Стволовые Программирование Клетки для терапевтической ангиогенеза Использование биоразлагаемых полимерных наночастиц

Summary

Мы описываем метод программирования стволовых клеток сверхэкспрессировать лечебных факторов для ангиогенеза помощью биоразлагаемых полимерных наночастиц. Процессы, описанные включают синтез полимера, трансфекции полученных из жировой ткани стволовые клетки в пробирке, и проверки эффективности запрограммированными стволовых клеток стимулировать ангиогенез в мышиной ишемии задней конечности модели.

Abstract

Контролируемый рост сосудов имеет решающее значение для успешной регенерации тканей и заживления ран, а также для лечения ишемических заболеваний, таких как инсульт, инфаркт или периферических артериальных заболеваний. Прямые поставки ангиогенных факторов роста имеет потенциал, чтобы стимулировать новый рост кровеносных сосудов, но часто ассоциируется с ограничениями, такими как отсутствие адресности и коротким периодом полураспада в естественных условиях. Генная терапия предлагает альтернативный подход, предоставляя гены, кодирующие ангиогенные факторы, но часто требует использования вируса, и ограничивается соображений безопасности. Здесь мы опишем недавно разработанной стратегии стимулирования роста сосудов на программирования стволовых клеток сверхэкспрессировать ангиогенные факторы на месте с помощью биоразлагаемых полимерных наночастиц. В частности наша стратегия используется стволовые клетки как средств доставки, воспользовавшись их способности мигрировать в сторону ишемических тканей в естественных условиях. Используя оптимизированные полимерные векторы, полученные из жировой тканиСтволовые клетки были модифицированы для сверхэкспрессии ангиогенный ген, кодирующий фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Мы описаны способы синтеза полимеров, формирования наночастиц, трансфекции стволовых клеток в пробирке, а также методов проверки эффективности VEGF-экспрессирующих стволовых клеток для стимуляции ангиогенеза в мышиной модели ишемии задней конечности.

Introduction

Общая цель этой техники заключается в содействии терапевтический ангиогенез с использованием не-вирусно запрограммированные стволовые клетки гиперэкспрессией лечебных факторов на месте ишемии. Стволовые клетки были изменены экс естественных первом использовании биоразлагаемые наночастицы, синтезированные в лаборатории, а затем пересадили в мышиной модели ишемии задней конечности, чтобы проверить их потенциал для повышения ангиогенез и тканей спасение.

Контролируемый рост сосудов является важным компонентом успешного регенерации тканей, а также для лечения различных ишемических заболеваний, таких как инсульт, ишемия конечностей и инфаркту миокарда. Некоторые стратегии были разработаны для содействия роста сосудов, в том числе поставки фактора роста и клеточной терапии. ¹ Несмотря на эффективность наблюдается в моделях заболеваний животных, эти методы все еще ​​сталкиваются ограничений, таких как потребность в супрафизиологического доз для доставки фактора роста, или недостаточное паракринныйосвободить одними клеток. Одним из потенциальных стратегия преодоления вышеуказанных ограничений является сочетание терапии стволовых клеток и генной терапии, в результате чего стволовые клетки генетически запрограммированный экс естественных до трансплантации сверхэкспрессировать желательные лечебных факторов. Этот подход был продемонстрирован в различных моделей заболеваний, включая ишемии задней конечности ^2, болезни сердца, костного ³ заживления ⁴ и ⁵ нервной травмы и др. Тем не менее, большинство методов генной терапии полагаться на вирусные векторы, которые связаны с проблемами безопасности, такие как потенциального иммуногенности и инсерционного мутагенеза. Биоматериалы опосредованные невирусный доставку генов может преодолеть эти ограничения, но часто страдают от низкой эффективности трансфекции. Чтобы ускорить открытие новых биоматериалов для эффективного невирусной доставки генов, недавние исследования использовали комбинаторной химии и высокопроизводительного скрининга подход. Биоразлагаемые полимерные библиотеки, такие как поли (β-амино эсОслабляет) (PBAE) были разработаны и просеивают, что привело к открытию ведущих полимеров с заметно улучшенной эффективности трансфекции по сравнению с обычными полимерными векторных коллегами. ^6-7

В данном случае мы описали синтез PBAE и проверки их способности для трансфекции полученных из жировой ткани стволовые клетки (ADSCs) в пробирке с последующим последующей трансплантации генетически модифицированных ADSCs гиперэкспрессией фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в мышиной модели ишемии задней конечности . Результаты оценивались путем отслеживания судьбы клеток использованием изображений биолюминесценции, оценки тканей реперфузию помощью лазерного доплеровского перфузии (LDPI), и определения ангиогенез и тканей спасение по гистологии.

