Method Article

Микрочипов на основе идентификации отдельных HERV Loci выражение: применение к биомаркеров при раке простаты

DOI:

10.3791/50713

⸱

November 2nd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux, 2Medical Diagnostic Discovery Department, BioMérieux, 3Department of Pathology and Cytology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 4Medical Faculty, Lyon 1 University, 5Data and Knowledge Laboratory, BioMérieux, 6Department of Biochemistry and Molecular Biology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 7Department of Urology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека эндогенные ретровирусы (HERV), которые занимают 8% человеческого генома, сохранить скудные возможности кодирования, но сто тысяч длинные повторы терминала (л). Пользовательский Affymetrix микрочипов был разработан, чтобы определить индивидуальное выражение HERV локус и был использован на ткани рака простаты, как доказательство концепции для будущих клинических исследований.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Простат-специфического антигена (ПСА) является основным диагностическим биомаркеров рака предстательной железы при клиническом применении, но ему не хватает специфичность и чувствительность, особенно в низких дозах значений 1. 'Как использовать PSA "остается актуальным вопрос, как для диагностики, как серой зоне, соответствующей концентрации в сыворотке крови 2,5-10 нг / мл, которая не позволяет четкая дифференциация быть сделаны между раком и noncancer 2 или для последующей пациента -в качестве анализа послеоперационного PSA кинетические параметры могут представлять значительные трудности для их практического применения 3,4. Кроме того, некодирующие РНК (нкРНК) становятся ключевых молекул в рака у человека, с потенциалом, чтобы служить новые маркеры заболевания, например PCA3 при раке простаты 5,6 и выявить неохарактеризованных аспекты биологии опухоли. Кроме того, данные из ENCODE проекта опубликованной в 2012 году, показали, что различные типы РНК занимают около 62% от поколенияОме. Представляется также, что количество транскрипционных регуляторных мотивов, по крайней мере 4.5x выше, чем соответствующей белок-кодирующих экзонов. Таким образом, длинные концевые повторы (л) из эндогенных ретровирусов человека (HERVs) представляют собой широкий спектр предполагаемый / кандидатов транскрипционных регуляторных последовательностей, как это их основной функцией в инфекционных ретровирусов. HERVs, которые распространяются по всему геному человека, происходят из предков и независимых заболеваний в рамках зародышевой линии, после чего процессов распространения Copy-Paste и ведущих к MultiCopy семьи, занимающие 8% человеческого генома (обратите внимание, что экзоны охватывают 2% нашего генома ). Некоторые HERV локусы еще экспрессии белков, которые были связаны с несколькими патологиями, включая рак 7-10. Мы разработали высокой плотности микрочипов, в формате Affymetrix, стремясь оптимально характеризуют индивидуальное выражение HERV локусов, для того, чтобы лучше понять, могут ли они быть активным, если они едут ncRNA транскрипцию или мodulate кодирования экспрессию генов. Этот инструмент был применен в области рака простаты (рис. 1).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека эндогенные ретровирусы (также называемые HERVs) разбросаны по всей нашей генома. Они происходят из предков и независимых заболеваний в рамках зародышевой линии, после чего процессов распространения Copy-Paste и ведущих к многокопийных семей. не сегодня, они не более заразным, но они занимают 8% человеческого генома; как точку сравнения, экзоны охватывают 2% генома человека. Данные из ENCODE проекта опубликованной в 2012 году, показали, что различные типы РНК занимают около 62% генома, в том числе одну треть в межгенных. Более того, представляется, что количество транскрипционных регуляторных мотивов, по крайней мере 4.5x выше, чем соответствующей белок-кодирующих экзонов. HERVs длинных концевых повторов (LTR) представляют широкий круг потенциальных транскрипционных регуляторных элементов, так как это их обычная функция в инфекционных ретровирусов. Исторически сложилось так, кроме нескольких локусов выраженной в плаценте или яичка, было широко распространено мнение, что HERV молчат из-за ерigenetic регулирование. Поэтому мы разработали высокой плотности микрочипов, в формате Affymetrix, стремясь оптимально характеризуют индивидуальное выражение HERV локусов, для того, чтобы лучше понять, являются ли они активными, если они едут lncRNA транскрипцию или модулировать кодирования экспрессию генов. Этот инструмент окрестили HERV-V2 GeneChip объединяет 23583 Herv probesets и может различать 5573 отдельных элементов Herv состоящие из сольных LTRs а также полные и частичные провирусов (рис. 2).

Диагностика, оценка, и план:

Диагностика рака предстательной железы основывается на дозировке простатического специфического антигена (ПСА) биомаркеров в клинической лаборатории, пальцевого ректального исследования, чтобы оценить морфологическое изменение предстательной железы и, наконец, биопсии простаты наблюдаемые патологоанатома. Отсутствие достаточной специфичностью и чувствительностью среди обычных биомаркеров рака, таких как PSA для рака простаты, была широко признана афтер несколько десятилетий клинических проявлений 1. Первоначально PSA был предложен для диагностики и лечения аденокарциномы предстательной железы 11. Было предложено последний для скрининга рака и следить за развитием заболевания 12. Однако остается вопрос, который регулярно спросил: «как использовать PSA". (Я) серая зона, соответствующая концентрации в сыворотке крови 2,5-10 нг / мл не позволяет четкое различие быть сделаны между раком и noncancer 2; (II) две большие групповых исследований поступив сотни тысяч людей в Европе и США не смогли прийти к однозначному выводу о полезности скрининга с точки зрения заболевания конкретного смертности 13,14; (III) анализ послеоперационных PSA кинетических параметров, таких как PSA оформления, скорость ПСА и времени удвоения, хотя простой в теории, может быть связано со значительными проблемами в практической 3,4 приложения. Можно ожидать, что в ближайшие годы, биомаркеров Applications будет поддерживать клинический выбор между выжидательной тактики и более или менее агрессивных методов лечения в зависимости от фенотипа опухоли. Что касается диагноза, вынесенного патологоанатом, первый ограничивающим фактором приходит от 20% ложноположительных результатов диагностики в биопсий простаты (многие виды рака пропущенного путем отбора проб). Вторая проблема касается необходимости за дополнительную процедуры биопсии следующей отрицательной, которые могут представлять неблагоприятные последствия.

