Guided Скрининг Материалы подхода к разработке количественных полученных золь-гель Microarrays Белки

Summary

Ориентированного подхода отбора материала для разработки полученных золь-гель белка легированных микрочипов использованием новых пин-печать способ изготовления описан. Эта методика продемонстрирована путем разработки ацетилхолинэстеразы и мультикиназный микрочипов, которые используются для экономически эффективного малые молекулы скрининга.

Abstract

Microarrays нашли применение в развитии высокой пропускной способностью для анализа новых материалов и открытие малых молекул приводит препарата. Здесь мы описываем управляемый подход скрининга для идентификации материала золь-гель на основе материалов, которые пригодны для получения трехмерных микрочипов белка. Подход сначала идентифицирует материалов, которые могут быть напечатаны в виде микрочипов, сужает количество материалов путем определения тех, которые совместимы с данным ферментативного анализа, а затем в камень на оптимальных материалов на основе удержания максимальной активности фермента. Этот подход применяется для разработки микрочипов подходит для двух различных анализах фермент, один использованием ацетилхолинэстеразы, а другой с помощью набора из четырех ключевых киназ, участвующих в рак. В каждом случае можно было производить микрочипы, которые могут использоваться для количественного малые молекулы скрининга и производства зависит от дозы кривые ингибитор реакции. Важно отметить, что способность экранировать многие матриалов подготовил информацию об виды материалов, которые лучше всего подходят как производства микрочипов и сохранения активности ферментов. Материалы данные дают представление основных требований материала, необходимого для пошива оптимальный высокой плотности полученных золь-гель микрочипов.

Introduction

Microarrays завоевали популярность в научном сообществе как способ увеличения пропускной анализа. С развитием технологии микрочипов для оценки экспрессии генов ¹ в середине 1990-х, микрочипы нашли применение в развитии высокой пропускной анализов для выявления белок-белковых и белково-Малые взаимодействия молекул и найти новых материалов с уникальными свойствами. ^2-5 Совсем недавно микрочипов были разработаны котором конкретные материалы используются для иммобилизации функциональных белков, образуя трехмерную микрочипов элемент, в котором белки захватываются, что обеспечивает легкое измерение ферментативной активности и ингибирование микрочипов себя, используя подходящий флуоресценции анализ, который соединен с подложкой оборота. ^5-10 Важно отметить, что такие микрочипы могут быть разработаны, чтобы включить все компоненты, необходимые для скрининга образцов и контролей вместе в высшей степени параллельно моды. ^5,8

Ранние примеры белка микрочипов, как правило, получают с использованием стандартных методов иммобилизации белков на твердые носители, такие как ковалентное присоединение, ¹¹ сродства захвата ³ и физической адсорбции. ¹² Хотя эти методы биологической иммобилизации позволяет увеличить концентрацию образца и ускоренного кинетика реакции необходимы для Анализ миниатюризации, каждый из них страдает недостатками. В общем, все вызывают снижение родной биомолекулы функциональности вследствие химической модификации поверхности, пространственно затрудненные доступ к активным центрам или неправильной ориентации из-за неспецифического иммобилизации. Таким образом, все методы приводят к снижению чувствительности анализа, несмотря на увеличение осаждение биомолекул, ответ, вероятно, возникает из-за необходимости искусственно связывать биомолекул на поверхности.

Новый подход к производству функциональных биомолекулы микрочипов через штифт печати белка, легированногозоли диоксида кремния на твердые носители, которые обычно либо функционализированный предметные стекла или отдельные лунки пластинок микролуночные. Золь-гель процесс сам по себе происходит в водной среде при комнатной температуре, а это жидкий предшественник, который напечатан а затем гели для улавливания биомолекул в 3D-матрицы, что обеспечивает высокое содержание белка загрузки ^13, а также улавливание нескольких компонентов в пределах и тот же элемент микрочипов. ^13,14 пошива из полученных золь-гель материал может быть сделано путем тщательного подбора различных предшественников диоксида кремния, а также путем изменения водного компонента посредством использования различных буферов (рН, ионная сила), и включение различные добавки (полимеры, небольшие молекулы), чтобы достичь оптимального материала, специфический характер которого зависит от биомолекулы, захваченной ^10.

Потенциальным ограничением, связанные с разработкой полученных золь-гель микрочипов белка через контакт-печатьнеобходимость выявления золь-гель на основе композиционных материалов, которые могут быть напечатаны без гелеобразующее в контактный или показ нежелательных свойств (невоспроизводимой размеров пятна, трещины, плохая адгезия, несовместимость с анализа компонентов, низкая активность белка) После печати на поверхности. ⁵ одновременных оптимизации всех этих параметров исключает материалов подход котором может быть выполнена заново, либо рассмотрены медленно в последовательной манере. С другой стороны, случайные скрининг многие тысячи или десятки тысяч материалов, ни времени, ни-рентабельным.

В этой статье мы опишем направлены скрининга подход, который позволяет быструю идентификацию подходящих материалов для производства белковых микрочипов без необходимости случайно скрининга большого количества материалов. Использование управляемых подход, материалы, пригодные для печати микрочипов, сначала идентифицируют с последующей серией мелких экранов, чтобы определить оптимальный полученных золь-гель материаловдр. комбинаций, которые могут быть напечатаны воспроизводимым, без трещин и совместимы с данным анализом. Наконец, оптимальные материалы идентифицированы на основе сохранения ферментативной активности и производительности в конечном малые молекулы скрининге. Таким образом, оптимальные материалы могут быть идентифицированы из многих тысяч кандидатов с использованием только несколько сотен шагов анализа. Покажем это подход к изготовлению и высокой плотности ацетилхолинэстеразы и мультикиназный микрочипов и использование таких микрочипов для малых молекул скрининга.