Protocol

1. Полимер Синтез

1. В вытяжной шкаф, отвешивать 3523 мг бутандиолдиглицидилового диакрилата (C) и трансфер в стеклянной сцинтилляционный флакон, содержащий мешалки.
2. Нагреть 5-амино-1-пентанол (32) до 90 ° С, чтобы растворить соль, то в вытяжном шкафу, взвесить 1533 мг 32 и добавить в сцинтилляционный флакон, содержащий этот метод С приведет в молярном соотношении из C: 32 = 1:1,2.
3. Сразу же место флакона оба решения на магнитной мешалки. Установить скорость перемешивания при 600 оборотах в минуту.
4. Перенести сцинтилляционный флакон с печи при 90 ° С Установка скорости перемешивания в 1000 оборотах в минуту в течение 4 часов. Если мешалку застревает, снизить скорость. Через 4 ч, более низкая скорость до 300 оборотов в минуту и ​​поддерживать при 90 ° С в течение еще 12-16 часов.
5. Добавить 5 г C32 в 10 мл безводного тетрагидрофурана (ТГФ) в стекл нный сцинтилл ционный флакон, содержащий мешалку. Оберните в фольгу и вихря на высокой до полного растворения.
6. В отдельном стекло сцинтилляционный флакон Контаining мешалкой, добавить 10 мМ Tetraethyleneglycoldiamine (122). Добавить 40 мл ТГФ.
7. Положите обе ампул (C32 и 122) на магнитной мешалки в течение 5 мин затем объединить вместе. Обложка в фольгу и оставить при комнатной температуре при перемешивании при 400 оборотах в минуту в течение 24 часов. Конечный продукт называется C32-122.
8. Взвесить 5 х 50 мл Сокол труб для каждого 5 г партии C32-122. Обратите внимание на массу каждой трубы в записной книжке.
9. Передача 30 мл безводного диэтилового эфира по 50 мл каждого сокола трубки.
10. Передача 10 мл C32-122 в каждой 50 мл трубки Сокол.
11. Vortex Сокол труб энергично затем центрифуге при 2500 оборотов в минуту в течение 2 мин. Примечание: Извлеченный полимер будет собирать на базе трубки.
12. Откажитесь от верхнего решение и повторите шаги 1,9 и 1,11 еще два раза.
13. Поместите открытые пробирки, содержащие извлеченный C32-122 в эксикаторе и вакууме в течение ночи. Убедитесь, что все трубы защищены от света.
14. Взвесьте все пробирки, содержащие C32-122 для определения окончательного массуизвлекается полимер.
15. Растворить извлеченный полимер в безводном ДМСО в концентрации 100 мг / мл.
16. Хранить растворенного полимера при -20 ° С в защищенном от света и влаги.

2. Сотовый Посев

1. Предварительное покрытие основание Т-150 тканевой культуральной колбе с 0,1% (вес / объем) желатин. Желатин должен оставаться в колбе в течение 30-45 мин. Желатин покрытие помогает адгезии ADSCs.
2. Аспирируйте желатин из предварительно покрытых Т-150 колбы.
3. Добавить 4 × 10 ⁶ ADSCs (≤ пассаж 3) в колбу на 20 мл DMEM, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 10 нг / мл BFGF.
4. Поместите Т-150 колбу в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO ₂ в течение ночи.
5. Начните процедуру трансфекции на следующий день.

3. Наночастиц Подготовка и Трансфекцию

1. Ниже приведены инструкции для получения наночастиц, содержащих 16,1 мкг плазмидной ДНК за1.0 х 10 ⁶ клеток на полимере в плазмиды весовое соотношение 30:1.
2. Развести плазмидной ДНК (1 мг / мл, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) в конечной концентрации 120 мкг / мл в ацетата натрия (25 мМ) в 15 мл сокола трубки.
3. Развести c32-122 (100 мг / мл) в конечной концентрации 3,6 мг / мл в ацетата натрия (25 мМ) в 15 мл втором сокола трубки.
4. Объединить содержимое каждой пробирки Фалкон в единый 15 мл трубки сокола и вихря сразу на высокой в ​​течение 10 сек.
5. Пусть трубка сидеть при комнатной температуре в течение 10 мин для формирования наночастиц, чтобы произойти.
6. Хотя инкубации, заменить среды в культуре ткани колбу с 7,8 мл полностью дополненной DMEM за 1,0 х 10 ⁶ клеток, трансфицированных.
7. Перенести наночастиц решение тканевой культуральной колбы и наклон вперед и назад, чтобы равномерно распределить.
8. Место культуры колбу тканей в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO ₂ в течение 4 часов.
9. Через 2 часа, замените наночастицычастица, содержащая носитель с DMEM.
10. После дальнейшего 2 ч инкубации при 37 ° С, 5% СО _2, клетки готовы к естественных инъекции в.

