты, нажмите кончик боросиликатного пипетки через хорошо изолированной налета право на пластиковой чашке Петри ниже (Рисунок 5E). Отпустите шарик с кончика пипетки еще в агар / верхней агарозы и подлизываться ядро (рис. 5F, см. стрелку).
3. Извергните ядро в 100 мкл Трис-HCl, рН 8,5 в соответствующем трубки (рис. 5 г) и вихревые кратко.
4. Нагреть 20 мкл из этого объема при 65 ° С в течение 10 мин.
5. Центрифуга обогреваемый объем при 13000 х г в настольной центрифуге при комнатной температуре в течение 10 мин. Принимать 3 мкл из супернатанта этого аликвоты, которые будут использоваться в ПЦР-реакции с Т7-UP и T7-ВНИЗ праймеров.
6. Для каждого из изолированного доски 18, подогрев решения, сделать 50 мкл ПЦР-реакции с использованием температуре отжига 58 ° С и 35 циклов.
7. Запуск 20 мкл EACч реакции на 1% (вес / объем) агарозном геле, содержащем 0,015% (объем / объем) бромистый этидий. Визуализация с трансиллюминаторе используя соответствующую защиту для глаз и нитрильного лабораторные перчатки. (ВНИМАНИЕ: этидийбромида является мощным мутагенным.) Сфотографируйте гель и распоряжаться загрязненных материалов должным образом (рис. 6А и 6В).
8. Если ампликоны одиночные продукты, а не от пустого вектора (продукт проходит вблизи 100 б.п. на 1% (в / о) TAE агарозном геле; 6А и 6Б стрелки), очистить оставшиеся 30 мкл для использования в качестве шаблона для секвенирования. Если ни один продукт на геле (рис. 6В, бляшки 15), вырезать наиболее важную группу (ы) из геля и извлечь ДНК из геля с использованием набора.
9. Последовательность ампликоны, которые не пустые векторы, использующие T7-UP грунтовку.
10. Осмотрите каждую последовательность для компоновщика оружия и, на основании этой информации, определить, где начало вставки находится. Используйте батак в оригинале Часовой Выравнивание Инструмент поиска (BLAST; Национальная медицинская библиотека), чтобы определить личность кодируемого кДНК, будь то вставка находится в кадре и, если да, то в какой части последовательности, кодирующей белок (CDS) была показана и захвачен приманки.

Results

Будучи в состоянии ухудшить способность приманки, чтобы взаимодействовать с фаговых дисплеев белков (метаболически отравления приманку) обеспечивает мощный отрицательный контроль за этой техникой. Кроме того, целесообразно, чтобы определить, приманка, при связывании с поверхности лунок планшета хорошо, сохраняет свою функцию. Оба этих проверок увеличит уверенность, что взаимодействующие, фаге белки, выделенные на nonpoisoned приманки являются законными.

Отбор проб три трижды из каждой лунки ...

Discussion

При запуске эксперимента в трех реплицированных скважин, независимо приобрела фаг того же связывания с белками к приманке можно выделить даже если они одинаковы клон (т.е. нет разницы в нуклеотидной последовательности района CDS, что было приобретено, но они были извлекаются из независимых скважин). В противном случае, единственный способ различать фага, кодирующей тот же белок, связывающийся с приманкой, если они представляют собой независимо обратной транскрипции регионы, которые отличаются в некоторой части ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Триптон	Бектон Дикинсон Ко.
Экстракт дрожжей	Becton Dickinson	212750
Агар	Becton Dickinson	214010
Хлорид натрия	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Блокирующий реагент	EMD Chemicals Inc.	69064
Подросток 20	Fisher Scientific	BP337-100
Гидроксид натрия	Fisher Scientific	BP359-212
Додецилсульфат натрия	Fisher Scientific	BP166-500
Трис Base	Fisher Scientific	BP152-5
Хлороформ	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Генотип: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt Research	Products International	A40040
Бромид этидия	Fisher Scientific	BP102-1
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Пента-HIS первичное антитело	Qiagen Inc.	34660
Конъюгат козий противомышиный щелочной фосфатица	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
Грунтовка T7-UP	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
грунтовка	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
Набор для очистки ПЦР	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick набор для экстракции геля	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Набор для секвенирования циклов	Invitrogen Life Technologies	4336917
нагревательный блок	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96-луночные планшеты для клеточных культур	Corning	Costar 3590
Isotemp Инкубатор Печь	Fisher Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ в	Fisher	Scientific 13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Перчатки, нитрил	Fisher Scientific	19-170-010C
Стерильные 1,5 мл	тубы США Scientific Inc	1615-5500
10 мл Боросиликатные пипетки	Fisher Scientific	13-678-25E
Боросиликатные пробирки для культивирования	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, планшетный ридер ELISA	Labsystem и Flow Laboratories, Хельсинки, Финляндия	Type 362