Method Article

Определение структуры и координации комплексов пептид-металл с помощью 1D и 2D 1Н ЯМР

DOI:

10.3791/50747

⸱

December 16th, 2013

 ,  , 
1Department of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Hebrew University of Jerusalem

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определена структура ЯМР-раствора модельного пептида металлохаперона с Cu (I) и описан подробный протокол от пробоподготовки и сбора 1D и 2D данных до трехмерной структуры.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Связывание меди (I) транспортными белками металлохаперона предотвращает окисление меди и высвобождение токсичных ионов, которые могут участвовать во вредных окислительно-восстановительных реакциях. Комплекс Cu(I) пептидной модели Cu(I)-связывающего белка металлохаперона, включающего последовательность MTCSGCSRPG (подчеркнуто сохранено), определяли в растворе в инертных условиях методом ЯМР-спектроскопии.

ЯМР является широко признанным методом определения структур растворов белков и пептидов. Из-за трудностей кристаллизации с получением монокристаллов, пригодных для рентгеновской кристаллографии, метод ЯМР чрезвычайно ценен, особенно потому, что он предоставляет информацию о состоянии раствора, а не о твердом состоянии. В данной статье мы описываем все этапы, необходимые для полного определения трехмерной структуры с помощью ЯМР. Протокол включает в себя подготовку образцов в ЯМР-пробирке, сбор и обработку 1D и 2D данных, присвоение и интегрирование пиков, расчеты молекулярной механики и структурный анализ. Важно отметить, что анализ сначала проводился без каких-либо предустановленных связей металл-лиганд, чтобы обеспечить надежное определение структуры несмещенным образом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептиды широко используются в качестве белковых моделей, потенциальных лекарственных препаратов и терапевтических агентов сами по себе. Однако их малые размеры и высокая степень гибкости часто не позволяют определить структуру с помощью рентгеновского излучения из-за трудностей кристаллизации.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) может быть использован для определения пептидных структур и взаимодействий. Метод может дать информацию о локальной и общей структуре, связывании и взаимодействиях с более низким сродством, и он применим к сложным образцам, поскольку это может быть сделано в состоянии раствора.

Транспорт меди в биологических системах достигается за счет внутриклеточных белков металлохаперона меди, которые специфически связывают ионы Cu (I) и доставляют их к своим белкам-мишеням через серию белок-белковых взаимодействий, чтобы защитить ионы от окисления и предотвратить высвобождение токсичной меди2-5. Сайт связывания характеризуется консервативной последовательностью MXH/TCXanyXanyC, которая, как было показано как ЯМР, так и кристаллография, связывает Cu (I) мягкими тиолатолигандами двух остатков цистеина, хотя также был предложен дополнительный внешний лиганд6-8. Структурно-функциональная связь этих белков была предметом интенсивных исследований9.

В представленном здесь исследовании пептидная модель, включающая консервативную последовательность металлохаперонов меди, была синтезирована и ререагировала с Cu (I) в инертной среде. Представленный протокол описывает этапы определения структуры методом ЯМР, включая подготовку образцов, сбор данных, обработку данных, построение структуры и структурный анализ. Анализ проводился в два этапа: сначала были созданы структуры, не имевшие информации о способе связывания пептида с ионом меди. После того, как режим привязки был установлен эмпирически, эти ограничения были введены для обеспечения структуры с высоким разрешением. Способ привязки является существенным моментом в модели и, таким образом, был определен беспристрастным образом.

