Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественный Анализ сотового мигрантах мышиных кишечных нейронных прародителей

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50709

⸱

18 сентября 2013 г.

 ,  , 
1Molecular Genetics of Development Laboratory, Biological Sciences, UQAM

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем Экс Vivo клеточную миграцию анализа, который позволяет точное количественное определение кишечной нервной миграции гребень клеток потенциала в присутствии различных факторов роста.

Аннотация

Клетки нервного гребня (NCC) являются временными и мультипотентны клеточная популяция, которая происходит от дорсальной части нервной трубки и мигрирует широко во всех развивающихся эмбрионов позвоночных. В дополнение к предоставлению периферийные глии и нейронов, NCC генерировать меланоциты, а также большую часть черепно-лицевого скелета. NCC миграция и дифференциация контролируется сочетанием их осевой происхождения вдоль нервной трубки и степень их подверженности региональном различных внеклеточных сигналов. Такой вклад внеклеточных лигандов особенно очевидно во время формирования кишечной нервной системы (ENS), сложной взаимосвязанной сети нейронной ганглиев, что локально управляет (среди прочего) движения кишечника мышц и моторики кишечника. Большая часть ENS происходит от малого начального пула NCC, что предпринять долгое путешествие, чтобы колонизировать - в ростральнее хвостового моды - по всей длине предполагаемого кишечнике. Среди нескольких сигнальных путей, известныхвлиять кишечно NCC колонизации, GDNF / сигнализации РЭТ признан самым важным. Действительно, пространственно-временной контролируется секреция РЭТ лиганда GDNF в кишечнике мезенхимы является главным ответственным за привлечение и руководством RET-выражения кишечной NCC к и в эмбриональной кишки. Здесь мы описываем экс виво анализа миграции клеток, что делает использование трансгенной линии мышей, обладающего флуоресцентно меченого NCC, которая позволяет точную количественную оценку кишечной NCC миграционного потенциала в присутствии различных факторов роста, в том числе GDNF.

Введение

Клетки нервного гребня (NCC) являются переходным типом клеток уникальным для позвоночных, которая формирует множество производных во время развития эмбриона. Это популяция клеток возникает на границе нервной пластинки, рядом с не-нейронных эктодермы 1. Во время нейруляции, изгиб нервной пластинки мест NCC вдоль верхнего края формирующегося нервной трубки. Затем НКК пройти переход эпителиально-мезенхимальных, разделения и миграции от нервной трубки. NCC колонизируют различные эмбриональные структуры, в том числе желудочно-кишечного тракта, где они образуют весь кишечно нервную систему (ENS), взаимосвязанной сети нейронной ганглиев, встроенного в стенку кишечника. Совсем недавно, отзывы 2,3, многие гены были вовлечены в разработку этой сложной структуры.

Большую часть ENS происходит от небольшой пул NCC происходящих из блуждающего нервной трубки (т.е. вокруг предполагаемой границы заднего мозга / спинного мозга) 4.Эти нервные клетки-предшественники достичь передней кишки вокруг эмбриональный день (е) 9,0 у мышей, а затем мигрируют каудально в кишечнике мезенхимы до примерно e15.0 не колонизировать весь эмбриональных кишечник. Несовершеннолетний подмножество толстой нейронных клеток-предшественников также обеспечивается сакральной NCC, который вторгнуться заднюю кишку в противоположном направлении до слепой кишки 4. Оба блуждающего и крестцового NCC требуют несколько миграция-, нераспространения, выживание-и дифференциация способствующих сигналы, чтобы обеспечить полное формирование ENS. В связи с этим, модели животных - особенно генетически модифицированные мыши - играют важную роль в выявлении нескольких существенных внеклеточных лигандов: GDNF (глиальных клеток нейротрофический фактор), эндотелина-3, нейротрофин-3, БМП (костные морфогенетические белки), Netrin , а также Соник и индийская Ежик (Тсс и Ihh) 5-10. Из них GDNF сигнализации через трансмембранный рецептор RET тирозинкиназы (переставить во трансфекции) признан йэ наиболее важным путем для привлечения и руководством НКК в и в эмбриональной кишки. GDNF секретируется кишечника мезенхимы и образует пространственно-временной контролируемый rosrrocaudal градиент, непосредственно chemoattractive к кишечной NCC, которые выражают РЭТ 11,12.

