Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

34.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50765

⸱

26 сентября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Cell Science, The University of Florida

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

С эффекторных функций, отличных от других клеточных подмножеств Т, клетки Th17 были централизованно вовлечен в воспалительный аутоиммунными. Это пробирке протокол в Th17 дифференциация предоставляет средства для определения, является ли наивные CD4 + Т-лимфоциты могут дифференцироваться в клеток Th17, и для дальнейшего изучения их роли в аутоиммунных и ответа хозяина.

Аннотация

Th17 клетки особым подмножество Т-клеток, как было обнаружено, продуцируют интерлейкин 17 (IL-17), и отличаются в зависимости от других клеточных подмножеств т с Th1, Th2 и регуляторных Т-клеток. Клетки Th17 появились в качестве центрального виновника в переусердствовать воспалительных иммунных реакций, связанных с многих аутоиммунных расстройств. В этом методе мы очистить Т-лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов мышей C57BL / 6, а также стимулировать очищенные CD4 + Т-клеток под контролем и Th17-индуцирующих средах. Th17-индуцирующей среда включает в себя стимуляцию в присутствии анти-CD3 и анти-CD28 антителами, IL-6 и TGF-β. После инкубации в течение по крайней мере 72 часов и на срок до пяти дней при 37 ° С, клетки затем анализировали на способность производить IL-17 через проточной цитометрии, КПЦР и ИФА. Th17 дифференцированными CD4 + CD25-Т-клетки могут быть использованы для дальнейшего выяснения роли, что Th17-клетки играют в возникновении и прогрессировании аутоиммунных и принимающей деFense. Кроме того, Th17 дифференциация CD4 + CD25-лимфоцитов из различных моделей мышей нокаутом / болезни может способствовать нашему пониманию клеточных судеб пластичности.

Введение

CD4 + Т-лимфоциты (Т-клетки) играют важнейшую роль в иммунной системы опосредованного защиты от инфекционных микроорганизмов. С другой стороны, Т-клетки также тесно связана с наступлением и развитием аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа 1, системная красная волчанка и ревматоидный артрит. CD4 + Т-лимфоциты активируются путем сочетания Т-клеточного рецептора (TCR) взаимодействия с антигеном / главного комплекса гистосовместимости II (MHCII) молекул, а также взаимодействия рецепторов CD28 с B7.1/B7.2 лигандами 15. В дополнение к предоставлению TCR стимуляции и CD28 совместной стимуляции, антиген-представляющих клеток также обеспечивают цитокинов среды, которая определяет дифференциации состояние Т-лимфоцит, тем самым направляя реакцию Т-лимфоцитов в к данному антигену. Отдельное патоген / антиген-представляющих клеток взаимодействия создают различных средах цитокинов, которые исказить Т-лимфоцитов вниз различные пути, направленные на Элиной подсветкой инициирующего патогена. К сожалению, T-лимфоцитов эффекторные пути, первоначально направленные на искоренение вторжение болезнетворных микроорганизмов, может быть ошибочно направлена ​​против самостоятельной тканей 15. Таким образом, более глубокое понимание состояния дифференцировки каждого отдельного CD4 + Т-клеток подмножество имеет решающее значение для нашего понимания того, как модулировать баланс между уничтожения патогенных и терпимости к себе.

В дополнение к Th1, Th2, и индуцируемой клеточной дифференцировки путей регуляторных Т, наивные Т-лимфоциты также может приводиться в действие цитокинов вниз по пути Th17. В то время как Th1 клеток боевых внутриклеточных патогенов, Th2 клетки устранить внеклеточных патогенов, и регуляторные Т-клетки (Tregs) минимизировать воспалительные реакции 1, 16; Th17-клетки играют важную роль в ликвидации внеклеточных бактерий и грибков. Th17 клетки обычно обозначается экспрессии специфических клонов фактора транскрипции RORγT и производства IL-17A, который способствует активации макрофагов и нейтрофилов 1, 7.

Th17 клетки были вовлечены в нескольких аутоиммунных заболеваний, а также связанные с ними модели на грызунах. Например, было продемонстрировано, что IL-23 (который необходим для поддержания фенотип Th17), но не IL-12, был центральной преступник в экспериментальном аутоиммунном энцефалите (ЭАЭ), модель болезни грызунов для MS. Это впоследствии было показано, что снижение производства IL-17 коррелирует с предотвращением EAE 2, 6, 17. Кроме того, клетки Th17 были связаны с другими аутоиммунными нарушениями, включая артрит и системная красная волчанка (СКВ) 10, 16. IL-23 дефицитных p19 - / - мышей было показано, имеют очень низкие количества клеток Th17, и устойчивы к развитию не только EAE, но и коллаген-индуцированного артрита, модели ревматоидного артрита 10, 18. Кроме того, мыши, получавшие нейтрализации IL-17A антитела кормеэ начало коллаген-индуцированного артрита были также установлено, что разрешение повреждения суставов 18. Следует отметить, что роль клеток Th17 в прогрессировании аутоиммунных заболеваний остается охарактеризовать как недавние исследования также показали защитную роль Th17-клеток в диабетом типа 1 9, 11 и воспаление кишечника 14. Эти исследования подтверждают важность Th17 дифференциации в аутоиммунными.