Определение структуры модельных пептидов методом ЯМР является чрезвычайно ценным методом, который часто используется химиками и биологами. Он может быть относительно легко применен к различным пептидам в различных условиях и, таким образом, может пролить свет насоответствующие механизмы. Понимание процесса прояснения структуры позволяет лучше понять сильные и слабые стороны предлагаемых структур.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка образцов

  1. Апо-образец: Растворить примерно 1-2 мг пептида в 450-500 мкл дейтерированного растворителя класса ЯМР (предпочтительными растворами для биологических образцов являются 10% D2O в воде или d6-DMSO 11-12, если образец не растворяется в воде или вступает с ней в реакцию
    2. ).
  2. Образец, прореагировавший на медь: Растворите примерно 1-2 мг пептида с эквимолярным количеством металлической соли в 450-500 μл растворителя ЯМР.
  3. Отфильтруйте раствор с помощью агломерационного стекла, фильтровальной бумаги или любой другой техники, которая подходит исследуемым соединениям и не адсорбирует их. Это необходимо для удаления любых металлических частиц, которые могут повлиять на однородность.
  4. Переложите раствор в ЯМР-трубку и закройте ее. Убедитесь, что качество трубки соответствует силе используемого магнита (подробнее см. таблицу оборудования).
  5. Если образец чувствителен к кислороду, эти действия необходимо выполнять в инертной среде и герметизировать пробирку для предотвращения окисления.

2. Сбор и обработка данных ЯМР13

  1. Запишите 1D 1H спектры образцов, прореагировавших апо- и медью, и сравните. Спектр медьсодержащих пептидов должен показать значительное изменение химического сдвига в области амида, и пики исчезли, так как апопептид является гибким и имеет среднее количество конформаций, но при взаимодействии с медью амиды связанного пептида имеют единую структуру (рис. 2).
    1. Если спектр не изменился, то предполагается, что реакция не прошла.
    2. Если образец станет зеленым, медь окислится в атмосфере, что может изменить ее связующие свойства.
    3. В обоих этих случаях образец нужно будет переделать.
  2. Найдите оптимальные температурные условия для измерений ЯМР, которые обеспечивают минимальное перекрытие остатков амида с узкой шириной линий.
  3. Поставьте эксперименты COSY14, TOCSY15 и NOESY16 или ROESY17 NMR в идентичных условиях (температура, pH и т. д.) и выполняйте их последовательно.
    1. Эксперименты COSY (рис. 3) и TOCSY (рис. 4) обнаружат сквозные взаимодействия соседних и дальних соседних протон-протонных взаимодействий соответственно. Спектр COSY дает информацию о корреляциях HN-Hα, в то время как спектр TOCSY дает, кроме того, информацию о HN и других алифатических протонах коррелированных остатков.
    2. Эксперименты NOESY и ROESY (рис. 5) обнаруживают пространственную близость без зависимости от связей для получения структурной информации. Выбор между ними осуществляется в зависимости от эффективного размера соединения и напряженности поля. Некоторые из таких комбинаций дают теоретические нулевые сигналы (рис. 6), и для обнаружения взаимодействий NOE10,18 необходимо провести эксперимент ROESY.
    3. Если образец находится в воде, то в экспериментах должен быть компонент подавления воды. Наиболее эффективно это достигается с помощью градиентов19. В этом случае целесообразно повторно запустить образец после назначения в чистом D2O для получения взаимодействий с водородами Hα и между ними.
    4. Оптимизируйте продолжительность микширования TOCSY и NOESY или ROESY, проведя ряд коротких экспериментов для поиска максимального нарастания сигнала с минимальными потерями на спиновую диффузию. Убедитесь, что это линейная область кривой наращивания. Значения, общие для пептидов в полях 600 МГц, включают время смешивания около 100 мс для экспериментов TOCSY и 150 мс для экспериментов NOESY или ROESY.
    5. Проводите одномерные эксперименты между каждым экспериментом, чтобы убедиться, что состав образца остается неизменным на протяжении всего сбора данных (рис. 7).
  4. Обрабатывайте спектры с использованием соответствующих функций аподизации для получения максимального разрешения с минимальными потерями мощности сигнала, добавляя нулевое заполнение в размерности t1.
    1. Далее корректируем базовую линию в размерности F2, а затем F1 с помощью квадратичной полиномиальной функции.
    2. Тщательно откалибруйте химический сдвиг спектров в соответствии с остаточными значениями воды или пиками ДМСО в соответствующих растворителях в соответствии с их отклонением от известных стандартов (TMSP или TMS соответственно).