Радикальная простатэктомия настоящее время является одним из стандартных методов лечения рака предстательной железы. Предлагается у здоровых пациентов, старение от 45-65 лет, особенно в случае агрессивных шаблонов (Gleason 7 до 10), мультифокальной опухоли или опухоли ощутимое. В настоящее время делается в нашем отделе с помощью робота при содействии операции. Из-за растущей доказательства того, что молекулярные маркеры будут иметь первостепенное значение в ближайшие годы, мы решили предложить всем нашим пациентам возможность участия в программе для простатыткань банковская. Точнее, расширение программ молекулярные исследования на рак предстательной железы привели к увеличению потребности в доступе к высоким качеством свежих опухолевых тканей от простатэктомий. Это исследование, в частности геномные подходы, требовались большие образцы высокого качества ДНК / РНК. Опухолевая и прилегающие ', не опухолевые' ткани из того же пациента необходимы. Рекомендации по обращению и обработке радикальные простатэктомий предназначены для сохранения патологические особенности, которые определяют стадию и состояние маржи и тем самым потенциальную дальнейшее лечение и прогноз. Любой метод отбора проб ткани свежий, следовательно, не должны ставить под угрозу последующих патологических оценки, чтобы быть приемлемым для диагностики. Макроскопическая рассечение предстательной железы трудно и большое внимание должно быть уделено гарантийные тканей и капсульного вторжения: любой рассечение для банковских простаты следует всегда проводится обучение uropathologist согласно согласенд протокол. Комитет по этике медицинского факультета и государственной медицинской комиссии согласились этих исследований и было получено информированное согласие на все пациенты, включенные в банковской тканей простаты.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Хирургия

После удаления хирургом, на простату на льду, пока не приняты, отвечающий за патологом.

2. Обработка простаты тканей

  1. Уважать задержку периоперационной ишемии, трансфер радикальной простатэктомии образцы на льду в лабораторию преданных своему делу сотрудников в течение 30 мин после хирургического удаления. Задержка замораживания должна быть не менее 20-30 мин (фиг.3А).
  2. Взвешивание и пятно простаты в соответствии с обычным протоколом (например, зеленый с правой стороны, черный на левой стороне, см. рис 3B и 3C).
  3. Выполнить большое поперечное сечение железы на задней стороне (фиг. 3D). Сориентируйте простату и положил его на передней стороне. Выполнить большое поперечное сечение железы на задней стороне с помощью стерильного хирургического ножа.
  4. Проанализируйте кусочков ткани на переходной зоне,на левого и правого периферийных зонах, в результате чего поля нетронутыми (рис. 3Е).
  5. Положите ядра ткани в пробирку Эппендорф, оснастки заморозить и хранить в жидком азоте (рис. 3F). Если вы не делаете биобанк приступить непосредственно к шагу 2.7.
  6. Осуществление банковских простаты, только если общая длина от рака биопсии превосходит 10 мм. Используйте шовный нить, чтобы закрыть простату и предотвратить железы искажения и минимальное нарушение хирургического края (рис. 3G). Затем закрепите радикальные образец простатэктомия с формалином и вставлять в парафин в соответствии с обычной процедурой для гистологического анализа.
  7. Установите ядер замороженных тканей вертикально на небольшой насыпи октября и сделать разделы в криостат. Возьмите первый сингл замороженный раздел 5 мкм и испачкать его с синим толуидина.
  8. Выполните быстрый гистологическое исследование, чтобы проанализировать характер ткани (т.е.. Доброкачественной или злокачественной). Для опухолевыхткани, оценить количество опухолевых клеток и выбрать только ядра с более чем 80% опухолевых клеток.
  9. После этого выполните новый сингл замороженный раздел 5 мкм и испачкать его гематоксилин, эозином и Safran. Затем вырезать 15 разделов х 30 мкм и поместить его в РНКазы свободной трубки Эппендорф.
  10. Возьмите последний 5 мкм замороженный раздел для гематоксилин, эозином и Safran и испачкать его контролировать количество опухолевых клеток в конце процедуры.
  11. Поместите пробирку Эппендорфа в сухом льду и послать образец к молекулярной биологии лаборатории.

