Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Определена структура ЯМР-раствора модельного пептида металлохаперона с Cu (I) и описан подробный протокол от пробоподготовки и сбора 1D и 2D данных до трехмерной структуры.

Abstract

Связывание меди (I) транспортными белками металлохаперона предотвращает окисление меди и высвобождение токсичных ионов, которые могут участвовать во вредных окислительно-восстановительных реакциях. Комплекс Cu(I) пептидной модели Cu(I)-связывающего белка металлохаперона, включающего последовательность MTCSGCSRPG (подчеркнуто сохранено), определяли в растворе в инертных условиях методом ЯМР-спектроскопии.

ЯМР является широко признанным методом определения структур растворов белков и пептидов. Из-за трудностей кристаллизации с получением монокристаллов, пригодных для рентгеновской кристаллографии, метод ЯМР чрезвычайно ценен, особенно потому, что он предоставляет информацию о состоянии раствора, а не о твердом состоянии. В данной статье мы описываем все этапы, необходимые для полного определения трехмерной структуры с помощью ЯМР. Протокол включает в себя подготовку образцов в ЯМР-пробирке, сбор и обработку 1D и 2D данных, присвоение и интегрирование пиков, расчеты молекулярной механики и структурный анализ. Важно отметить, что анализ сначала проводился без каких-либо предустановленных связей металл-лиганд, чтобы обеспечить надежное определение структуры несмещенным образом.

Introduction

Пептиды широко используются в качестве белковых моделей, потенциальных лекарственных препаратов и терапевтических агентов сами по себе. Однако их малые размеры и высокая степень гибкости часто не позволяют определить структуру с помощью рентгеновского излучения из-за трудностей кристаллизации.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) может быть использован для определения пептидных структур и взаимодействий. Метод может дать информацию о локальной и общей структуре, связывании и взаимодействиях с более низким сродством, и он применим к сложным образцам, поскольку это может быть сделано в состоянии раствора.

Транспорт меди в биологических системах достигается за счет внутриклеточных белков металлохаперона меди, которые специфически связывают ионы Cu (I) и доставляют их к своим белкам-мишеням через серию белок-белковых взаимодействий, чтобы защитить ионы от окисления и предотвратить высвобождение токсичной меди^2-5. Сайт связывания характеризуется консервативной последовательностью MXH/TCXanyXanyC, которая, как было показано как ЯМР, так и кристаллография, связывает Cu (I) мягкими тиолатолигандами двух остатков цистеина, хотя также был предложен дополнительный внешний лиганд^6-8. Структурно-функциональная связь этих белков была предметом интенсивных исследований⁹.

В представленном здесь исследовании пептидная модель, включающая консервативную последовательность металлохаперонов меди, была синтезирована и ререагировала с Cu (I) в инертной среде. Представленный протокол описывает этапы определения структуры методом ЯМР, включая подготовку образцов, сбор данных, обработку данных, построение структуры и структурный анализ. Анализ проводился в два этапа: сначала были созданы структуры, не имевшие информации о способе связывания пептида с ионом меди. После того, как режим привязки был установлен эмпирически, эти ограничения были введены для обеспечения структуры с высоким разрешением. Способ привязки является существенным моментом в модели и, таким образом, был определен беспристрастным образом.

Определение структуры модельных пептидов методом ЯМР является чрезвычайно ценным методом, который часто используется химиками и биологами. Он может быть относительно легко применен к различным пептидам в различных условиях и, таким образом, может пролить свет на^{соответствующие механизмы}. Понимание процесса прояснения структуры позволяет лучше понять сильные и слабые стороны предлагаемых структур.

Protocol

1. Подготовка образцов

1. Апо-образец: Растворить примерно 1-2 мг пептида в 450-500 мкл дейтерированного растворителя класса ЯМР (предпочтительными растворами для биологических образцов являются 10% D2O в воде или d6-DMSO ^11-12, если образец не растворяется в воде или вступает с ней в реакцию
).
2. Образец, прореагировавший на медь: Растворите примерно 1-2 мг пептида с эквимолярным количеством металлической соли в 450-500 μл растворителя ЯМР.
3. Отфильтруйте раствор с помощью агломерационного стекла, фильтровальной бумаги или любой другой техники, которая подходит исследуемым соединениям и не адсорбирует их. Это необходимо для удаления любых металлических частиц, которые могут повлиять на однородность.
4. Переложите раствор в ЯМР-трубку и закройте ее. Убедитесь, что качество трубки соответствует силе используемого магнита (подробнее см. таблицу оборудования).
5. Если образец чувствителен к кислороду, эти действия необходимо выполнять в инертной среде и герметизировать пробирку для предотвращения окисления.