4. Задних конечностей Процедура Ишемия

1. Все эксперименты проводились в соответствии с Стэнфордского университета уходу и использованию животных комитета Руководства и утвержденных протоколов APLAC. Генерация мышиной модели ишемии задней конечности выполняется, как описано выше. ⁸ См. задания для подробных инструкций. Краткое описание приводится ниже.
2. Место мыши под анестезией 1-3% дозы изофлураном при вдыхании и скорости кислорода потока 1 л / мин. Убедитесь глубины анестезии на носок щепотку, уменьшение частоты дыхания, и летаргии.
3. Удалить волосы от региона в животе и обеих областях задних конечностей мыши с кремом для бритья.
4. Сделать надрез в центре медиальной бедра к средней линии, а затем прорезать вышележащих жировой ткани к эксПоставим бедренную артерию.
5. Лигируют артерии на двух площадках: дистальной сайта (близко к колену) и проксимального сайта (только дистальнее паховой связки).
6. Для создания лигирования, отделить артерию из вены и нити 5-0 шелковой нити вокруг артерии. Галстук с артерию с двумя узлами, чтобы сделать перевязку.
7. Удалить артерию между двумя точками лигирования.
8. Вымойте хирургическую область с PBS, а затем сшивать разрез закрыт.
9. Анестезия теперь могут быть удалены. Держите в тепле мыши, пока пробуждению. Для послеоперационного ухода, 2-4 мг / кг лидокаина может быть введен подкожно в область разреза до повторного пробуждения. Далее обезболивание может включать подкожный доставку 0,05-0,1 мг / кг бупренорфина в 12 и 24 часов. Мониторинг состояния здоровья мышей раз в день в течение семи дней, наблюдая изменения в паттерна дыхания, явной боли или дистресса, и цвет кожи.
10. Подтверждение ишемии задней конечности лазерным Доплера перфузии.

5. Сотовые Инъекции

1. Когда трансфицированные клетки и мышей готовы, мыть трансфицированных клеток с PBS, Trypsinize, центрифуге, а затем в счет.
2. Ресуспендируют клеток при плотности 10 × 10 ⁶ клеток на мл в PBS.
3. Клеточные суспензии должны быть разделены на отдельные пробирки Эппендорфа в объеме 110 мкл. Это гарантирует, что каждая мышь получает одинаковое количество клеток.
4. Место каждого мышь под наркозом (2,5% изофлуран, скорость потока 1 л / мин кислорода).
5. Очистите место инъекции спиртовыми салфетками.
6. Используя туберкулиновые шприцы 27 G, рисовать клетки вверх и вниз в шприц для обеспечения получения однородной суспензии достигается. Составление 100 мкл объема клеточной суспензии в шприц.
7. Введите половину суспензии клеток в область приводящей мышцы, а затем вводить другую половину в области икроножных мышц. По инъекционных, оставьте шприц на месте, по крайней мере 15-30 с допредотвратить утечку клеточной суспензии.
8. Собственные средства управления для исследования животных включают в себя: 1) клетки, трансфицированные плазмидой некодирующей (например плазмиды, не биологической активности), 2) в одиночку клетки и 3) PBS.
9. При инъекции являются полными, удалить мышь от наркоза и не согреться, пока мыши повторных просыпается.

6. Биолюминесценция изображений

1. Чтобы начать биолюминесценции томографии (BLI), анестезию мышей, как описано выше.
2. Очистите место инъекции спиртовыми салфетками.
3. Использование инсулина шприц, нагрузка 100 мкл 15 мг / мл D-люциферин (подложки для люциферазы светлячка). Держите субстрат от света месте.
4. Для выполнения внутрибрюшинные инъекции, держать мышей на коже спине тянуть их передней кожи тугой. Вставьте иглу внутрибрюшинно в брюшной области и ввести 100 мкл субстрата.
5. Наведите в изображающего люциферазы камеры IVIS под наркозом.
Изображение мышей с временем экспозиции 1,0 мин. Когда параметры установлены, начинают получать изображения.
6. Когда изображение приобрел, отметьте область интереса для измерения сигнала люциферазы. В этом случае отметить ишемизированной конечности в месте инъекции клеток.
7. Продолжить для измерения сигнала люциферазы каждые 3-5 минут, пока сигнал не достигает пика и начинает снижаться. Это значение используется для сравнения по мышей и в течение нескольких временных точках.
8. После завершения удаления мышей из камеры и анестезии. Хранить мышей теплой до повторного пробуждения.