Protocol

1. Подготовка Добавка Решения

1. Подготовка 25 и 50 мМ трис (гидроксиметил) аминометана (Трис-основание, M _т 121,14 г / моль) и HEPES (M _т 238,3 г / моль) при рН 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0 и 8,2 в 50 мл центрифужные труб. Отрегулируйте рН с использованием 1 N HCl и NaOH соответственно. Хранить при комнатной температуре и замены через 3 месяца.
2. Подготовка 24% (вес / объем) поли (виниловый спирт) (ПВС): вес 2,4 г ПВС (М _ш 9000 - 10000, 80% гидролизованный) и добавляют к 10 мл деионизированной дистиллированной воды (DDH ₂ O), растворяют Гранулы полимера на вортексе. С помощью 24% (масса / объем) раствора с получением равных объемов 16% (вес / объем), 12% (вес / объем) и 8% (вес / объем) PVA решения. Дега решений путем обработки ультразвуком перед использованием. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
3. Подготовка 24% (вес / объем) полиэтиленимин (PEI): добавить 4,8 мл PEI (M 1300 _Вт, 50% (вес / вес) в H ₂ O) в 5,2 мл DDH ₂ O. С помощью 24% (масса / объем) раствора с получением равных объемах16% (вес / объем), 12% (вес / объем) и 8% (вес / объем) PEI решений. Дега решений путем обработки ультразвуком перед использованием. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
4. Подготовка 60% (вес / объем) полиэтиленгликоль (PEG): вес 6 г ПЭГ (М _ж 600) и добавляют к 10 мл DDH ₂ O растворить полимер окатышей на вортексе. Использование серийного разведения для подготовки равным объемом 30% (масса / объем) раствора ПЭГ. Дега решений путем обработки ультразвуком перед использованием. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
5. Подготовка 24% (об / об) N-(3-триэтоксисилилпропил) gluconamide (GLS) добавляют 480 мкл GLS (50% в этаноле - запас GLS может потребовать использования на водяной бане нагреть и растворить раствор ли кристаллический), чтобы 520 мкл 95% (об / об) этанола и перемешивают в течение 20 минут с помощью ультразвука. С помощью 24% (объем / объем) раствора, чтобы сделать равным объемом 16% (объем / объем) раствор GLS. Сделайте свежие решения для использования в день.
6. Подготовка 24% (объем / объем) метилтриметоксисилана (MTMS) добавляют 240 мкл MTMS до 760 мкл существующих подкисляют DDH ₂ O (рН 2,0, 1 N HCl) и перемешивают в течение 20 мин при помощи ультразвука. С помощью 24% (объем / объем) раствора, чтобы сделать равным объемом 16% (объем / объем) MTMS раствора. Сделайте свежие решения для использования в день.
7. Подготовка 24% (объем / объем) бис [(3-methyldimethoxylsilyl) пропил] полипропилен оксид (MDSPPO) добавляют 240 мкл MDSPPO до 760 мкл существующих подкисляют DDH ₂ O (рН 2,0, 1 N HCl) и перемешивают в течение 20 мин при помощи ультразвука. С помощью 24% (объем / объем) раствора, чтобы сделать равным объемом 16% (объем / объем) MDSPPO раствора. Сделайте свежие решения для использования в день.
8. Подготовка 24% (объем / объем) 3 - (аминопропил) триэтоксисилана (APTES) добавляют 240 мкл APTES до 760 мкл существующих подкисляют DDH ₂ O (рН 2,0, 1 N HCl) и перемешивают в течение 20 мин при помощи ультразвука. С помощью 24% (объем / объем) раствора, чтобы сделать равным объемом 16% (объем / объем) APTES раствора. Сделайте свежие решения для использования в день.
9. Подготовка 24% (объем / объем) бис (triethoxysily) этан (бис-ТЭОС): добавление 240 мкл бис-TEOS до 760 мкл существующих подкисленной DDH ₂ O (рН 2,0, 1 N HCl) И перемешивать в течение 20 мин при помощи ультразвука. С помощью 24% (объем / объем) раствора, чтобы сделать равным объемом 16% (объем / объем) бис-TEOS раствора. Сделайте свежие решения для использования в день.
10. Подготовка 24% (объем / объем) carboxyethylsilanetriol (Si-COOH): добавление 960 мкл Si-СООН (25% в DDH ₂ O) в 40 мкл существующих подкисляют DDH ₂ O (рН 2,0, 1 N HCl) и перемешивают в течение 20 мин при помощи ультразвука. С помощью 24% (объем / объем) раствора, чтобы сделать равным объемом 16% (объем / объем) Si-COOH раствора. Сделайте свежие решения для использования в день.
11. Отдельно получают 3 мМ N _ε - ацетил-L-лизина, D-сорбит, α, α-трегалозы (М _г 188,22 г / моль, 182,17 г / моль, и 378,33 г / моль, соответственно) и 1,5 мМ Тритона Х-100 (средняя M _W 625 г / моль) в DDH ₂ O. Объем может варьироваться в зависимости от того, сколько требуется, чтобы свежие решения для использования в день.
12. Подготовить 60% (м / м) глицерина: добавить 2,4 г безводного глицерина до 1,6 г Ddh ₂ O, микс от вихря. Дега решенияультразвуком перед использованием. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
13. Подготовить 30% (м / м) глицерина: добавить 1,6 г безводного глицерина до 2,4 г Ddh ₂ O, микс от вихря. Дега решение путем обработки ультразвуком перед использованием. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.

2. Подготовка Золи кремнезема

Следуя приведенным ниже инструкциям, соответствующим зола, когда держится на льду, могут быть использованы до 1 часа после добавления воды. Золи использован за пределами 1 часа приводят к сниженному / несовместимых раз материал гелеобразования.