3. РНК экстракции, очистки и контроля качества

  1. Гомогенизация. Выполнение гомогенизации в присутствии 1 мл Trizol/100 мг ткани пока ткань полностью не растворится в растворе. Добавить решение тризола постепенно и соблюдать осторожность на льду с использованием ручной шлифовальной машины. После того, как гомогенизированный, Алиготе решение пробирки Эппендорф и оставить в TRIzol при комнатной температуре в течениепять минут.
  2. Разделение фаз. Добавьте 300 мкл хлороформа (или 150 мкл BCP/1.5 мл Trizol). Vortex 15 сек затем оставить при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Центрифуга при 12000 мкг в течение 15 мин при 2-8 ° С.
  3. РНК осадков. Передача тщательно верхнюю водную фазу в новую пробирку. Добавить 750 мкл изопропанола. Выдержите при комнатной температуре в течение 10 мин (взбалтывают на восстановление). Инкубировать 2 ч при -19 ° C/-31 ° С. Центрифуга образцов при 12000 мкг в течение 30 мин при 2-8 ° C.
  4. РНК мытья и подвеска. После центрифугирования удалите супернатант. Вымойте РНК гранул с 1 мл 80% этанола (мягко обратной трубы). Центрифуга образцов при 7500 мкг в течение 10 мин при 2-8 ° C. Удалить супернатант использованием P1000 и P10. Разрешить оставшиеся EtOH высохнуть на воздухе в течение 2-3 мин. Добавить 100 мкл РНКазы без воды, иметь трубки до 70 ° C тепла блока и оставьте на 2-3 мин для растворения осадка. Затем положить на лед. Хранить при -19 ° C/-31 ° C на короткий срок хранения и -80 ° C для длительного хранения.
  5. Очистка РНК. Очищают РНК с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Вкратце, начнем с добавления 350 мкл буфера RLT к 100 мкл образца РНК и хорошо перемешать, после этого следуйте процедуре Qiagen. Наконец, возьмите 3 мкл (из 50 мкл) аликвоты очищенного продукта для контроля качества (шаг 3.6). Магазин РНК в -19 ° C/-31 ° C для краткосрочного периода или при температуре -80 ° С в течение длительного хранения.
  6. РНК КК (рис. 4А). Проверьте качество РНК и целостность РНК с использованием Bioanalyzer (Agilent) и NanoDrop (термо), в соответствии с инструкциями производителя. РНК целостности Количество (РИН) используется для оценки качества РНК. В частности, добиться успеха в обнаружении 18S и 28S пиков настоятельно рекомендуется использовать образцы в дальнейших шагах.

4. WT-овации РНК Усиление

Рекомендации для выполнения этапов усиления с помощью WT-OVAtion усиления комплект в оптимальных условиях:

  • Запуск не менее чем восьми образцов усиления в то время, чтобы обеспечить точность пипетки. Тогда, приходится 1 объема отходов при подготовке мастер-миксы, которые требуют расщепление комплекте в 3 партии 8 реакций.
  • Всегда держите размороженные реагенты и реакционные трубы на льду если не указано иное.
  • Используйте только свежий 80% раствор этанола для очистки.
  • Не останавливайтесь на любой стадии протокола.

  1. Развести тотальной РНК, чтобы получить концентрацию 25 нг / мкл. Процесс 2 мкл разбавленного образца.
  2. Подготовка Поли-РНК шип-контроль решение по последовательному разбавления Поли-A РНК складе с поли-контролем разбавления буфером (Affymetrix), чтобы добиться разведения 1:25000.

    Шаг 1: Сначала цепи кДНК Синтез с 4,3 - 4,8. Реагенты, упомянутые упоминаются поставщиком следующим образом: А1 (Первый Strand Грунтовка Mix), А2 (FiRST Strand буфера Mix), А3 (First Strand смеси ферментов).

  3. Разморозить А1 и А2 при комнатной температуре. Смешайте с помощью вихревого-смеситель на 2 сек и спина в течение 2 сек. Затем быстро разместить на льду. Наведите A3 на льду.
  4. Положите 2 мкл тотальной РНК (50 нг) в 0,2 мл ПЦР-пробирку и добавить 2 мкл A1 (конечный объем: 4 мкл). Крышка и спин трубку на 2 сек.
  5. Инкубировать при 65 ° С в течение 5 мин, затем поместить трубку на льду.
  6. Подготовка первой цепи кДНК Master Mix следующим образом (при условии, для одной реакции). Смешайте с помощью пипетки и спин вниз кратко Мастер Mix. Сразу поместите на льду.
    Реагент Объем
    Впервые Strand буфера Mix (А2) 5 мкл
    Поли-РНК управления (1:25000) 0,5 мкл
    Впервые Strand смеси ферментов (А3) 0,5 мкл
  7. Добавить 6 & #181; л из Master Mix к РНК / Primer содержащих трубки. Смешайте, щелкая трубки, спина на 2 сек и быстро разместить на лед (конечного объема: 10 мкл).
  8. Инкубируют при 4 ° С в течение 1 мин, затем 25 ° С в течение 10 мин, затем 42 ° С в течение 10 мин и затем 70 ° С в течение 15 мин. Хранить в прохладном месте при температуре 4 ° C. Извлечь тестовую трубку от термоциклер, кратко вращаться и держать на льду. Продолжить сразу с шагом Во-вторых цепи кДНК синтеза.

    Шаг 2: Второй цепи кДНК Синтез с 4,8 - 4,12. Реагенты, упомянутые упоминаются поставщиком следующим образом: В1 (Второй Strand буфера Mix) и B2 (второй нити смеси ферментов).

  9. Спином вниз B2 и B3 в течение 2 сек и быстро разместить на льду. Оттепель B1 при комнатной температуре. Смешайте с помощью вихревого-смеситель на 2 сек, спин на 2 сек и быстро разместить на льду.
  10. Подготовьте второй нити Master Mix следующим образом (приведены для одной реакции). Смешайте с помощью пипетки и спином вниз бри Мастер Mixлетать. Сразу поместите на льду.
    Реагент Объем
    Второй буфер Mix Strand (B1) 9,75 мкл
    Второе направление смеси ферментов (В2) 0,25 мкл
  11. Добавить 10 мкл основной смеси к каждому первой цепи реакционную трубку. Смешайте с помощью пипетки 3 раза, спина на 2 сек и место на льду (конечного объема: 20 мкл).
  12. Инкубируют при 4 ° С в течение 1 мин, затем 25 ° С в течение 10 мин, затем 50 ° С в течение 30 мин, а затем 70 ° С в течение 5 мин. Хранить в прохладном месте при температуре 4 ° C. Извлечь тестовую трубку от термоциклер, кратко вращаться и держать на льду. Продолжить сразу с шагом после Второй Strand Enhancement.