Среди других функций, ЭНС регулирует движение в желудочно-кишечном тракте через его взаимодействие с гладкой мускулатуры в стенке кишечника. Отсутствие нервной ганглиев в концевой области результатов кишечника при болезни Гиршпрунга: тоническое сокращение пораженного сегмента приводит к закупорке, вверх по течению накопления сброженного материала и массивной живота кишки и брюшной полости. Болезнь Гиршпрунга происходит примерно один из 5000 живорожденных. Ростро-каудальном миграция картина кишечной NCC, как полагают, является основным фактором, способствующим этиологии болезни Гиршпрунга. Толстой кишки, удалена от источника миграции NCC и последнюю часть бOwel подвергшихся колонизации, является наиболее восприимчивы к дефектам в формировании ENS. В соответствии с его решающую роль в кишечной миграции NCC, нарушение GDNF / RET сигнализации является основным известным генетическая причина болезни Гиршпрунга 13.

Чтобы лучше изучить NCC и развитие ENS, мы получили трансгенной линии мыши - по имени Gata4p [5kb]-GFP 14 - в которых миграционный NCC помечены зеленого флуоресцентного белка (GFP). Мы рядом усовершенствовал Экс Vivo миграции клеток анализа, адаптированный из опубликованных работ других групп 11,12,15, что теперь позволяет точное количественное определение кишечной NCC миграционного потенциала в присутствии различных факторов роста, таких как GDNF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление Этика

Опыты с мышами проводились следующие Канадского совета руководящих принципов по уходу за животными для ухода и манипуляции животных, используемых в медицинских исследованиях. Протоколы с участием манипуляции животных были утверждены комитетом институциональные этики Университета Квебека в Монреале (Комитет Institutionnel де Защита де Animaux; справочный номер 0512-R3-650-0513).

1. Подготовка коллагена Гели

Работа в стерильных моды, под капот культуры ткани.

  1. Подготовить всю 5x DMEM (модифицированной, по существу среда Игла), включая стандартные антибиотики. Растворите 3,37 г DMEM порошка и 0,925 г NaHCO 3 в 20 мл воды. Стерилизацию при прохождении через фильтр 0,22 мкм. Добавить 2,5 мл стерильного 100x пенициллина / стрептомицина и 25 мл стерильной инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки. Хранить при 4 ° С.
  2. На льду, смешать 800 мклраствора коллагена I (3,77 мг / мл в 0,02 N уксусной кислоты, фильтр стерилизуют), 600 мкл полной среды DMEM 5-кратным и 17 мкл 1 N NaOH. Развести стерильной водой до конечного объема 3 мл. Включить соответствующие факторы роста в миксе. Обычно мы используем GDNF при 10 нг / мл стимулировать энтеросолюбильного миграции NCC.
  3. Депозит около 480 мкл в каждую лунку одной строки в 24-луночный планшет. Избегайте пузырей. Остальные строки могут быть использованы для оценки влияния других факторов роста на клеточной миграции.
  4. Пусть коллаген полимеризации по крайней мере 1 час в стерильном инкубаторе при температуре 37 ° С.

2. Вскрытие животных 16

  1. Настройка вязки и проверьте вагинальных пробок на следующее утро. День E0.5 быть полдень в день влагалища вилка найти, изолировать самку и не ждать 12 дней, пока E12.5.
  2. Обезболить беременных мышей изофлураном и усыпить по CO 2 ингаляции.
  3. Спрей мышь с 70% этанола. Поднимите живота секкин и открыть живот полость с рассекающих ножницами.
  4. Удаление матки в стеклянную чашку Петри, наполненную ледяной PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор). Вырезать матку поперечно между отдельными вздутий deciduum изолировать каждый имплантация эмбриона сайт.
  5. Работа на каждом участке имплантации отдельно в другой стекл нную чашку Петри, наполненную ледяной PBS. При вскрытии микроскопом, использовать тонкий пинцет для удаления мышечного слоя матки.
  6. Откройте висцерального желточного мешка и амнион выявить эмбрион. Будьте осторожны при разрыве кровеносных сосудов присоединения эмбриона к плаценты / висцерального желточного мешка, так как они переплетаются с развивающимися кишечника.
  7. Sever головой эмбриона на шее.
  8. Включить закрытые щипцы в брюшной полости эмбриона, чуть выше темно-красного цвета печени и пусть щипцы открыты себя (остановка приложения давления), чтобы сделать поперечную отверстие в брюшной полости рта. Потяните открытые щипцы вниз кЗадний конец эмбриона, чтобы открыть живот полностью.
  9. Захватите соединительную ткань позади печени и тянуть кишки из живота, стараясь не сломать кишечник (двоеточие прилагается к анусу).
  10. Разрежьте двоеточие, чтобы освободить кишки от остальной части эмбриона. Разрез можно сделать в любом месте вдоль толстой кишки. Забронируйте хвостовой части на потом.
  11. Дразнить соединительную ткань от слепой кишки, затем остальные кишечнике. Будьте осторожны, чтобы не ранить кишечник, делая так.
  12. Срежьте печень и желудок (на ростральной конце тонкой кишки), а также мезонефроса и генитальные гребни, если некоторые из них присутствовать.
  13. Изолировать в тонкий кишечник. Опять же, будьте осторожны, не пресечь кишечник. Отныне rosrrocaudal ориентация ткани кишечника можно отслеживать с помощью резкого кривизну присутствующих на ростральной конце. Оставьте тонкую кишку в PBS при комнатной температуре в течение такого короткого периода, как это возможно, прежде чем EMпостельные принадлежности (см. шаг 3.3).
  14. Наконец, запишите число хвостовых сомитах для каждого эмбриона точно определить стадию эмбрионального развития.