1. Получение натрий-силикатных (SS) золя на основе
   1. Взвешивают 120 г ионообменной смолы в 500 мл пластиковый стакан.
   2. Добавить 150 мл 0,1 N HCl и перемешивают в течение 1 часа, используя 2-дюймовый магнитной мешалкой.
   3. Раствор фильтруют на воронке Бюхнера подключены к вакуум.
   4. Медленно добавляйте Ddh ₂ O мыть отфильтрованной смолы до Полученный фильтрат не станет четким. Процедура занимает около 100мл DDH ₂ O.
   5. Собирать и хранить подготовленную смолу в пластиковом контейнере при комнатной температуре в течение 1 месяца.
   6. Взвешивают 2,59 г силиката натрия (СС, 27% ​​(вес / вес) SiO _2, 10% (вес / вес) NaOH) в 50 мл пластиковый стакан.
   7. Добавить 10 мл DDH ₂ O на ПС. Хорошо перемешать вручную, чтобы перемешать раствор.
   8. Взвесить 5,60 г подготовленного смолы в отдельный пластиковый стакан 50 мл. Добавить в раствор силиката натрия и перемешивают в течение 2 мин, используя один дюйм магнитной мешалкой.
   9. Смесь фильтровали раствор через воронку Бюхнера соединен с аспиратором прикреплен к водопроводному крану.
   10. С помощью 10 мл пластиковый шприц, снабженный 0,2 мкм мембранный фильтр для фильтрации раствор золь. Это приводит к золь с 5,6% (вес / вес), кремнезем называют SS ​​далее в тексте. Хранить золу на льду, когда он не используется.
   11. ½ SS: добавить 1 мл готового SS золь к 1 мл DDH ₂ O, перемешать с помощью вихря. Хранить золу на льду, когда он неиспользовании.
2. Подготовка diglycerylsilane (DGS) золь на основе
   1. Обобщить DGS как описано в другом месте. ^15,16 магазина кристаллических DGS в эксикаторе при комнатной температуре на срок до 6 месяцев.
   2. Взвесить примерно 1 г кристаллического DGS.
   3. Используйте ступку и пестик для измельчения DGS в мелкий порошок. Этот шаг следует как можно быстрее для предотвращения поглощения влаги из воздуха.
   4. Тщательно передачи мелко DGS землю в пустую 20-мл сцинтилляционный флакон, запишите массу (до тысячной доли грамма).
   5. Добавить DDH ₂ O, получая 0,5 г / мл АРД.
   6. Разрушать ультразвуком гидролизуется DGS на льду в течение 20 мин, перемешайте вихрь в течение 5 секунд каждые 5 минут. Во влажные дни, полное растворение DGS может потребовать добавления 10 мкл 1 N HCl. Это должно быть добавлено к раствору перед обработкой ультразвуком.
   7. С помощью 3 мл пластиковый шприц снабжен 0,2-мкм мембранный фильтр для фильтрации раствор золь, удаление мелких частиц. Это приводит к золь с 5,0% (вес / вес) кремнезем называют АРД далее в тексте. Хранить золу на льду, когда он не используется.
   8. ½ ДГУ: добавить 1 мл готового DGS золь к 1 мл DDH ₂ O, перемешать с помощью вихря. Хранить золу на льду, когда он не используется.

3. Предварительно скрининг для выявления материалов для печати

Обобщенная схема, показывающая различные этапы управляемые факторный анализ используется для идентификации печати материалов показана на рисунке 1. Минимальный общий объем материала 100 мкл рекомендуется. Использование меньших объемах делает визуализации материал гелеобразования трудно.

1. Этап 1: буфер и силана
   1. Добавить 50 мкл буфера (25 и 50 мМ Трис или HEPES при рН 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2) до 2 мл сцинтилляционный флакон стекло.
   2. Добавить 50 мкл соответствующего соль (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) и вихревые смеси в на-и-офф моды в течение 10 сек наперемещение флакона и выключать вихревой смеситель.
   3. Комплект материалов выдерживали при комнатной температуре, мониторинг времени материала желатинизации. Время гелеобразования определяется как точка, в которой материал перестает проходить свободно вращающимся на флакон углом 45 °.
   4. Исключить комбинаций материалов с гелеобразования раза меньше, чем 2,5 часа от последующих этапах отбора материала.
2. Этап 2: буфер, силана и полимеров
   1. В 2-мл пробирку дл сцинтилл ции стекла, добавляют 3,13 мкл либо 16% (вес / объем) или 8% (вес / объем) PVA / PEI раствора или 6,3 мкл 30% (вес / объем) или 60% (вес / V) раствора ПЭГ.
   2. Добавить 50 мМ HEPES (рН 8,0) довести совокупный объем до 50 мкл, перемешать раствор от вихря.
   3. Добавить 50 мкл соответствующего соль (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS), соединение в моде описано в шаге 3.1.2.
   4. Исключить комбинаций материалов с гелеобразования раз (как определено в пункте 3.1.3) менее чем 2,5 ч из последующих стадий скрининга материала.
3. Этап 3: буфер, силан, полимера и органосилан
   1. В 2-мл пробирку дл сцинтилл ции стекла, добавляют 3,13 мкл либо 16% (вес / объем) или 8% (масса / объем) раствора поливинилового спирта и 6,3 мкл 30% (вес / объем) или 60% (вес / объем) раствора ПЭГ.
   2. Добавить 3,13 мкл 16% (вес / объем) кремнийорганическое (GLS, МТМС, MDSPPO, бис-TEOS, Si-СООН или APTES).
   3. Добавить 50 мМ HEPES (рН 8,0) довести совокупный объем до 50 мкл, перемешать раствор от вихря.
   4. Добавить 50 мкл соответствующего соль (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) и смешайте в моде описано в шаге 3.1.2. Исключить комбинаций материалов с гелеобразования раз (как определено в пункте 3.1.3) менее чем 2,5 ч из последующих стадий скрининга материала.
4. Стадия 4: буфер, силан, полимер, кремнийорганические и малые молекулы добавка
   1. В 2-мл пробирку дл сцинтилл ции стекла, добавляют 2,08 мкл либо 24% (вес / объем) или 12% (масса / объем) раствора поливинилового спирта и 6,3 мкл 30% (вес / объем) или 60% (вес / объем) раствора ПЭГ.
   2. Добавлять2,08 мкл 24% (вес / объем) кремнийорганическое (GLS, Si-СООН).
   3. Добавить 2,08 мкл 3 мМ малые молекулы раствор (N _ε - ацетил-L-лизина, D-сорбит, α, α-трегалозы), либо 1,5 мМ (Тритон Х-100).
   4. Добавить 50 мМ HEPES (рН 8,0) довести совокупный объем до 50 мкл, перемешать раствор от вихря.
   5. Добавить 50 мкл соответствующего соль (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) и смешайте в моде описано в шаге 3.1.2.
   6. Исключить комбинаций материалов с гелеобразования раз (как определено в пункте 3.1.3) менее чем 2,5 ч из последующих этапов для печатающего материала.