2. Сбор и обработка данных ЯМР¹³

1. Запишите 1D ¹H спектры образцов, прореагировавших апо- и медью, и сравните. Спектр медьсодержащих пептидов должен показать значительное изменение химического сдвига в области амида, и пики исчезли, так как апопептид является гибким и имеет среднее количество конформаций, но при взаимодействии с медью амиды связанного пептида имеют единую структуру (рис. 2).
   1. Если спектр не изменился, то предполагается, что реакция не прошла.
   2. Если образец станет зеленым, медь окислится в атмосфере, что может изменить ее связующие свойства.
   3. В обоих этих случаях образец нужно будет переделать.
2. Найдите оптимальные температурные условия для измерений ЯМР, которые обеспечивают минимальное перекрытие остатков амида с узкой шириной линий.
3. Поставьте эксперименты COSY¹⁴, TOCSY¹⁵ и NOESY¹⁶ или ROESY¹⁷ NMR в идентичных условиях (температура, pH и т. д.) и выполняйте их последовательно.
   1. Эксперименты COSY (рис. 3) и TOCSY (рис. 4) обнаружат сквозные взаимодействия соседних и дальних соседних протон-протонных взаимодействий соответственно. Спектр COSY дает информацию о корреляциях HN-Hα, в то время как спектр TOCSY дает, кроме того, информацию о HN и других алифатических протонах коррелированных остатков.
   2. Эксперименты NOESY и ROESY (рис. 5) обнаруживают пространственную близость без зависимости от связей для получения структурной информации. Выбор между ними осуществляется в зависимости от эффективного размера соединения и напряженности поля. Некоторые из таких комбинаций дают теоретические нулевые сигналы (рис. 6), и для обнаружения взаимодействий NOE^10,18 необходимо провести эксперимент ROESY.
   3. Если образец находится в воде, то в экспериментах должен быть компонент подавления воды. Наиболее эффективно это достигается с помощью градиентов¹⁹. В этом случае целесообразно повторно запустить образец после назначения в чистом D₂O для получения взаимодействий с водородами Hα и между ними.
   4. Оптимизируйте продолжительность микширования TOCSY и NOESY или ROESY, проведя ряд коротких экспериментов для поиска максимального нарастания сигнала с минимальными потерями на спиновую диффузию. Убедитесь, что это линейная область кривой наращивания. Значения, общие для пептидов в полях 600 МГц, включают время смешивания около 100 мс для экспериментов TOCSY и 150 мс для экспериментов NOESY или ROESY.
   5. Проводите одномерные эксперименты между каждым экспериментом, чтобы убедиться, что состав образца остается неизменным на протяжении всего сбора данных (рис. 7).
4. Обрабатывайте спектры с использованием соответствующих функций аподизации для получения максимального разрешения с минимальными потерями мощности сигнала, добавляя нулевое заполнение в размерности t1.
   1. Далее корректируем базовую линию в размерности F2, а затем F1 с помощью квадратичной полиномиальной функции.
   2. Тщательно откалибруйте химический сдвиг спектров в соответствии с остаточными значениями воды или пиками ДМСО в соответствующих растворителях в соответствии с их отклонением от известных стандартов (TMSP или TMS соответственно).