    Шаг 3: После Второй Strand Повышение от 4,13 - 4,15. Реагенты, упомянутые упоминаются поставщиком следующим образом: В1 (Второй Strand буфера Mix), В3 (Реакция Повышение смеси ферментов).

  13. Подготовьте Master Mix путем объединения B1 и B3 Mix следующим образом (приведены для одной реакции). Смешайте с помощью пипетки и спин вниз кратко Мастер Mix. Сразу поместите на льду.
    Реагент Объем
    Второй буфер Mix Strand (B1) 1.9 мкл
    Реакция Повышение смеси ферментов (B3) 0,1 мкл
  14. Добавить 2 мкл основной смеси к каждому Во-вторых Strand реакционную трубку. Смешайте с помощью пипетки 3 раза, спина на 2 сек и место на льду (конечного объема: 22 мкл).
  15. Инкубируют при 4 ° С в течение 1 мин, затем 37 ° С в течение 15 мин, а затем 80 ° С в течение 20 мин. Хранить в прохладном месте при температуре 4 ° C. Извлечь тестовую трубку от термоциклер, кратко вращаться и поместите на льду. Продолжить сразу с шагом SPIA Amplification.

    Шаг 4: Одноместный цепь кДНК (sscDNA) синтез процедурой SPIA от 4,16 -4.19. Реагенты, упомянутые упоминаются поставщиком следующим образом: C1 (SPIA Грунтовка Mix), С2 (Буфер Mix SPIA), С3 (SPIA смеси ферментов).

  16. Разморозить C1 и C2 при комнатной температуре. Смешайте с помощью вихревого смесителя, спина на 2 сек и быстро разместить на льду. Оттепель C3 на льду. Смешайте содержимое, аккуратно переворачивая 5x. Убедитесь в том, чтобы не вводить пузырьков воздуха. Тогда, спина на 2 сек и место на льду.
  17. Подготовьте SPIA-Master Mix, на которые приходится объеме 0,5 отходов, следующим образом. Смешайте с помощью пипетки и спин вниз кратко Мастер Mix. Сразу поместите на льду.
    Реагент Объем
    SPIA-буфера Mix (С2) 5 мкл
    SPIA-Грунт Mix (С1) 5 мкл
    SPIA-смеси ферментов (С3) 10 мкл
  18. Добавить 20 мкл SPIA Master Mix в Enhanced Во-вторых Strand реакции тУбе. Смешайте с помощью пипетки 6-8x, спина и быстро разместить на льду (конечный объем: 42 мкл).
  19. Инкубируют при 4 ° С в течение 1 мин, затем 47 ° С в течение 60 мин и затем 95 ° С в течение 5 мин. Хранить в прохладном месте при температуре 4 ° C. Снимите трубку от термоциклер, кратко вращаться и поместите на льду.

5. sscDNA Очистка и контроль качества

  1. sscDNA очистки. Очищают sscDNA помощью набора для очистки QIAquik PCR (Qiagen). Вкратце, начинают добавлением 200 мкл буфера PB с 42 мкл амплифицированной кДНК продукта, перемешать и Нагрузка на колонку. Затем следуйте инструкции Qiagen. Наконец, возьмите 3 мкл (из 30 мкл) аликвоты sscDNA очищенного продукта для контроля качества (шаг 5.2).
  2. sscDNA дают и проверка распределение по размерам (рис. 4б). Проверьте sscDNA выход и распределение по размерам, используя Bioanalyzer и NanoDrop, в соответствии с инструкциями производителя. Размер распределения усиленных кДНК должны бе правило составляет от 100 до 1500 баз длинных с пиком около 600 баз.

6. sscDNA Фрагментация

  1. Подготовьте 2 мкг кДНК в 30 мкл, регулировки громкости с помощью нуклеазы без воды.
  2. Приготовьте 1х Один-Phor-все Buffer PLUS (OPA), начиная с буфером 10x OPA PLUS решения.
  3. Подготовка 0,2 ед / мкл ДНКазы I (5-кратное разведение 1 ед / мкл ДНКазы I).
  4. Подготовьте фрагментации Master Mix следующим образом (приведены для одной реакции):
    Реагент Объем
    10X Один-Phor-Все буфера ПЛЮС 3.6 мкл
    ДНКазы I (0,2 ед / мкл) 3 мкл
  5. Добавить 6,6 мкл фрагментации Mix с 30 мкл sscDNA.
  6. Спин и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин, затем инактивации ДНКазы I при 95 ° С в течение 10 мин и держать на льду. Алиготе 1 &# 181; л фрагментированной кДНК Agilent основе размера распределения проверки.
  7. sscDNA проверка распределение по размерам (рис. 4С). Проверьте sscDNA распределение по размерам с использованием Bioanalyzer (Agilent). Распределение размера фрагментированной кДНК следует, как правило, составляет от 35 до 200 оснований.