4. Подготовка для печати Белково-легированных материалов

Материалы, идентифицируемые в конце этапа 3.4.6 переносятся в печатных исследованиях с соответствующим ферментом в настоящее время включены в золь. Во всех случаях, описанных ниже, водный раствор, содержащий все компоненты, за исключением силанаполучают в микролуночные, с последующим добавлением золя непосредственно перед печатью. Чтобы обеспечить использование 384-планшет для микротитрования, общий объем раствора 50 мкл используется вместо 100 мкл.

1. Ацетилхолинэстеразы (АХЭ) микрочипов
   1. Подготовка 2 кЕд / мл раствора AChE в 50 мМ HEPES (рН 8,0), после много удельной активности фермента (единицы активности на мг) информацию, предоставляемую изготовителем.
   2. Алиготе 2 кЕд / мл маточного раствора фермента в 5 мкл фракции с использованием 500 мкл микроцентрифужные пробирки и хранят при температуре -20 ° С. 2 кЕд / мл решения АХЭ акции остаются стабильными на срок до 4 месяцев при хранении при температуре -20 ° C.
   3. Подготовка исходных материалов путем объединения половины объема соответствующих полимеров, органосиланов и низкомолекулярных добавок определены в ходе этапа 3.4.6 в 384-луночный планшет для микротитрования.
   4. Добавляют 5 мкл 2 кЕд / мл AChE в 50 мМ HEPES (рН 8,0).
   5. С помощью 50 мМ HEPES (рН 8,0), довести объединенныйа объем до 25 мкл перемешать с помощью пипетки раствор вверх и вниз несколько раз.
2. Мультикиназный микрочипов
   1. Подготовьте 100 нг / мкл киназы растворы (р38, MAPK2, EGFR, GSK-3β) в DDH ₂ O после активности (ед / мл или Ед / мг) и количество информации, предоставленной изготовителем. Хранить киназы решений в аликвотах 2 мкл при -80 ° С.
   2. Подготовка киназы субстратов (MBP, р (Е ₄ Y), GSM) при 5 мг / мл, 50 мг / мл или 300 мкМ в DDH ₂ O, в соответствии с количеством информации, предоставленной изготовителем. Магазин субстратов в аликвоты 2,5 мкл при -80 ° С.
   3. Подготовка исходных материалов путем объединения половины объема соответствующих полимеров, органосиланов и низкомолекулярных добавок определены в ходе этапа 3.4.6 в 384-луночный планшет для микротитрования.
   4. К каждой лунке, содержащей базовые материалы, добавляют 2,5 мкл киназы и 2 мкл соответствующей подложке (р38 и MBP, MAPK2 и МВР, EGFR и р (Е ₄ Y), GSK-3β и GSM), полученный в шаге 4.2.1 и 4.2.2, соответственно.
   5. С помощью 50 мМ HEPES (рН 7,4), довести объединенный а объем до 25 мкл. Перемешать с помощью пипетки.

5. Формирование микрочипов

В этом разделе приводится подробное описание процедуры для печати материалов на одной поверхности слайда. Печать на нескольких модифицированных поверхностей слайд (амина, эпоксидная смола, альдегида и PMMA), эта процедура повторяется 4 раза.