3. Присвоение пиков и интеграция с помощью SPARKY²⁰

1. Подготовьте набор спектров COSY и TOCSY, наложенных на спектр NOESY или ROESY (рисунок 8).
2. Назначьте все пики NOE в спектре в соответствии с методологией последовательного распределения, разработанной Wüthrich²¹.
   1. Начните с назначения пиков, которые перекрывают сигналы TOCSY в области отпечатка пальца, так как это облегчит последующее назначение пиков с помощью программы SPARKY (рис. 9). Зарегистрируйте присвоение химического сдвига (Рисунок 10) и ^{значения} 3 ДжHNHα (Рисунок 11).
3. Переводите пики в ограничения по расстоянию, а значения 3 JHNHα — в двугранные углы.
   1. Это может быть сделано путем интегрирования пиков из программы и перевода их в ограничения по расстоянию с использованием взаимодействия известного расстояния (например, расстояние между двумя протонами метиленовой группы или атомами ароматического водорода ароматической аминокислоты).
   2. Если пики накладываются друг на друга, а методы интегрирования не могут быть использованы, они могут быть помечены как сильные-средние-слабые-очень слабые с помощью визуальной оценки, и эти обозначения могут быть переведены в расстояния до 2,5, 3,5, 4,5 и 5,5 Å соответственно. Это позволит быть наиболее эффективным в работе с пептидами.
   3. ^{Значения 3}JHNHα являются индикативными для двугранных углов в соответствии с уравнением Карплюса, где большинство заданных значений связи могут быть результатом более чем одного двугранного угла. Они могут указывать на вторичную структуру (спирали или листы), случайную спираль или ее конформационные усреднения. Поэтому важно осторожно использовать ограничения или использовать их в качестве подтверждения конформационных результатов.

4. Расчеты молекулярной механики для создания структурного ансамбля с использованием XPLOR22

1. Импортируйте ограничения расстояний и двугранные углы в правильном формате для XPLOR. (Рисунок 12, только взаимные ограничения). XPLOR будет искать в конформационном пространстве структуры, которые соответствуют каноническим геометрическим химическим ограничениям, таким как длина связи, углы, хиральность и т. д., в дополнение к экспериментально найденным ограничениям расстояния, чтобы создать ансамбль, в котором ни один из вышеуказанных параметров не нарушается. Это и составит стартовый ансамбль.
2. Первый прогон определения конструкции будет выполнен без использования каких-либо ограничений к металлу. Это позволит без какой-либо предвзятости показать, какие остатки участвуют в связывании металла. Перейдите к шагу 4.4.
3. В дополнение к ограничениям расстояний, полученным с помощью ЯМР, добавьте к определенным остаткам ограничения связывания металлов.
   1. Добавьте соответствующие параметры для описания иона металла и его топологии.
   2. Соответствующая физическая информация (масса, длина связи с другими атомами, углы и параметры отталкивания без связи) должна быть помещена в файл параметров.
   3. Добавьте в файл топологии информацию о привязке: какие связи образуются и разрываются, а также какие формальные платежи изменяются в результате привязки.
4. Создайте небольшой ансамбль обычно из 10 человек.
   1. Вводите ограничения постепенно, начиная с взаимодействий между основными цепями, затем между цепочками и сайдчейнами, затем с сайдчейнами и переходя от последовательных взаимодействий внутри остаточных к более дальним взаимодействиям. Это облегчает выявление ошибок при назначении.
   2. Представьте энергию NOE в виде потенциала квадратной ямы с постоянной силой 50 ккал/моль•^Å2. Имитационный отжиг должен быть выполнен с 1500 шагами по 3 фс при 1500 К и 3000 шагами по 1 фс при охлаждении до 500 К. Наконец, минимизируйте структуры с помощью минимизации энергии сопряженного градиента в течение 4000 итераций; это переменные, которые могут быть изменены в XPLOR.
5. Создайте окончательный ансамбль обычно из 50 участников. Выполните шаги из шага 4.4 на всем ансамбле.
   1. Сообщите количество обнаруженных типов взаимодействия NOE, как показано на рисунке 13.
6. Создание ансамбля структур, которые придерживаются канонической химической геометрии и ограничений, полученных эмпирическим методом ЯМР.
   1. Сообщите общее количество конформаций, количество конформаций, которые имеют нарушения ограничений, полученных из ЯМР, и RMSD всего ансамбля, как магистрального, так и всех значений RMSD тяжелых атомов.