7. Маркировка разобщенном sscDNA

  1. Развести DLR-1а 7.5 мм до 5 мм в DEPC воды.
  2. Подготовка метящим Master Mix следующим образом (с учетом для одной реакции):
    Реагент Объем
    5x TdT реакционного буфера 14 мкл
    CoCl 2 (25 мм) 14 мкл
    DLR-1a (5 мМ) 1 мкл
    Терминал трансферазы (400 ед / мкл) 4.4 мкл
  3. Добавить 33,4 мкл маркировки смесикаждому фрагментированной образца кДНК.
  4. Смешайте, щелкая трубки, кратко вращаться и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 60 мин, затем держать на льду.

8. Гибридизация в Microarray HERV Chip

  1. Предварительно смочите Herv GeneChip 200 мкл предварительной гибридизации Mix (Affymetrix) и инкубируют при 50 ° C, 60 оборотов в минуту, в течение 10 мин.
  2. Подготовьте гибридизации смеси следующим образом (приведены для одной реакции):
    Реагент Объем
    Контроль Олиго В2 (3 нМ) 3.3 мкл
    20x эукариот Гибридизация управления 10 мкл
    2x Гибридизация Mix 100 мкл
    99,9% DMSO 17.7 мкл
  3. Добавьте 131 мкл гибридизации Mix с 69 мкл фрагментированной и с надписью кДНК при комнатной температуре, чтобы сделать окончательный VOЛуме из 200 мкл.
  4. Смешать и денатурации в течение 2 мин при 95 ° С, а затем инкубируют при 50 ° С в течение 5 мин и центрифуге при максимальной скорости в течение 5 мин.
  5. Слейте prewetted Herv GeneChip и загрузить целевую подготовку 200 мкл. Применить жесткие-спотов на два перегородками.
  6. Гибридизации при 50 ° С, 60 оборотов в минуту, в течение 18 часов.
  7. Через 18 ч очистить Herv GeneChip и хранить собранный раствор гибридизации при 4 ° С. Заполните массив зонда с 250 мкл промывочного буфера А. Если чипы не сразу выбегают на гидравлической системы, хранимые при 4 ° С.

9. Стиральная и Окрашивание

  1. Запуск FLUIDICS в строке меню ГСНК. В диалоговом окне FLUIDICS, выберите станцию ​​интереса (1 - 4), затем выберите Shutdown_450 для всех модулей, а затем запустить. Погрузите 3 FLUIDICS аспирационных строки в Milli-Q воды. Следуйте инструкциям ЖК-экран.
  2. Применить программу Prime_450 ко всем модулям. Поместите трубки для промывочного буфера А вфлакон, содержащий 400 мл промывочного буфера А, и один для промывочного буфера B во флакон, содержащий 200 мл промывочного буфера B. С другой стороны, следуйте инструкциям ЖК-экран.
  3. Поднимите иглы и поместите 600 мкл пятно коктейль 1 (SAPE Решение Mix) и 600 мкл пятно коктейль 2 (антитела Решение Mix), содержащих микроцентрифужных пробирок на позициях № 1 и № 2, и 800 мкл массив, содержащий буферный раствор с позиции № 3 .
  4. Связать правильный чип для каждого модуля, выберите протокол FS450-004 и запустить каждый модуль, следуя инструкциям на экране.

10. Сканирование

  1. Разминка сканер GS3000. Он готов для сканирования, когда свет становится зеленым.
  2. Применить жесткие-спотов на перегородками, чтобы избежать утечки затем загрузить чип в автомате заряжания или же непосредственно в сканер. Запустите сканирование.
  3. После сканирования чипа,. Генерируются CEL файлы. Проверьте изображение и выровнять сетку на месте определить зонда клеток (<сильные> Цифры 4D-F).

11. Анализ данных

  1. Контроль качества. Обратитесь к стандартной Affymetrix контролирует, чтобы убедиться, что HERV-V2 чипы соответствуют критериям КК. Для этой цели можно использовать следующие представления: распределение значений интенсивности журнала (графики плотности и коробка участков), средний абсолютное отклонение (MAD) по сравнению медианы интенсивности (MAD-Med) Земельные участки, фоновые участки, нормированная немасштабированное стандартная ошибка (Nuse) участки и относительная выражение журнал (УПИ) участки.
  2. Нормализация. Кроме того, набор данных должны быть изучены, чтобы выделить неожиданные эффекты пакетные и исправить их до статистического анализа. Таким образом, предварительная обработка данных включает в себя фоновый коррекции (например. На основе триптофана зонда базового сигнала), а затем RMA нормализации и обобщения 15.
  3. Интеллектуальный анализ данных и поиск дифференциальных выразил генов. Нормализовать фишки и применять иерархическую clusteriнг подход исследовать набор данных (рис. 6а). Затем выполните поиск разному экспрессируются гены (DEG), используя классическую значительный анализ микрочипов (SAM) процедуры 16 с последующим ложных обнаружения (FDR) коррекции 17. Обратите внимание, что эти шаги были полностью интегрированы в некоторых анализа программного обеспечения люкс, как Partek GS, но может альтернативно быть выполнены с помощью R статистического программного обеспечения 18 с помощью пакетов из проекта Bioconductor 19. После статистического анализа, фильтрации набора данных, чтобы исключить probesets, для которых значения экспрессии которых меньше 2 6.
  4. Визуализация и интерпретация. Интерпретировать результаты из HERV-V2 микрочипов в выделенном интерфейса с помощью аннотаций базы данных.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Значение транскриптомных исследований состоит прежде всего в качестве исходного биологического материала. Если извлечение РНК выполняется при оптимальных условиях, РНК Целостность Количество (RIN), как правило, 7 или более (рис. 4А). Необходимость гибридизуются 2 мкг кДНК на чипе Affymetrix HERV-V2 предполагает использование процесса амплификации. Успешный шаг усиления приводит к колоколообразной распределения (рис. 4В). Затем, фрагментация DNAse1 выполняется для того, чтобы гомогенизировать распределение по размерам кДНК около 100 нуклеотидов до гибридизации (фиг.4С). После гибридизации и сканирования (рис. 4D), визуальный осмотр на изображение дает возможность проверить, если сетка хорошо согласован с пятнами (рис. 4E) и если контроль гибридизации согласуются (рис. 4F). Этот шаг также полезно, чтобы исключить микрочипов, в которой пузырьки воздуха или ошибки произошло во время эксперимента.