1. Форма микрочипов с помощью контактный контакт печати роботом, оснащенным XYZ этапе. Использование щелевой оболочки контактов 100 мкМ диаметр для осаждения белка, легированного золей.
2. Установка влажности внутри камеры печати на 80-90%. Влажность <80% может привести к испарению образца и несоответствий в печать, из-за небольшого объема осаждения.
3. Разрушать ультразвуком булавки в DDH ₂ O в течение 15 мин до начала печати и сухими в токе азота. Используйте трубы Cleaneт, чтобы удалить остаточную влагу внутри держател штырей и тщательно поместить палец в печатающей головке. Отказ от удаления остаточной влаги может помешать контактный свободно перемещаться с держателем, в результате чего пропустил пятна.
4. Массива элементов управления модели через Chip Writer Pro (НВП) программы. Для каждого образца в пределах 384-луночные пластины источника, 200 пятен (максимальное количество пятен на поглощение использованием SMP3 контактный оболочка) печатаются на модифицированной поверхностью предметного стекла.
5. Начать процесс печати с помощью программного обеспечения. Дорожный набор в направлении XY до 10 мм / с, а скорость захода образца (Z направление) до 2 мм / с, 2,5 с время загрузки образца.
6. Пауза пробегают НВП. Опустите палец в образце и добавить 25 мкл соответствующего соль (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) в скважину с помощью пипетки. Смешайте раствор с использованием вверх и вниз пипетки движения повторяются 50x. При смешивании с помощью пипетки, свести к минимуму количество воздуха, включены в раствор. Пузырьки воздуха профилактикит завершения загрузки образца в штифта.
7. Начать процесс печати через НВП и печати образца на одном слайде поверхности. Приостановить процесс печати перед загрузкой образца из последующих пластины источника хорошо.
8. Снимите печати ПИН с помощью магнита и поместить уборщика трубы в печатающей головке, чтобы влага накопления в печатающую головку.
9. Промойте печати ПИН с Ddh ₂ O, и разрушать ультразвуком в чистом Ddh ₂ O в течение 30 сек.
10. Сушат печати штифт в токе азота и удаление уборщика трубы, размещение штифт обратно в печатающую головку.
11. Начать печать, следуя пунктам 5.6 - 5.10, для всех образцов оставаясь в источник пластины. До 12000 пятна 100 мкм в диаметре могут быть нанесены на один слайд.
12. Этот метод может быть применен и к печатной продукции на дно скважины в пределах 96-луночный микропланшет. После калибровки файла НВП, калибровку печати ПИН для обеспечения расстоянияхCE путешествовал между местом отложения выше высоты микролуночный планшет. Это позволяет печатать контактный последовательно от скважины к скважине в линейном порядке, не повреждая PIN-код.
13. Возраст массива в течение как минимум 30 минут и до 24 часов в печати камере при 80-90% влажности по завершении всего эксперимента печати.

6. Анализ активности ацетилхолинэстеразы

1. Приготовление положительного контроля (ПК) образцы
   1. Подготовка 1 мМ ацетилтиохолиниодида (ATCH: M _т 289,18 г / моль) в 4% глицерина, 25 мМ Трис (рН 7,0) в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. ATCH должно быть подготовлено новое перед каждым использованием и использованием буфера при рН 7,0 в качестве буфера рН выше вызывают быстрое автогидролиза, производя ложные срабатывания. Конечный объем может варьироваться в зависимости от количества образца (25 мкл на образец).
   2. Добавить 0,14 мкл 5 мМ BODIPY-Fl-L-цистин к 25 мкл 1 мМ ATCH в лунку 384-микротитровальных плаТе.
   3. Добавить 24,86 мкл 4% глицерина, 25 мМ Трис (рН 7,0), перемешать с помощью пипетки осторожно, чтобы избежать образования пузырьков в растворе. Потенциальные ингибиторы фермента, могут быть включены в компьютер раствор перед в результате чего объем до 50 мкл буфера.
2. Подготовка отрицательного контроля (NC) образцы
   1. Добавить 0,14 мкл 5 мМ BODIPY-Fl-L-цистин к 49,86 мкл 4% глицерина, 25 мМ Трис (рН 6,5) в лунку 384-планшет для микротитрования. Перемешать с помощью пипетки.
3. Наложение PC и NC решений
   1. Наложение возрасте микрочипов следующие шаги 5,1 - 5,10 (без учета шагом 5,6) протокола. Использование щелевых контактов оболочки 235 мкм в диаметре для нанесения ПК и решения NC надпечатке. Это обеспечивает решение охватывает ранее осажденных место полностью.
   2. Возраст массивов при 80-90%-ной влажности в течение 1 часа при комнатной температуре. В связи с автогидролиза из ATCH, более длительное время инкубации может привести к ложным срабатываниям или увеличен ENZYME деятельности.

7. Анализ активности киназы

1. Подготовьте 500 мкМ аденозин-5'-трифосфата (АТФ) решение с использованием со АТФ (100 мм) хранят при температуре -20 ° С. Сделать свежий раствор для каждого эксперимента и регулировки громкости экспериментальным необходимости: каждое решение требует печати 5 мкл.
2. Подготовьте 100 мМ хлорида магния (MgCl _2: M _т 95,21 г / моль) исходного раствора в DDH ₂ O.
3. Положительный контроль (PC)
   1. Добавить 2,5 мкл 100 мМ MgCl ₂ и 5 мкл 500 мкМ АТФ на лунку 384-планшет для микротитрования.
   2. Довести общий объем лунки до 50 мкл 50 мМ HEPES (рН 7,4), перемешать с помощью пипетки. Потенциальные ингибиторы фермента, могут быть включены в компьютер раствор перед в результате чего объем до 50 мкл буфера.
4. Отрицательный контроль (NC)
   1. Добавить 2,5 мкл 100 мМ MgCl ₂ и 5 мкл DDH ₂ O в лунку 384-мicrotiter пластины.
   2. Довести общий объем лунки до 50 мкл 50 мМ HEPES (рН 7,4) и перемешать с помощью пипетки.
5. Наложение ПК и кофакторов NC анализа
   1. Выполните шаг 6.3.1 протокола.
   2. Возраст массивов при 80-90%-ной влажности в течение 2 ч при комнатной температуре.
6. Презентация окрашивания
   1. Размещения печатной микрочипов слайды индивидуально в чашке Петри с достаточным красителя (из комплекта), чтобы покрыть весь слайд. Встряхнуть умеренно (~ 200 оборотов в минуту) в течение 45 мин с использованием планшет-шейкере.
   2. Удалить слайд с помощью щипцов и поместить в чистую чашку Петри с промывочного буфера (из комплекта). Встряхнуть умеренно (~ 200 оборотов в минуту) в течение 45 мин с использованием планшет-шейкере.
   3. Удалить слайд с помощью щипцов и спина сухая помощью обычного микроцентрифужные микрочипов настольный ПК с картой держателя слайдов.