5. Структурный анализ

1. Решенный ансамбль представляет собой конформационное пространство, занятое пептидом во время измерения ЯМР. Локальная гибкость может изменяться в различных областях молекулы, и это может быть приписано структурным или функциональным причинам (цель структурного анализа состоит в том, чтобы определить структурную основу стабильности и механизма действия).
   1. Импортируйте все соответствия структуры в программу MolMol23 для создания начального ансамбля (рисунок 14).
2. Исследуйте ансамбль, чтобы определить локальную стабильность молекулы.
   1. Определите значения RMSD основной цепи и сайдчейна, выбрав последовательные области с четырьмя остатками вдоль последовательности и поручив программе рассчитать RMSD до самой низкой энергетической структуры или среднего значения.
   2. Определите, какие области молекулы демонстрируют локальную стабильность (рис. 15), построив график локального среднеквадратичного значения как функции последовательности.
   3. Наложите ансамбль вдоль этой области молекулы и используйте этот ансамбль для дальнейшего анализа (рис. 16).
3. Выбирайте конформации с низким энергопотреблением, которые соответствуют ограничениям, полученным от ЯМР (не нарушаются). Они образуют «низкоэнергетический ансамбль».
   1. Сообщите о количестве концентраций в ансамбле, критериях их выбора и значениях RMSD, определенных на шаге 4.6.1.
   2. Если режим привязки металла уже определен, переходите к следующему шагу. В противном случае: Проанализируйте ансамбль с низким энергопотреблением и определите, какие сайдчейны остатков находятся в правильной близости друг от друга, чтобы иметь возможность связывать ион металла. После того, как они будут определены, вернитесь к шагу 3.3 и повторите анализ, включая данные о связывании меди (Рисунок 17 для ансамбля и Рисунок 18 для конформера с низким энергопотреблением).
4. Исследуйте ансамбль и определите локальную вторичную структуру внутри молекулы, используя стандартные параметры поиска программы MolMol. Вторичные структуры удерживаются водородными связями и указывают на стабильные участки молекулы.
   1. Определите вторичную структуру каждого конформера (рисунок 19).
      1. Создайте таблицу процентного соотношения конформеров ансамбля, которые показывают каждую второстепенную структуру.
      2. Определите, перекрывают ли области вторичной структуры регионы, которые были определены как стабильные регионы с помощью локального RMSD. Так бывает часто.
5. Определите расстояния и водородные связи внутри молекулы.
   1. Импортируйте ансамбль в Chimera²⁴.
   2. Используйте Chimera для определения внутримолекулярных расстояний между атомами, подозреваемыми в связывании металлов. Рассчитайте средние расстояния в ансамбле.
   3. Используйте Chimera для определения внутримолекулярных водородных связей в каждом конформере ансамбля (рис. 20), используя стандартные параметры ослабления водородных связей (на 20%) программы.
   4. Создайте таблицу процентного соотношения конформеров ансамбля, которые показывают каждую водородную связь. Водородные связи, которые повторяются в большинстве конформаций, указывают на стабильную связь, которая повышает стабильность структуры.
6. Определение электростатических взаимодействий внутри молекулы.
   1. Выявляйте взаимодействия между заряженными сайдчейнами.
   2. Составьте таблицу процентного соотношения конформеров ансамбля, которые показывают каждое электростатическое взаимодействие.
7. Рассчитайте распределение электростатического потенциала с помощью силового поля Amber²⁵ в программе Delphi²⁶.
   1. Выберите одну репрезентативную конформацию из ансамбля, для которого будут выполнены расчеты электростатического потенциала.
   2. Получение электростатического потенциала с помощью уравнения Пуассона-Больцмана и полного кулоновского расчета. К обязательным параметрам относятся ионная сила раствора, диэлектрические значения раствора (80 для воды; 40 для ДМСО); внутренний пептид (обычно около 5,0); размер сетки (обычно 65’65’65 пунктов); и минимальное расстояние между пептидом и краем сетки (10 Å). Результаты обычно довольно надежны по отношению к этим значениям, поскольку основной результат определяется самим пептидом (рис. 21).
   3. Исследуйте электростатический потенциал, отображенный на ван-дер-ваальсовой поверхности пептида (рис. 22).
   4. Исследуйте изоповерхности электростатических потенциалов, которые описывают положения с одинаковым потенциалом. Найдите изоповерхности, которые указывают на биологическую значимость, такие как протяженные положительные или отрицательные поверхности, которые могут притягивать или отталкивать другие белки или лиганды, или распределения, указывающие на значимость, такие как амфипатическое распределение или участки с различными свойствами (рис. 23).
8. Суммируйте все структурные находки, чтобы увидеть, как они усиливают друг друга.
9. При необходимости повторите шаги 4.3-5.7.4.