3. Секционирование эмбриональных кишечнике

  1. Прежде чем приступить к эмбриона вскрытий, растопить 1,5 г агарозы в 100 мл PBS (фосфатно-солевой буфер) и держать при температуре 50 ° С.
  2. Налейте расплавленную агарозу в включени пресс-формы (например, закрыты 2 трубки микроцентрифужных мл, разрезанные в продольном направлении, чтобы вырезать приблизительно 1/4 от стенки трубы). Пусть агарозы остыть примерно до 42-45 ° С, она должна быть лишь слегка теплой на ощупь.
  3. Вставить эмбрионального кишечника как раз перед агарозном затвердевает (это могут быть оценены с щипцы советы и произойдет вокруг 36-38 ° С). Проведение кишечника с помощью щипцов сложенном ростральной конце концов, вытянуть его очень медленно через агарозы по длине формы. Это помогает держать прямой кишки а множества агарозы. Отпустите твыдавать, как только он начинает сопротивляться перемещается. Следите за ростральной-каудальной ориентации кишечнике.
  4. Поставьте форму в холодильник 2-3 минут, чтобы обеспечить агарозном полностью установлен.
  5. Выньте агарозы из формы (по сдвинув ее из открытой трубки Эппендорф). С лезвием, вынуть лишний агарозы на обоих концах, делая сокращения, перпендикулярные кишечника.
  6. Приклейте ростральной конец кишки / агарозы блокировать вниз на сцене металла микротоме с вибрирующей лезвия. Обрежьте излишки агарозы по бокам кишечника / агарозном блока.
  7. Установите этап металла на вибрирующую микротома камеры. При необходимости отрегулировать угол сцены так кишечник как можно более вертикальным (отсюда перпендикулярно к лезвию). Обложка образец с ледяным PBS. Принесите микротоме лезвие до нескольких миллиметров под поверхностью буфера.
  8. Сделать 200 мкм Vibratome поперечные куски хвостового-самый маленький кишечника, обеспечивая, что еACH агарозном ломтик содержит полный кишечного сечение.

4. Культура кишечных эксплантов

  1. Аккуратно депозит свежесрезанные ломтики кишки / агарозные плоский удар коллагеновых гелей с пинцетом, помещая одну часть к середине каждую лунку.
  2. Выдержите 3 дня при 37 ° С, в условиях повышенной влажности 5% СО 2 атмосферы, чтобы позволить миграцию NCC из эксплантата.
  3. Возьмите ломтики кишки / агарозные от коллагеновый гель очень осторожно пинцетом. Позаботьтесь, чтобы не повредить гель ниже.
  4. Старайтесь не прикасаться к коллагена гель непосредственно во время последующих инкубации и промывки шагов в целях обеспечения того, картина миграции клеток не нарушается. Исправить с 500 мкл 4% PFA (параформальдегид) (в PBS) на лунку 1 ч при комнатной температуре.
  5. Заменить фиксатор 500 мкл DAPI (4 ',6-диамидино-2-фенилиндол) Раствор (5 мкг / мл в PBS) на лунку и инкубировали 10 мин при комнатной температуре.
  6. Вымойте каждую лунку 3x500 мкл PBS в течение 5 мин.
  7. Сфотографируйте флуоресцентные клетки (GFP и DAPI каналов), встроенные в коллагеновый гель в каждую лунку.