8. Микрочипов изображений и анализа

1. Изображениями

   Обратите внимание, что метод визуализации будет сpecific для типа массива читателю доступны. Для этих исследований Альфа Innotech NovaRay тепловизор с источником белого света и ПЗС-система обнаружения оснащен 478 ± 17 нм возбуждения и 538 ± 21 нм выбросов фильтр для АХЭ микрочипов, и 530 ± 40 нм возбуждения и 614 ± 62 нм излучения фильтр для киназы микрочипов был использован. Конфокальной лазерной сканирующей системы также могут быть использованы для чтения массивов, хотя настройки будут специфичны к инструменту.

   1. Поместите слайд в держатель слайдов с места вверх.
   2. Установка количества предварительный просмотр секций (минимум 2 рекомендуется, по одному на каждом конце микроскопа), разрешение (не менее 4 мкм рекомендуется) и экспозиции (автоматический рекомендуется) в течение обработки изображений.
   3. Приобретать слайд изображение и сохранить как ". TIFF" файл.
2. Анализ
   1. Открыть полученные изображения в слайд ImageJ64.
   2. Нажмите овальные инструмент отбора и измеренияинтенсивность сигнала каждого месте с помощью опции мера под вкладку Анализ. При выборе области для измерения, выберите регион, немного больше, чем наблюдаемое месте и последовательного размер между пятнами уменьшить ImageJ субъективности.
   3. Средняя интенсивность из 25 подобных мест PC, деленная на среднюю интенсивность 25 подобных мест NC получить PC / NC соотношения для отдельных композиций материала.

Results

Путем выполнения управляемый анализ фактора материала экрана, мы смогли минимизировать число испытанных материалов от ~ 20000 до нескольких сотен, что было гелеобразования раз подходит для печати. Применяя строгие руководства требующими времени материал гелеобразованием 2,5 часа или больше, материалы, способные засорить печати булавками или производят невоспроизводимой массивы никогда не были напечатаны. Материалы для печати определены иметь достаточные (> 2,5 ч) гелеобразованием раз были напечатаны на 4 различных функционализированным поверхности предметного стекла. Для того, чтобы считать "печати", то максимальное количество пятен на поглощение объем штифт был для печати (SMP3 = 200). Места были также оценены для точечной морфологии чтобы убедиться в отсутствии трещин или нежелательных фазового разделения не произошло используя простой микроскопии по методу светлого, как показано на рисунке 2.

Начиная с этой стадии выявленных материалов для печати, микрочипы были произведены с АХЭ икиназ включены в буферном водном компоненте. Материалы, которые были совместимы с процедура анализа (в том числе потенциал наложения и промывки или окрашивания шагов) были определены путем наблюдения удержание пятна микрочипов (без трещин, потерю пятна или необычные флуоресценции образцов) и положительного контроля (ПК) для отрицательного контроля (NC ) соотношение больше 1, наблюдаемые через изображения. Поскольку это было примерно на 50% материалов, большее ПК / NC соотношении 3 была использована для определения оптимальных материалов с сохранением активности белка. С помощью этого метода, 26 полученных золь-гель материалов, содержащих АХЭ и 2 материалов, содержащих киназы удовлетворены> 3 ПК / NC критериев. Рисунках 3 и 4 отображают графический разбивка 5 управляемый материал экрана шаги для идентификации оптимальных АХЭ и киназы микрочипы, соответственно.

Анализы также могут быть подтверждены путем генерации нот Z ^'17. Рисунке 5 показана участок Z 'путем сравнения сигнала, генерируемого 200 мест, 100 шт и 100 НК после надпечатке индикаторный краситель и подложки на АХЭ массива. AChE и киназы массивов привело к соответствующей оценки Z 'от 0,60 до 0,67, что указывает на отличную анализа. Тем не менее, следует отметить, что перед анализом проверки на массив фермент, краситель, субстрата и кофакторов концентрации должны быть оптимизированы путем надпечатки диапазон концентраций каждого компонента и подбора концентрации, которая привела к высоким сигнала, как описано подробно в другом месте ^5.

Для проверки анализов, количественные данные ингибирование были получены с использованием известных и новых ингибиторов ацетилхолинэстеразы, с результатами, выполнены в двух экземплярах и использовать для получения дубликата участки (фиг.6А) и Кривые ингибирования (фиг. 6В и 6С). <сильная ролики> были впервые напечатаны смесями известны биологически активные низкомолекулярные ингибиторы затем с красителем и подложкой, а также контроля смеси, содержащие либо известными ингибиторами или без ингибитора были включены. Повторяющиеся участки были созданы для оценки активности ферментов, и любые смеси, в результате менее 25% активности фермента считались положительными для торможения. Индивидуальные соединения из таких смесей, затем тестировали в двух повторах для идентификации конкретного небольшую молекулу (ы), ответственных за ингибирование. После идентификации эти небольшие молекулы были использованы для получения количественных кривые ингибирования для определения значений _IC50 и константы ингибирования.

Похожие качественные результаты были получены с использованием мультикиназный массив с общим ингибитором киназы, стауроспорину. 7A и 7B Рис показать микрочипов изображение и показывают, что интенсивность сигналов после надпечатке и окрашивание мультикиназныймассива как ожидалось для отрицательного контроля (- ATP), положительный контроль (+ АТФ) и известным ингибитором (+ АТФ + чел). Чтобы продемонстрировать возможность получения количественных данных ингибирования от микрочипов, зависит от концентрации анализе ингибирования было сделано для одной киназы. Как показано на фигурах 8А и 8В, интенсивность сигнала уменьшается с увеличением концентрации ингибитора, и ответ следующим ожидаемым зависимое от концентрации ингибирование кривая для p38α/MBP киназы / субстрат системы.