3. Присвоение пиков и интеграция с помощью SPARKY20

  1. Подготовьте набор спектров COSY и TOCSY, наложенных на спектр NOESY или ROESY (рисунок 8).
  2. Назначьте все пики NOE в спектре в соответствии с методологией последовательного распределения, разработанной Wüthrich21.
    1. Начните с назначения пиков, которые перекрывают сигналы TOCSY в области отпечатка пальца, так как это облегчит последующее назначение пиков с помощью программы SPARKY (рис. 9). Зарегистрируйте присвоение химического сдвига (Рисунок 10) и значения 3 ДжHNHα (Рисунок 11).
  3. Переводите пики в ограничения по расстоянию, а значения 3 JHNHα — в двугранные углы.
    1. Это может быть сделано путем интегрирования пиков из программы и перевода их в ограничения по расстоянию с использованием взаимодействия известного расстояния (например, расстояние между двумя протонами метиленовой группы или атомами ароматического водорода ароматической аминокислоты).
    2. Если пики накладываются друг на друга, а методы интегрирования не могут быть использованы, они могут быть помечены как сильные-средние-слабые-очень слабые с помощью визуальной оценки, и эти обозначения могут быть переведены в расстояния до 2,5, 3,5, 4,5 и 5,5 Å соответственно. Это позволит быть наиболее эффективным в работе с пептидами.
    3. Значения 3JHNHα являются индикативными для двугранных углов в соответствии с уравнением Карплюса, где большинство заданных значений связи могут быть результатом более чем одного двугранного угла. Они могут указывать на вторичную структуру (спирали или листы), случайную спираль или ее конформационные усреднения. Поэтому важно осторожно использовать ограничения или использовать их в качестве подтверждения конформационных результатов.

4. Расчеты молекулярной механики для создания структурного ансамбля с использованием XPLOR22

  1. Импортируйте ограничения расстояний и двугранные углы в правильном формате для XPLOR. (Рисунок 12, только взаимные ограничения). XPLOR будет искать в конформационном пространстве структуры, которые соответствуют каноническим геометрическим химическим ограничениям, таким как длина связи, углы, хиральность и т. д., в дополнение к экспериментально найденным ограничениям расстояния, чтобы создать ансамбль, в котором ни один из вышеуказанных параметров не нарушается. Это и составит стартовый ансамбль.
  2. Первый прогон определения конструкции будет выполнен без использования каких-либо ограничений к металлу. Это позволит без какой-либо предвзятости показать, какие остатки участвуют в связывании металла. Перейдите к шагу 4.4.
  3. В дополнение к ограничениям расстояний, полученным с помощью ЯМР, добавьте к определенным остаткам ограничения связывания металлов.
    1. Добавьте соответствующие параметры для описания иона металла и его топологии.
    2. Соответствующая физическая информация (масса, длина связи с другими атомами, углы и параметры отталкивания без связи) должна быть помещена в файл параметров.
    3. Добавьте в файл топологии информацию о привязке: какие связи образуются и разрываются, а также какие формальные платежи изменяются в результате привязки.
  4. Создайте небольшой ансамбль обычно из 10 человек.
    1. Вводите ограничения постепенно, начиная с взаимодействий между основными цепями, затем между цепочками и сайдчейнами, затем с сайдчейнами и переходя от последовательных взаимодействий внутри остаточных к более дальним взаимодействиям. Это облегчает выявление ошибок при назначении.
    2. Представьте энергию NOE в виде потенциала квадратной ямы с постоянной силой 50 ккал/моль•Å2. Имитационный отжиг должен быть выполнен с 1500 шагами по 3 фс при 1500 К и 3000 шагами по 1 фс при охлаждении до 500 К. Наконец, минимизируйте структуры с помощью минимизации энергии сопряженного градиента в течение 4000 итераций; это переменные, которые могут быть изменены в XPLOR.
  5. Создайте окончательный ансамбль обычно из 50 участников. Выполните шаги из шага 4.4 на всем ансамбле.
    1. Сообщите количество обнаруженных типов взаимодействия NOE, как показано на рисунке 13.
  6. Создание ансамбля структур, которые придерживаются канонической химической геометрии и ограничений, полученных эмпирическим методом ЯМР.
    1. Сообщите общее количество конформаций, количество конформаций, которые имеют нарушения ограничений, полученных из ЯМР, и RMSD всего ансамбля, как магистрального, так и всех значений RMSD тяжелых атомов.