После того, как чипы прошли контроль качества (рис. 5) и после нормализации, статистический анализ 5 опухоли матч-пар и нормальных простаты образцов РНК из больницы Лион-Sud привело к идентификации 207 HERV probesets с дифференциальных значений выражений (p.val <0,05) (фиг.6А). Для поддержки этих записей и получить простат-специфического информацию, 35 дополнительных образцов матч-пара (толстой кишки, яичников, семенников, молочной железы, легких и простаты) были добавлены к анализу и процедуре SAM-FDR (FDR = 20%) в конечном счете определены 44 простатического специфического HERV probesets. Среди них, наиболее релевантные 10 HERV структуры описываются (рис. 6Б). Дальнейшие клинические исследования будут необходимы для оценки значения чувствительности и специфичности этих кандидатов биомаркеров.

pload/50713/50713fig1.jpg "ширина =" 500px "/>
. Рисунок 1 Схема общей процедуры из клиники (1: простатэктомия лечащим врачом и подготовки ткани по патологоанатом) к скамейке (2-6: подготовка проб, подготовка целевой, обработка микрочипов), ведущие к выявлению кандидатов биомаркеров (7: biocomputing анализ HERV микрочипов). Нуклеиновые кислоты, полученные из нормальной ткани изображены оранжевым; нуклеиновые кислоты, полученные из опухолевой области состоят из смеси нормальных (оранжевый) и конкретных опухоли (черный) нуклеиновые кислоты. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-1
. Рисунок 2 Концепция и содержание чипа HERV-V2: последовательности HERVизвлекаются из генома человека хранятся в базе данных под названием HERV-gDB3, то 25-Мер-кандидаты зонды пройти через специальный процедуры гибридизации моделирования (EDA +) перед конечном счете синтезируется на матрице (в результате целенаправленных субрегионов изображены для каждого семья). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-2
Рисунок 3. Обработка простаты патологом. (A) Свежий радикальной простатэктомии образец переносят в лабораторию. (BC) предстательной железы окрашивали (зеленый на правой стороне, черный на левой стороне). (D) Большой поперечное сечение железы на задней стороне. (Е) Оставляя полей нетронутыми, Piecэс тканей расчленены из разных областей железы. (F) Ядра ткани помещают в пробирку Эппендорфа. (G) шовный нить используется для закрытия простату и предотвратить железы искажения и минимальное нарушение хирургического края. Затем радикальная простатэктомия образец готов для фиксации в формалине в соответствии с обычной процедурой для гистологического анализа. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-3
Управления Рисунок 4. Качества подготовки нуклеиновой кислоты и эффективности гибридизации. (A) целостность РНК, (B) кДНК амплифицировали цели и (с) фрагментированных цели, используемые на стадии гибридизации. ЧтESE три контроля качества были получены с Bioanalyzer помощью РНК нано фишки и анализа эукариот Nano Серия II. (D) Общая образ HERV-V2 микрочипов гибридизации области после сканирования, (E) укрупнение левом верхнем углу показывая сетки контроля выравнивания и (F) расширения центральной площади, показывая кровянистые выделения управления гибридизации. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-4
Рисунок 5. Обработка сигналов. (А) Affymetrix поли шип-в контрольной амплификации. Поли контролирует скока, THR, Phe и Lys стенограммы из B. Сенная гены шипами в образце РНК и служат для оценки общего успеха из шагов подготовки целевых. Интенсивность должна быть обнаружены при уменьшении значения из этих элементов управления шип-в для того, чтобы не было никакой предвзятости в ходе усиления WT-Ovation между высоко-и низко-выразил генов. (В) Affymetrix шип-в контрольной гибридизации. Эти цели, выделенные из Е. палочка и P1 бактериофага которые шипами до процедуры маркировки. Увеличение значения за BioB, BioC, BIOD и Cre указывают общий успех гибридизации. (C) Распределение интенсивности сигналов чип после RMA нормализации. Большинство probesets выставочных сигналов со значениями ниже 2 6 (фоне), что указывает на общее выражение в основном ограничено в некоторой конкретной HERV локусов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 6. Анализ данных. (А) Иерархическая анализ кластеризации нормальных и опухолевых образцов. Разметка кластеризации был применен к нормированных значений выражений с использованием алгоритма Евклида функцию расстояния, группировка probesets в до (красный) - и вниз (синий)-регулирование среди нормальных и опухолевых образцов. (В) Выбор из 10 лучших HERV структур, определенных в качестве кандидата биомаркеров рака простаты. Для каждого HERV элемента, соответствующий семья HERV, геномные координаты (NCBI 36/hg18) и краткое описание структуры HERV даны. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-5
Рисунок 7. HERV репертуар. (А) Секвенирование генома человека показало, 25000 белок-кодирующих генов (экзонов, 2%) и огромное количество мобильных элементов в том числе 200 000 давно концевой повтор (LTR) ретротранспозоны (HERV, 8%). (В) Экстраполяция от содержания чипа HERV-V2 и связанные данные выражения (79 образцов, происходящих из 8 нормальной против опухолевых типов тканей) показывают, что одна треть HERV репертуара транскрипционно активны. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-results-6
Рисунок 8. Функциональная интерпретация сигналов от чипа. (А) идентификация Промоутер и эпигенетические управления: U3 негативный сигнал (красный зонд, 5'LTR) По сравнению с R-U5 позитивный сигнал (синий зонд, 5'LTR) предложить U3-приводом транскрипцию, при поддержке различных CpG метилирования (сплошные черные кружки) содержание U3 в перитуморальной нормально по сравнению с опухолевыми тканями. (В) Сращивание стратегия: предполагаемый 3,1 кб конверт кодирования мРНК экспрессируется исключительно в опухоли определяется с помощью SD1/SA2 сплайсинга перекрытия зонд. * Вывел путем сравнения с другими не-плацентарных тканей. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние 10 лет, большинство попыток для измерения экспрессии HERV использовали методы ОТ-ПЦР либо сосредоточиться на конкретной локуса 20-24 или на основании относительной сохранения генов загрязняющих чтобы оценить общие тенденции в HERV родов 25,26 . Кроме того, ПЦР амплификации с использованием вырожденных праймеров высоко в сочетании с низкой плотностью микрочипов, предназначенных для обнаружения и количественной оценки экспрессии HERV семей 27,28. Чтобы проследить выражение индивидуального локуса в семье, подходы, основанные на ПЦР-амплификации консервативных участков в сочетании с последующей клонирования и секвенирования включен транскрипционно активные различных элементов HML-2 29,30 или HERV-E4.1 31 семей в быть идентифицированы. Также заканчивая клонирования и секвенирования шагов, техника мониторинга экспрессии генома повторите целях выявления промоутеров среди повторов определенных активных HML-2 конкретные единичные л человека 32,33. Мы последовательно разработаны два поколения микрочипов высокой плотности, посвященные анализу HERV транскриптома, представляя методологии для многократного дизайна элемент зонда с целью минимизации перекрестных реакции между паралогических элементов внутри семьи 34,35. Чип HERV-V2, какие цели 2690 различных провирусов и 2883 сольные л на HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 и HERV-K HML-5 семей, представила Выражение 1718 HERV локусов (7А и В) в широком диапазоне тканей 35, проиллюстрированных в данном документе по идентификации предполагаемых биомаркеров рака простаты. Кроме того, использование нескольких probesets на данном локусе является информативным о его регуляции транскрипции. Во-первых, U3 отрицательный сигнал в сочетании с U5 положительный классифицирует LTR в качестве промотора, и наоборот U3 положительные и отрицательные сигналы U5 может отражать роль полиаденилирования. Таким образом, мы, яdentified 326 промоутер л в широком диапазоне тканей 35, и на основе этого U3-U5 дихотомической информации, предоставленной массива, мы предложили и экспериментально подтверждена для некоторых отдельных случаях, что такая автономная транскрипции контролировалась метилирования зависимой эпигенетической процесса 34 (рис. 8). Во-вторых, обнаружение сигналов, например, от LTR, кляп и окр независимые probesets или выдается от зондов, направленных на конкретную сплайсинга является информативным о провирусного стратегии сплайсинга, о чем свидетельствует профиля экспрессии ERVWE1/Syncytin1 в плаценте или в опухолевой яичка 34. Это означает, что процесс отбора HERV специфическим зондом является достаточно прочным, чтобы поддерживать идентификацию ткани ассоциированных стратегии сплайсинга, так же эффективно, как и для обычных генов 36 (фиг. 8).