Рисунок 1. Общая схема для ориентированного подхода скрининга материалов. Каждый блок представляет собой шаг на экране в последовательном порядке. Числа в левой представляют общее количество материалов, подготовленных для анализа. Использование время гелеобразования более 2,5 ч (материалов с гелеобразования раз меньше, чем 2,5 ч арэлектронной указано аута), количество материалов, которые проходили каждый этап и переносится во время материала экрана обозначаются числа справа. * Представляет материалов с менее чем оптимальное разделение фаз.

Рисунок 2. Оптические изображения, показывающие различные режимы разрушения материалов в печатных шаг части экрана. Образ "хорошего" материала (второй ряд, третья колонка) также показана для сравнения. Печатается с разрешения из работы ^8, 2013 Copyright Американского химического общества.

Рисунок 3. Подход направлен материал скрининга для идентификации оптимальных материалов для изготовления золь-гель-полученный АХЭ микрочипов. Печатается с химической завивкойission от опорного ^5, 2013 Copyright Американского химического общества.

Рисунок 4. Направлены материалы скрининга подход для идентификации оптимальных материалов для изготовления золь-гель-производных микрочипов киназы. Печатается с разрешения из работы ^8, 2013 Copyright Американского химического общества.

Рисунок 5. (А) раздел АХЭ микрочипов показывает HC (ярко-зеленый) и LC (светло-зеленый) пятна (черно-зеленый палитры была применена как для псевдоцвете ясность изложения); (B) в увеличенном виде коробочной области, чтобы выделить место морфологии и выравнивание;. и (С) участок Z 'Сплошные линии указывают среднее значение повторяет, тогда как пунктирные линии соответствуют 3SD. Печатается с разрешения из ссылки ^5, 2013 Copyright Американского химического общества.

Рисунок 6. (A) Дубликат участок для на массив скрининг синтетических аналогов Amaryllidaceae алкалоиды; (B) IC ₅₀ участков идентифицированных потенциальных ингибиторов отмечены как соединения 1 и (C), соединение 2 с ошибками представляющий одно стандартное отклонение от среднего от 25 репликации. представитель пятна показаны для иллюстрации различий в сигнал, пропорциональный концентрации ингибитора. Печатается с разрешения из ссылки ^5, 2013 Copyright Американского химического общества. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

НТ "FO: держать-together.within-страницы =" всегда ">
Рисунок 7. На массива анализа четырех киназ использованием 1.4SS/1.0PVA для захвата и печатают на аминным производным слайдов. (A) изображение участка микрочипов, в котором пятна с киназами совместно захваченного с их соответствующими подложки напечатаны с буфером (NC, верхний ряд), или растворы, содержащие АТФ (ПК, средний ряд) или АТФ + стауроспорину (нижний ряд). (B) Гистограммы сравнения интенсивности сигналов между ингибирует реакцию и раскованно, после вычитания фона сигналов и погрешности представляют одно стандартное отклонение от среднего от 25 повторяет. Печатается с разрешения из работы ^8, 2013 Copyright Американского химического общества.

Рисунок 8. Inhibiti. на анализ на p38a/MBP микрочипов (A) Разделы микрочипов показывает представитель пятна overspotted с различными концентрациями стауроспорину, как указано (изображения получены с помощью одного сканирования одного и того же слайдов; составное изображение показан для ясности). (B) IC ₅₀ кривой, полученной из анализируемых изображений массиве. Интенсивности, полученных при 100 мМ вычитали из всех изображений, а все остальные интенсивности нормализовали путем установки интенсивности, полученных при 10 нМ до значения 100% активности. Печатается с разрешения из работы ^8, 2013 Copyright Американского химического общества.

Рисунок 9. Изображения микроскопических контактный стелс используется для контактного штыря печати показывая различные недостатки: (A) забита, (B) согнуты.

Discussion

Методологии, описанной здесь был выбран как наиболее подходящий для идентификации печати полученных золь-гель материалов с контактом принтер, производя времени и экономически эффективного способа быстрого определения оптимальных материалов без необходимости скрининга большого количества материалов. Из общего числа ~ 20000 потенциальных материалов, можно было определить ~ 200 материалов, которые были пригодны для печати на основе гелеобразования время в одиночестве. Это значительно снизило количество материалов, необходимых для быть подготовлены для последующего испытания печати. Эти печатные материалы затем были напечатаны на 4 слайд поверхностей в общей сложности 768 материала ползуна. В среднем, 50 мест / повторов одного материала могут быть напечатаны в ~ 3 мин, в том числе загрузки образца месте осаждения и пин-код очистки. Из них 155 материалов, или примерно 20%, разрешено для печати максимальное количество пятен на решение поглощение и производится воспроизводимых размеров месте. Следует отметить, что из 4 слIDE поверхностей испытания, материалы печатных лучше в следующем порядке: амин> эпоксидной> альдегид> ПММА, PMMA слайды не производят полезные массивы для любых материалов. Это было вероятно, связано с полярностью покрытия. Сравнение вышеупомянутых поверхностей слайдов, более полярным амин и эпоксидной были лучше подходит для водных золей по сравнению с ПММА слайдов. Кроме того, испытанных поверхности, амин покрытием слайды обеспечить потенциал положительно заряженную поверхность для хранения анионный золь на связь. Мы подозреваем, наночастицы диоксида кремния на границе раздела между ползуном и золь взаимодействуют вдоль поверхности. Оба эпоксидных и поверхности альдегид слайд имеют те же начального заряда на основе взаимодействия. Для обеспечения оптимальной осаждения месте настоятельно рекомендуется использовать предварительно покрытых слайдов из поставщиков, таких как Arrayit. В доме-покрытие производит несовместимым поверхностей, которые приводят к плохой воспроизводимости месте ^13, а в некоторых случаях может привести к количественной вероятностиблем. ¹⁸ Не менее важно, температуру и влажность влияют на "печатных" материалов. Пока никаких детальных исследований на эффекты, связанные с температурой не проводились, печать всегда проводить при комнатной температуре (23 ± 3 ° C). Влажность (более 80%) также регулировать в печатающую камеры для предотвращения осаждения нерегулярной формы из-за небольших объемов осаждения (0,7-2,3 нл) и испарения.