5. Структурный анализ

  1. Решенный ансамбль представляет собой конформационное пространство, занятое пептидом во время измерения ЯМР. Локальная гибкость может изменяться в различных областях молекулы, и это может быть приписано структурным или функциональным причинам (цель структурного анализа состоит в том, чтобы определить структурную основу стабильности и механизма действия).
    1. Импортируйте все соответствия структуры в программу MolMol23 для создания начального ансамбля (рисунок 14).
  2. Исследуйте ансамбль, чтобы определить локальную стабильность молекулы.
    1. Определите значения RMSD основной цепи и сайдчейна, выбрав последовательные области с четырьмя остатками вдоль последовательности и поручив программе рассчитать RMSD до самой низкой энергетической структуры или среднего значения.
    2. Определите, какие области молекулы демонстрируют локальную стабильность (рис. 15), построив график локального среднеквадратичного значения как функции последовательности.
    3. Наложите ансамбль вдоль этой области молекулы и используйте этот ансамбль для дальнейшего анализа (рис. 16).
  3. Выбирайте конформации с низким энергопотреблением, которые соответствуют ограничениям, полученным от ЯМР (не нарушаются). Они образуют «низкоэнергетический ансамбль».
    1. Сообщите о количестве концентраций в ансамбле, критериях их выбора и значениях RMSD, определенных на шаге 4.6.1.
    2. Если режим привязки металла уже определен, переходите к следующему шагу. В противном случае: Проанализируйте ансамбль с низким энергопотреблением и определите, какие сайдчейны остатков находятся в правильной близости друг от друга, чтобы иметь возможность связывать ион металла. После того, как они будут определены, вернитесь к шагу 3.3 и повторите анализ, включая данные о связывании меди (Рисунок 17 для ансамбля и Рисунок 18 для конформера с низким энергопотреблением).
  4. Исследуйте ансамбль и определите локальную вторичную структуру внутри молекулы, используя стандартные параметры поиска программы MolMol. Вторичные структуры удерживаются водородными связями и указывают на стабильные участки молекулы.
    1. Определите вторичную структуру каждого конформера (рисунок 19).
      1. Создайте таблицу процентного соотношения конформеров ансамбля, которые показывают каждую второстепенную структуру.
      2. Определите, перекрывают ли области вторичной структуры регионы, которые были определены как стабильные регионы с помощью локального RMSD. Так бывает часто.
  5. Определите расстояния и водородные связи внутри молекулы.
    1. Импортируйте ансамбль в Chimera24.
    2. Используйте Chimera для определения внутримолекулярных расстояний между атомами, подозреваемыми в связывании металлов. Рассчитайте средние расстояния в ансамбле.
    3. Используйте Chimera для определения внутримолекулярных водородных связей в каждом конформере ансамбля (рис. 20), используя стандартные параметры ослабления водородных связей (на 20%) программы.
    4. Создайте таблицу процентного соотношения конформеров ансамбля, которые показывают каждую водородную связь. Водородные связи, которые повторяются в большинстве конформаций, указывают на стабильную связь, которая повышает стабильность структуры.
  6. Определение электростатических взаимодействий внутри молекулы.
    1. Выявляйте взаимодействия между заряженными сайдчейнами.
    2. Составьте таблицу процентного соотношения конформеров ансамбля, которые показывают каждое электростатическое взаимодействие.
  7. Рассчитайте распределение электростатического потенциала с помощью силового поля Amber25 в программе Delphi26.
    1. Выберите одну репрезентативную конформацию из ансамбля, для которого будут выполнены расчеты электростатического потенциала.
    2. Получение электростатического потенциала с помощью уравнения Пуассона-Больцмана и полного кулоновского расчета. К обязательным параметрам относятся ионная сила раствора, диэлектрические значения раствора (80 для воды; 40 для ДМСО); внутренний пептид (обычно около 5,0); размер сетки (обычно 65'65'65 пунктов); и минимальное расстояние между пептидом и краем сетки (10 Å). Результаты обычно довольно надежны по отношению к этим значениям, поскольку основной результат определяется самим пептидом (рис. 21).
    3. Исследуйте электростатический потенциал, отображенный на ван-дер-ваальсовой поверхности пептида (рис. 22).
    4. Исследуйте изоповерхности электростатических потенциалов, которые описывают положения с одинаковым потенциалом. Найдите изоповерхности, которые указывают на биологическую значимость, такие как протяженные положительные или отрицательные поверхности, которые могут притягивать или отталкивать другие белки или лиганды, или распределения, указывающие на значимость, такие как амфипатическое распределение или участки с различными свойствами (рис. 23).
