Методическая статья

Количественный Анализ сотового мигрантах мышиных кишечных нейронных прародителей

DOI:

10.3791/50709

⸱

18 сентября 2013 г.

 ,  , 
1Molecular Genetics of Development Laboratory, Biological Sciences, UQAM

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем Экс Vivo клеточную миграцию анализа, который позволяет точное количественное определение кишечной нервной миграции гребень клеток потенциала в присутствии различных факторов роста.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки нервного гребня (NCC) являются временными и мультипотентны клеточная популяция, которая происходит от дорсальной части нервной трубки и мигрирует широко во всех развивающихся эмбрионов позвоночных. В дополнение к предоставлению периферийные глии и нейронов, NCC генерировать меланоциты, а также большую часть черепно-лицевого скелета. NCC миграция и дифференциация контролируется сочетанием их осевой происхождения вдоль нервной трубки и степень их подверженности региональном различных внеклеточных сигналов. Такой вклад внеклеточных лигандов особенно очевидно во время формирования кишечной нервной системы (ENS), сложной взаимосвязанной сети нейронной ганглиев, что локально управляет (среди прочего) движения кишечника мышц и моторики кишечника. Большая часть ENS происходит от малого начального пула NCC, что предпринять долгое путешествие, чтобы колонизировать - в ростральнее хвостового моды - по всей длине предполагаемого кишечнике. Среди нескольких сигнальных путей, известныхвлиять кишечно NCC колонизации, GDNF / сигнализации РЭТ признан самым важным. Действительно, пространственно-временной контролируется секреция РЭТ лиганда GDNF в кишечнике мезенхимы является главным ответственным за привлечение и руководством RET-выражения кишечной NCC к и в эмбриональной кишки. Здесь мы описываем экс виво анализа миграции клеток, что делает использование трансгенной линии мышей, обладающего флуоресцентно меченого NCC, которая позволяет точную количественную оценку кишечной NCC миграционного потенциала в присутствии различных факторов роста, в том числе GDNF.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки нервного гребня (NCC) являются переходным типом клеток уникальным для позвоночных, которая формирует множество производных во время развития эмбриона. Это популяция клеток возникает на границе нервной пластинки, рядом с не-нейронных эктодермы 1. Во время нейруляции, изгиб нервной пластинки мест NCC вдоль верхнего края формирующегося нервной трубки. Затем НКК пройти переход эпителиально-мезенхимальных, разделения и миграции от нервной трубки. NCC колонизируют различные эмбриональные структуры, в том числе желудочно-кишечного тракта, где они образуют весь кишечно нервную систему (ENS), взаимосвязанной сети нейронной ганглиев, встроенного в стенку кише....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление Этика

Опыты с мышами проводились следующие Канадского совета руководящих принципов по уходу за животными для ухода и манипуляции животных, используемых в медицинских исследованиях. Протоколы с участием манипуляции животных были утверждены комитетом институциональные этики Университета Квебека в Монреале (Комитет Institutionnel де Защита де Animaux; справочный номер 0512-R3-650-0513).

1. Подготовка коллагена Гели

Работа в стерильных моды, под капот культуры ткани.

  1. Подготовить всю 5x DMEM (модифицированной, по существу среда Игла), включая стандартные антибиотики. Р....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие результаты являются репрезентативными что могут быть получены с методикой, описанной здесь (рис. 1). Использование факторов роста (т.е. GDNF) стимулирует миграцию GFP-экспрессирующих кишечно NCC из кишечника эксплантата и в гель коллагена (рис. 2). Хотя некоторые клетки выходят из эксплантата в отсутствие факторов роста, в основном это не GFP-меченых и представляют пассивную запись. Надо удалить кишечную кусочек от коллагеновый гель для записи результатов, как эта тка.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы покажем, как наш бывший естественных техника культура эксплант можно использовать для точного количественного кишечно NCC миграционный потенциал в присутствии GDNF. Такое точное количественное значительно облегчается с помощью 200 мкм-толстые секции Vibratome кишки вместо большие куски размером приблизительно, как было описано ранее 11,12,15. В самом деле, это позволяет нам работать с разумным количеством клеток в высокой воспроизводимостью обстановке. Следует отметить, что равномерное распределен.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Дениса Флипо для обработки и анализа изображений советом, и Дэвид У. Silversides в лаборатории которого был создан Gata4p [5kb]-GFP мыши линии. Исследования в лаборатории Пилон финансируется CIHR, NSERC, FRQS и FRQNT.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM порошокWisent219-010-XK 
NaHCO3BioshopSOB999Биотехнологическая
система вакуумной фильтрации Steriflip (0,22 микрона)EMD MilliporeSCGP00525 
Раствор пеницилина-стрептомицина, 100xWisent450-201-EL 
Фетальная бычья сывороткаWisent095-150Высококачественный
коллаген IBD бионауки354236 
NaOHBioshopSHY700Разведенный из 10 Н стока, затем стерильно отфильтрованный
GDNFCedarlaneCLCYT305 
Falcon 24-луночный планшетBD biosciences353047 
Ножницы для препарированияFisher Scientific089515 
Стеклянная чашка ПетриVWR89000-306 
PBSSigmaP5493Культивирование клеточных культур
Препарирующий микроскопLeicaM125 
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11251-20 
AgaroseBioshopAGA001Биотехнологическое лезвие класса
Feather21 
Универсальный быстрорастворимый клей для ручкиKrazy GlueKG824 
HM 650V Вибрационное лезвие MicrotomeThermo Scientific920110 
ПараформальдегидSigma-AldrichP6148 
DAPISigma-AldrichD9564 

Таблица конкретных реагентов и оборудования.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
  2. Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
  3. Oberma....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GDNF

Похожие статьи