Representative Results

Discussion

The contribution of structural information to understand binding mechanisms is well-accepted. Peptides are useful as models for protein binding and interactions; however they are not amenable to the main method for structure determination, X-ray crystallography. NMR is particularly useful for these systems, since the structures can be readily solved in solution. This is especially for the case of metallochaperone-mimetics that additionally require structure determination under an inert environment to prevent oxidation of the metal ion.

The MTCSGCSRPG peptide, containing the conserved MT/HCXXC motif, bound Cu (I) as was evident by the significant change of spectrum from the apo-form to the peptide reacted with copper. The need for a ROESY experiment at the field of 600 MHz, due to a spectrum with null interactions in the NOESY spectrum, indicates a compact peptide, since our experience shows that smaller peptides of 6-7 residues fall in the null signal of the NOESY regime, but peptides of this size usually give adequate signal. In the ROESY spectrum 81 cross-peaks were observed, N of these were inter-residue cross-peaks and (81-N) were intra-residue cross-peaks. This is a small number of peaks compared to proteins, but is expected in small peptides; Particularly cyclic peptides, which tend to give a small number of interactions since all the sidechains point outward and undergo little interaction with one another.

As the metal itself cannot be detected directly by the ¹H NMR measurements, one must conclude on the metal binding residues from the distances obtained between suspected donor atoms. To assure a reliable structure, no metal-ligand binding constraints should be added to the initial calculations. Previous studies have shown that forcing metal binding in an incorrect form may still lead to reasonable structural factors even if the structure is incorrect¹⁰.

The experiments gave highly nonviolated conformations in an ensemble of low RMSD. The low RMSD of a potentially flexible peptide lends further support for copper binding, which would reduce the conformational flexibility of the molecule. The RMSD values of the binding region were reduced to values around 0.05 Å, which shows tremendous stabilization as expected by the ring closure. The secondary bend and hydrogen-bonding found in the 3-7 region, also indicated binding in this region.

The negative charge obtained when two thiols bind the copper (I) peptide is offset by the N-terminal amine that was held proximate to the bound copper.

When inspecting the resulting distances between potential donor atoms, including the two cysteine residues and the methionine group, the ones located at positions most probable to bind metal were the sidechains of Cys3 and Cys6. Therefore, binding constraints were added between these residues and the metal center, and the resulting structure was evaluated. To further support the resulting structure, various additional control measurements that include preset bonds to other residues may be performed and the structural factors compared. This is especially important where the result of the model is unexpected. In previous studies using similar measurements using protein-mimetic peptides, unusual binding modes were observed, including methionine instead of cysteine⁷.

Excess copper is toxic to biological systems and copper transport is very tightly controlled. Therefore, it is interesting and mechanistically important to understand how copper is transferred from one protein to another. The transport cannot depend on simple release and acquire mechanism, but must somehow include both stronger and weaker modes of binding, much like how one would transfer an object carefully from the fingers of one hand to another. This type of study provides much information regarding the mechanism of copper binding in biological systems and can be used to further investigate many different aspects of metallochaperone activity in nature. The systems may be easily mutated and manipulated to mimic many different aspects of copper-binding in nature, and may be analyzed without using prior assumptions of the binding mode.

Materials

Avance DMX 600 MHz Spectrometer	Bruker
NMR sample tubes 	Wilmad	535-PP
Glove box	MBraun	LM05-019
Lyophilizer  	VirTis	benchtopK
Peptide	BioChemia	Custom made	>95% purity
Copper (1) chloride	Aldrich	224332
Hydrochloric acid	BioLab	231-595-7
Sodium hydroxide	Gadot	1310-73-2
d<sub>6</sub>-Dimethylsulfoxide	Aldrich	236926
Deuterium oxide	Aldrich	151882