  8. Суммируйте все структурные находки, чтобы увидеть, как они усиливают друг друга.
  9. При необходимости повторите шаги 4.3-5.7.4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В рамках продолжающегося исследования моделей медьсвязывающих белков структура консервативной последовательности MT/HCXXC в линейном пептиде MTCSGCSRPG была определена с помощью ЯМР состояния раствора. Пептид вступал в реакцию с CuCl в инертной среде, а pH измеряли как ~3,0 с помощью универсально...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вклад структурной информации в понимание механизмов связывания хорошо признан. Пептиды полезны в качестве моделей связывания и взаимодействия с белками; однако они не поддаются основному методу определения структуры – рентгеновской кристаллографии. ЯМР особенно полезен для этих си?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Программу Human Frontier Science (грант для молодых исследователей (RGY) 0068-2006) за финансовую поддержку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Avance DMX 600 МГц СпектрометрBruker
ЯМР пробирки для образцов Wilmad535-PP
Перчаточный ящикMBraunLM05-019
Лиофилизатор   VirTisнастольный
пептидBioChemiaИзготовленный на заказ>95% чистота
Хлорид меди (1)Олдрич224332
Соляная кислотаBioLab231-595-7
Гидроксид натрияГадот1310-73-2
d6-диметилсульфоксидAldrich236926
Оксид дейтерияОлдрич151882

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robinson, J. A. Protein epitope mimetics as anti-infectives. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).
  2. Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).
  3. Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. Trace elements in human physiology and pathology. Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).
  4. Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. Structural Biology of Copper Trafficking. Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).
  5. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).
  6. Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins. Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).
  7. Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA. Biochem. J. 424, 347-356 (2009).
  8. Hearnshaw, S., et al. A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ. Biochem. 48, 9324-9326 (2009).
  9. Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies. Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).
  10. Shoshan, M. S., et al. NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine. Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).
  11. Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change. J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).
  12. Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics. Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).
  13. Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin (2013).
  14. Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. 2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).
  15. Bax, A., Davis, D. G. MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy. J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).
  16. Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).
  17. Bax, A., Davis, D. G. Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy. J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).
  18. Williamson, M. P. Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology. Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).
  19. Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions. J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).
  20. Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky (2008).
  21. Wüthrich, K. NMR of proteins and nucleic acids. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).
  22. Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. Comp. aspects study biol. macromol. by NMR. , Plenum Press. (1991).
  23. Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures. J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).
  24. Pettersen, E. F., et al. UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).
  25. Pearlmen, D. A., et al. AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules. Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).
  26. Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications. J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

I1D 2D 1H

Related Articles