Хотя материал сито направляется к определению оптимального полученных золь-гель материалов, специально для печати АХЭ и киназы, небольшой набор материалов были идентифицированы, который работал на обоих типах белков. Действительно, и из материалов, которые были определены для изготовления биочипов киназы были основаны на SS + глицерин + ПВА, и оба материала также были определены в течение 26 материалов, выбранных для AChE микрочипов. Эти "оптимальный" материалы могут предложить общую отправную точку для дальнейшего развития PROTEв легированном золь-гель на основе микрочипов и небольших экранов вокруг этих композиций может идентифицировать еще лучше материалы для изготовления биочипов. Второй момент, который следует отметить, важность использованного фермента. В случае AChE (а надежные фермента), 26 (или около 40%) исходных материалов 66 определены как анализ совместимые сохранена активность захваченного AChE. Однако для более тонких киназы, только 2 из 69 анализа совместимой композиции, или примерно 3% от материалов, смогли сохранить активность всех киназ. В то время как достаточное количество различных ферментов не были изучены, чтобы сделать окончательный заявления, очевидно, что оптимизация изготовление массив с относительно нестабильными ферментов может привести к идентификации материалов, которые могут захватывать широкий спектр белков, чтобы позволить mutliplexed микрочипов изготовления.

Независимо от выбранного белка, основные отсечки фактор для идентификации печати материалов была необходимость в течение длительногоМатериал гелеобразования раза (> 2,5 ч). При разработке СС на основе золь-гель материалов, очень важно обеспечить, чтобы после ионного обмена и фильтрации золь при рН около 4. Золи с более низким начальным рН может привести к материалов с более низким, чем нейтральном рН, которые могут повлиять на активность фермента. ¹⁹ регулирования количества Dowex (ионообменная смола), чтобы SS может изменить конечный рН золя. Когда новый пакет смолу получают отношение смолы к SS должна быть отрегулирована таким образом, чтобы получить золи при рН около 4 процедуре, описанной в разделе 2 протокола.

Кроме того, получение кристаллической DGS часто является источником ошибки, связанной с материальными сбоя при использовании DGS золи на основе биомолекул для захвата. Хотя это и не представленные здесь подробно, большое внимание должно быть принято во время синтеза кристаллического АРД, в частности необходимость избежать присутствия воды в процессе синтеза, которые могут производить polyglycerated кремнеземTES, а не мономерные DGS. Кроме того, из-за гигроскопичности ДГУ, кристаллический образец необходимо хранить высушенный и использовать в течение 6 месяцев после синтеза. Кристаллический АРД старше 6 месяцев не могут растворяться полностью (вследствие частично конденсированного полиглицерина силикатного материала), даже при обработке ультразвуком в кислой среде. Неполном растворении DGS производит золу с неизвестным и неконтролируемым содержанием кремнезема и, таким образом, менее надежные материалы.

Важно отметить с контактной печати является качество контактов. Поврежденные или неправильно штифтов (рис. 9) никогда не будет производить воспроизводимых массивов зависит от материала печати. Рекомендуется проверить контактный качества с использованием рассечение микроскопом, чтобы обеспечить сломанной или забиты контакты не используются. Тщательная обработка обеспечивает длительный срок службы для контактов. Свободное передвижение контактный также важна. В случаях, когда влага удерживается в печатающую головку между головой и контактный, контактныйнельзя будет правильно и, следовательно, не будет делать надлежащий контакт с поверхностью, в результате чего отсутствие осаждения материала.

В заключение, мы предоставили подробную, многоступенчатый подход для разработки скрининга высокой плотности белка легированных пин-печатный микрочипов. Скрининг включает в себя оптимизацию свойств материала (время гелеобразования и печатные), чтобы печать материалов, с последующим более сосредоточены скрининга для идентификации материалов, которые совместимы с данным анализа и возможность сохранить ферментативную активность. Этот управляемый подход скрининга материал может быть нанесен на дополнительные форматы микрочипов сократить время и затраты, связанные с производством эффективный высокой плотности микрочипов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			<сильно>Реагент/Материал
Поли(виниловый спирт) (ПВА)	Sigma-Alderich	360627	80% гидролозированный, Mw 600
Полиэтиленгликоль 600 (PEG)	Sigma-Alderich	87333
Полиэтиленимин (ПЭИ)	Сигма-Альдерих	482595	50 мас.% раствор в воде
Карбоксиэтилсиланетриол (Si-COOH)	Gelest, Inc.	SIC2263,0	25% в воде
N-(3-триэтоксисилилпропил) глюконамид (GLS)	Gelest, Inc.	SIT8189,0	50% в этаноле
бис[(3-метилдиметоксисилил)пропил]полипропиленоксид (MDSPPO)	Gelest, Inc.	SIB1660.0
Метилтриметоксисилан (MTMS)	Gelest, Inc.	SIM6560.1
Бис(триэтоксиил)этан (Бис-ТЕОС)	Гелест, Инк.	SIB1817.0
3-Аминопропилтриэтоксисилан (APTES)	Gelest, Inc.	SIA0610.0
Глицерин	Sigma-Alderich	49767
D-сорбит	Sigma-Alderich	240850
D-(+)-Дигидрат трегалозы	Sigma-Alderich	T9531
Triton X-100	Sigma-Alderich	X-100
N