Этот метод является первой попыткой определить индивидуально Herv выражение локусиспользуя пользовательские высокой плотности микрочипов на основе технологии Affymetrix. Четко определенные преимущества формата микрочипов расшифровать Herv транскриптома, состоящую из (I) скоординированное исследование нескольких семей HERV и (II) одновременное и независимое анализ различных регионов для каждого локуса, например. U3 и U5 домены для соло и провирусная LTRs, кляп или окр регионов и возможных сплайсированных переходов, связанных с провирусная конструкции, не содержащие априори на функциональности HERV элемента. Перспективы полагаться на улучшение аннотации в микрочипов связанных biocomputing инструментов. Это должно позволить один для преобразования сигналов чип в биологические гипотез, например от того, подтвержденные активные HERVs ездить lncRNA транскрипцию или модулировать более или менее проксимального кодирования экспрессию генов. Действительно, такое предположение подтверждается недавними исследованиями, выявленных рак связаны ncRNA стенограммы простаты, содержащие компоненты VИРАЛ ОРС от HERV-K эндогенного семейства ретровирусов или части вирусного LTR промоторной области 37, а также двух событий слитый ген а именно HERV-K22q11-ETV1 и HERV-K17-ETV 38,39. Взятые вместе, весь этот подход транскриптома в сочетании с функцией LTR и идентификаций стратегии сплайсинга может помочь расшифровать маркер против компонентов запуска выражения HERV при хроническом 40,41 и инфекционных заболеваний 42,43.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Biomerieux SA, Хоспис Civils де Лион и французской государственного органа OSEO (Advanced Diagnostics для новых терапевтических подходов, французский финансируемую правительством программу, посвященный персонализированной медицины). ПП, ВК, ВПЕРЕД, Н. М. и FM являются сотрудниками Biomerieux SA. ПП, Н. М. и FM подали заявки на патенты выводы этой статьи.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Сесиль Montgiraud, Джульетт Хименес, Magali Jaillard и Бертрана Бонно за их вклад в начальной разработки и оптимизации протокола HERV-V2. Мы также хотели бы поблагодарить Хадер Haidous за его руководство по этическим соображениям.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ТризолИнвитроген15596-026
РНК поли-А контрольный стокAffymetrix900433
ДНКаза 1PromegaM61011,000 U (1 U/µ l)
Терминальная трансферазаRoche3333574001400 U. Включая фермент и коэнзим (CoCl2).
DLR-1aAffymetrix900542
Внутренний контроль гибридизации B2 и 20x Контроль эукариотической гибридизацииAffymetrix900454
GeneChip Гибридизация, промывка и окрашиваниеAffymetrix900720включая смесь для предварительной гибридизации и 2x смесь для гибридизации для 30 реакций
10x One-Phor-All Buffer PLUSСостав в воде, обработанной DEPC: 100 мМ Трис-ацетат pH 7,5; 100 мМ ацетата магния; 500 мМ ацетата калия.
RNeasy Mini kitQiagen74104Протокол очистки РНК
WT-Ovation Система амплификации РНКNugen2210-24
QIAquik Набор для очистки ПЦРQiagen28104
EQUIPMENT
Название материалаНомер компании Каталожный номерКомментарии Nanodrop
1000Сканер
3000 7GAffymetrixGS30007GОпционально: автозагрузчик
GeneChip Fluidics Station 450AffymetrixFS450
GeneChip Hybridization 640 ПечьAffymetrix640включает в себя 4 носителя
матрицы датчиков GeneChipРабочая станция оснащена операционным программным обеспечением GeneChip (GCOS), включая сканирующий патч
HERV-V2AffymetrixCustom array.
Для получения микрочипов (только для исследовательского использования), пожалуйста, свяжитесь с:
Franç ois Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMé rieux
Отделение медицинских диагностических исследований
Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâ timent 3F
69495, Pierre Bé nite cedex France
Телефон: 33 (0)4 72 67 87 85
Электронная почта: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Dedicated database and annotations