5. Анализ изображений

Мы широко использовали ImageJ 17 для обработки и количественной оценки изображения, созданные после эксплантата культуры.

  1. Начните с визуализации микрометра слайд при том же увеличении, как на фотографиях люминесцентных клеток. Измерьте длину одного микрона в пикселях (с использованием линейного инструмент Линия).
  2. Установите масштаб (Анализ / Задать шкалу; вход число пикселей / микрона).
  3. Для каждого флуоресценции GFP фотографии, изменить формат изображения в 8-битный оттенках серого (Image/Type/8-bit).
  4. Отрегулируйте интенсивность сигнала (изображения / Настройка / Яркость / Контрастность).
  5. Вычтите фоновый шум при необходимости (процесс / вычитание фона; настроить радиус катящийся шар).
  6. Установить порог, чтобы выделить клеток и клеточных скоплений (Изображение / Настройка / Threshold),н применить водораздел разделить сгустки (процесс / Binary / водораздела).
  7. Анализ частиц указать интересующие участки (ROI) и генерировать статистику количества клеток (Анализ / Анализ частиц, набор минимальный размер, чтобы исключить оставшиеся пикселей).
  8. Установите параметры измерения включить диаметр Фере (Analyze / Set измерений).
  9. Группа трансформирования и измерить в целом, чтобы определить диаметр в Фере, указание распространения клеток (Анализ / Инструменты / Диспетчер ROI / Подробнее / ИЛИ, то менеджер ROI / Добавить и менеджер ROI / Measure).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следующие результаты являются репрезентативными что могут быть получены с методикой, описанной здесь (рис. 1). Использование факторов роста (т.е. GDNF) стимулирует миграцию GFP-экспрессирующих кишечно NCC из кишечника эксплантата и в гель коллагена (рис. 2). Хотя некоторые клетки выходят из эксплантата в отсутствие факторов роста, в основном это не GFP-меченых и представляют пассивную запись. Надо удалить кишечную кусочек от коллагеновый гель для записи результатов, как эта тка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы покажем, как наш бывший естественных техника культура эксплант можно использовать для точного количественного кишечно NCC миграционный потенциал в присутствии GDNF. Такое точное количественное значительно облегчается с помощью 200 мкм-толстые секции Vibratome кишки вместо большие куски размером приблизительно, как было описано ранее 11,12,15. В самом деле, это позволяет нам работать с разумным количеством клеток в высокой воспроизводимостью обстановке. Следует отметить, что равномерное распределен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Дениса Флипо для обработки и анализа изображений советом, и Дэвид У. Silversides в лаборатории которого был создан Gata4p [5kb]-GFP мыши линии. Исследования в лаборатории Пилон финансируется CIHR, NSERC, FRQS и FRQNT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM порошокWisent219-010-XK 
NaHCO3BioshopSOB999Биотехнологическая
система вакуумной фильтрации Steriflip (0,22 микрона)EMD MilliporeSCGP00525 
Раствор пеницилина-стрептомицина, 100xWisent450-201-EL 
Фетальная бычья сывороткаWisent095-150Высококачественный
коллаген IBD бионауки354236 
NaOHBioshopSHY700Разведенный из 10 Н стока, затем стерильно отфильтрованный
GDNFCedarlaneCLCYT305 
Falcon 24-луночный планшетBD biosciences353047 
Ножницы для препарированияFisher Scientific089515 
Стеклянная чашка ПетриVWR89000-306 
PBSSigmaP5493Культивирование клеточных культур
Препарирующий микроскопLeicaM125 
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11251-20 
AgaroseBioshopAGA001Биотехнологическое лезвие класса
Feather21 
Универсальный быстрорастворимый клей для ручкиKrazy GlueKG824 
HM 650V Вибрационное лезвие MicrotomeThermo Scientific920110 
ПараформальдегидSigma-AldrichP6148 
DAPISigma-AldrichD9564 

Таблица конкретных реагентов и оборудования.

Ссылки

  1. Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
  2. Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
  3. Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
  4. Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
  5. Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
  6. Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
  7. Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
  8. Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
  9. Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
  10. Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
  11. Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
  12. Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
  13. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  14. Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
  15. Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
  16. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  18. Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Флуоресцентные клетки нервного гребнявибрирующий микротоминкубация в коллагеновом гелефлуоресцентная микроскопиясигналинг GDNFдиссекция кишечника эмбрионазаливка в агарстимуляция факторами роста
Количественный Анализ сотового мигрантах мышиных кишечных нейронных прародителей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.