7. Лазерная доплеровская перфузии

1. Перфузии лазерной доплеровской выполняется, как описано выше. ⁸ Процедура кратко описано здесь.
2. До допплер мышь должна быть чисто выбрит на участках вышележащих оба задних конечностей и брюшной области, чтобы предотвратить артефакт из-за волос.
3. Когда готовы Доплера изображения, мусебе должны быть под наркозом, как описано выше.
4. Теплый мышь, чтобы 36 ° С на горячей плите в то время как мониторинг температуры тела на ректального термометра.
5. Наведите курсор мыши над антибликовым черной поверхности и держать под наркозом на носовом обтекателе. Мышь должны быть размещены на его спинной поверхности с его члены подвергаются равномерно.
6. Поместите датчик лазерного доплеровского примерно 15 см выше мыши и направляя лазерный указатель от датчика к паховой области мыши.
7. При наведении курсора мыши и датчик Доплера находятся в положении, изображения могут быть приняты с использованием программного обеспечения LDPIwin, нажав кнопку Пуск.
8. Измерения Относительные перфузии может быть размещено с указанием оба задних конечностей (ишемическая и неишемическая) как области интересов (ROI). Отношение средней перфузии ишемическая к неишемической задней конечности укажет относительную перфузии.

8. Ткань Урожай Порядок

1. Когда готовы урожай мыши тисподать в суд за гистологии и / или биохимической переработки, мышь должна быть умерщвлены. Здесь, мышь эвтаназии путем воздействия на 5% изофлуран в течение 3-5 мин, а затем эвтаназии мышь смещением шейных позвонков.
2. Разрежьте покрывающий кожу вокруг задних конечностей по окружности на дальнем регионе в животе и приближенную к задней конечности. Кожа будет вырезана из вентральной в спинных поверхностей, таких, что кожа может быть стянуть назад на задней конечности к подножию.
3. После натяжения кожи спины, конечностей может быть ампутирована, используя тупые ножницы рассечение сократить на тазовой и бедренной сустава.
4. Две основные ткани взяты для анализа: медиальной мышцы приводящей и икроножных мышц.
5. Для гистологии, вставлять одну или обе ткани в оптимальной температуре резания (ОКТ) для cryosectioning.
6. Для биохимического анализа, собирают одну или обе ткани в 1,5 мл Eppendorf и погрузить в ванну с жидким азотом в течение по крайней мере 2 мин. Образцы могут бытьхранили при -80 ° С в течение последующей обработки.

Results

При смешивании вместе, положительно заряженный полимер (C32-122) и отрицательно заряженные плазмидной ДНК самосборки в наночастицы. Формирование наночастиц может быть подтверждено путем анализа электрофореза т.е. комплексообразование между C32-122 и ДНК плазмиды помешает мобилизации ДНК во время электрофореза. Полимер выступает в качестве реагента для трансфекции, чтобы облегчить усиленное поглощение ДНК в клетки-мишени и последующую экспрессию кодирующих белки (рис. 2). Клетки могут быть транс...

Discussion

Здесь мы сообщаем метод для программирования взрослые стволовые клетки сверхэкспрессировать лечебных факторов с использованием не-вирусные, биоразлагаемые наночастицы. Эта платформа является особенно полезным при лечении заболеваний, где стволовые клетки могут естественно дом, например, ишемии и рака. ^9-10 Кроме того, не-вирусной доставки генов платформа позволяет переходного сверхэкспрессии лечебных факторов, который подходит для большинства регенерации тканей и раны процессы заживления. Процесс трансфекции ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Фетальная бычья сыворотка	Invitrogen	10082
Пенициллин/стрептомицин	Invitrogen	15070
Основной фактор роста фибробластов	Peprotech	100-18B
1,4-бутандиола диаакрилат (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Аббревиатура: C
5- амино-1-пентанол (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Аббревиатура: 32
Тетраэтиленгликольдиамин > 99 %)	Молекулярные биологические науки	17774	Аббревиатура: 122
Ацетат натрия	G-Biosciences	R010
Фосфат Буферизованный	Инвитроген	14190-144
Тетрахиофуран безводный (> 99.9 %)	Сигма Олдрич	401757
диэтиловый эфир безводный (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
ДМСО безводный (> 99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
желатин	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-люциферин	GoldBio
Оптимальная температура резки (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 антикрысиный IgG	Invitrogen	A11007