Создание специализированной базы данных, объединяющей геномные последовательности HERV, принадлежащие к 6 семействам HERV, была достигнута с помощью следующей процедуры: (i) наиболее полная и репрезентативная последовательность каждого семейства HERV была выбрана из литературы и определена как прототипная последовательность (Рисунок 2). (ii) 6 прототипов были функционально аннотированы с учетом их LTR (U3/R/U5) и внутренних частей (gag/pol/env). (iii) Затем был применен RepeatMasker 44 с использованием этих функциональных последовательностей в качестве входных библиотек. Полногеномный поиск всех родственных последовательностей был проведен в геноме человека на основе гомологии не менее 80% (NCBI 36/hg18). (iv) Наконец, функциональные последовательности, полученные в результате этого процесса, были собраны в отдельные локусы на основе их геномного местоположения и в конечном итоге внедрены в специальную базу данных HERV. Эта база данных, называемая HERV-gDB3, содержит 10 035 отдельных локусов HERV35.

Locus-specific probes design
Начиная с HERV-gDB3, сначала были сгенерированы перекрывающиеся треки 25-мерных зондов-кандидатов. Затем каждый потенциальный зонд был сопоставлен с геномом человека с использованием KASH 45 для оценки возможностей кросс-гибридизации. Эта последняя оценка была выполнена с помощью модели, разработанной специально для этой цели и получившей название EDA+. Вкратце, принцип EDA+ заключается в учете нестабильности, вызванной несоответствиями и пробелами в комплексе гибридизации мишень/зонд с 25 мерами. Зонды-кандидаты с низким риском кросс-гибридизации (т.е. низкое количество неспецифических геномных мишеней) отбираются и, наконец, собираются в наборы зондов.

Custom HERV GeneChip microchip
Специальный HERV GeneChip интегрирует 23 583 набора зондов HERV и может различать 5 573 различных элементов HERV, состоит из одиночных LTR, полных и частичных провирусов (Рисунок 2). Стандартные контрольные зонды Affymetrix для несмещенной амплификации и гибридизации также были включены в состав микрочипа.
, GeneChip от Thermo Scientific высокого разрешения GeneChip Scanner 3000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).">Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
  2. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).">Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
  3. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).">You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
  4. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).">Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
  5. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).">Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
  6. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).">Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
  7. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).">Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
  8. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).">Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).
  9. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).">Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
  10. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).">Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
  11. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).">Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
  12. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).">Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
  13. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).">Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
  14. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).">Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
  15. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).">Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
  16. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).">Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  17. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).">Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
  18. Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  19. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).">Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).
  20. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).">de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
  21. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).">Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
  22. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).">Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
  23. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).">Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
  24. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).">Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
  25. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).">Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
  26. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).">Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
  27. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).">Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
  28. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).">Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
  29. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).">Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).
  30. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).">Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).
  31. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).">Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).
  32. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).">Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).
  33. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).">Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
  34. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).">Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
  35. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).">Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).
  36. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).">Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).
  37. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).">Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
  38. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).">Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
  39. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).">Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
  40. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).">Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
  41. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).">Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
  42. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).">Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
  43. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).">Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).
  44. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).">Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
  45. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).">Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HERV Loci ExpressionMicroarray AnalysisProstate Cancer BiomarkersRNA ExtractionWhole Transcriptome AmplificationHERV Gene ChipHybridization ProtocolDifferential Expression AnalysisFunctional ValidationBiomarker Discovery

Related Articles