В пробирке дифференциации Th17 является необходимым методом в исследовании Т-клеток, потому что есть по крайней мере два трудных вопросов, которые требуют дальнейшего изучения: 1) Как именно ИЛ-6 регулируют баланс между Treg и Th17 дифференциации, и 2) каковы точные механизмы за Ил-17-индуцированной воспалительных заболеваний? Наша методика использует CD4 + CD25-Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов C57BL / 6 мыши. Важно отметить, что хотя можно индуцировать дифференцировку Th17 с помощью нечистойнаселение, приобретая по крайней мере, 80% чистого CD4 + CD25-Т-клеток населения сводит на нет любое беспокойство загрязнения и обеспечивает более успешные результаты Th17 дифференциации. Для того чтобы достичь надлежащего дифференцировку Th17, CD4 + CD25-Т-клетки инкубировали в присутствии анти-CD3 и анти-CD28, которые обеспечивают сигналы активации, 1 и 2, соответственно, и IL-6, и TGF-β. Хотя сообщалось, что IL-23 только может быть использована для достижения Th17 дифференциацию, позднее было показано, что IL-23 является необходимым для стабильности клеточной популяции Th17, но IL-6 и TGF-β имеют важное значение для дифференциации Th17 3, 18, ​​19. Мышиные исследования показали, что рецептор IL-23 экспрессируется на CD4 + Т-клеток только после их стимулировали IL-6 и TGF-β 13, 18. Кроме того, клетки Th17 будет успешно развиваться в присутствии IL-23-антитела блокируют до тех пор, IL-6 и TGF-β присутствуют 18, 19. Таким образом, этот протокол пров Th17 дифференциацияIDES соответствующие условия для успешного вызвать Th17 дифференциации. Развитие лучшего понимания механизмов, лежащих Th17 дифференциации и IL-17 производства представить возможность для разработки более совершенных терапии, направленных на аутоиммунными нарушениями 13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Любое использование животных было проведено в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по Уходу за животными и использования.

1. Приготовления смесей и СМИ

  1. Стерильная PBS рН: 7.3 (1 л)
    0,23 г NaH 2 PO 4
    1,15 г Na 2 HPO 4
    9,0 г NaCl
    Возьмите объем дистиллированной водой. Стерилизовать с автоклаве.
  2. Культура клеток Медиа (100 мл)
    89 мл RPMI
    10 мл 10% FBS
    1 мл Антибиотик Противогрибковая (ABAM) 100 мкг 50 мМ 2-меркаптоэтанола (3,5 мкг акции 2-меркаптоэтанола в 96,5 мкг PBS)
  3. СУИМ буфера (флуоресцентная Включение сортировки клеток) (будет использоваться во время проточной цитометрии) 2% FBS в стерильной PBS
  4. iTh17 Mix (На основе количества образцов, определения объема необходимой для всех смесей и средств массовой информации)
    1,5 мкг / мл анти-CD28
    20 нг / мл IL-6
    5 нг / млTGF-β

2. Клетки будут покрыл в трех экземплярах при соблюдении следующих условий

  1. Связаны анти-CD3 плиты, анти-CD28 (это управление активация смеси).
  2. iTH17: пластина связана анти-CD3, анти-CD28, ИЛ-6, TGF-β.

3. Тарелка с привязкой к анти-CD3 (10 мкг / мл)

Рекомендуется, чтобы подготовка пластин с привязкой к анти-CD3 пластин делается по крайней мере 4 ч до времени клетки будут добавлены к пластинам.

  1. Добавить 30 мкл анти-CD3 в лунки (анти-CD3 разбавляют в стерильном PBS) новой 96 и U нижней Микротест планшета для культуры ткани, и нажмите боковые стороны пластины, чтобы обеспечить равномерное покрытие лунок. Инкубировать при 37 ° С в течение 4 ч, а затем поставить в холодильник, пока не пришло время, чтобы добавить миксы и клетки к пластине.

4. Мышь Рассечение

  1. Этот протокол основан на использовании C57BL / 6 микрофономе, 3-8 месячного возраста, а также купленных у Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
  2. Жертвоприношение мышь с помощью СО 2 удушье, и подтвердите смерть с последующим смещением шейных позвонков.
  3. Стерилизовать мышей рассечение инструментов и разрез область с 70% этанола и начать вскрытие.
  4. С брюшной стороны, захватить кожу, что наступили до отверстие мочеиспускательного канала и начать не резать с ножницами до вентральной срединной линии до достижения область подбородка. Примите меры предосторожности, не следует разрезать в подкладку брюшную стенку.
  5. Отойдите назад на коже и придавить, чтобы позволить удобный доступ к лимфатических узлов во время удаления.
  6. Лимфатических узлов и селезенки, собранных все будут удалены пинцетом и помещают в стерильную чашку Петри, содержащую 5 мл рабочего буфера AutoMACS приобретены у Miltenyi Biotec (см. фиг.2 и 3 для лимфатического узла и диаграмм удаление селезенки).
    1. Удалите подмышечных лимфатических узлов, которыенайдено рядом с подмышечной впадине (подмышки) за грудными мышцами каждой мыши.
    2. Удалить плечевого лимфатические узлы, которые находятся в соединительной ткани, расположенных вблизи каждой подмышечной впадине.
    3. Удалить поверхностные шейные лимфатические узлы, найденные в шее каждой мыши.
    4. Удалите паховые лимфатические узлы, которые расположены в области бедра в сочетании из 3 кровеносных сосудов.
    5. Чтобы получить доступ к брыжеечных лимфатических узлов, прорезать в брюшную выстраиваются вентральной срединной линии. Брыжеечные лимфатические узлы находятся в соединительной ткани, которая удерживает кишечник вместе. Они обычно находятся в строке 4-8 узлов, и может появиться как "нить жемчуга". Убедитесь в том, чтобы вытащить всю строку.
    6. Селезенка находится в области живота, позади желудка и кишечника. Удалите ее, потянув и снятие его с поджелудочной железой.
  7. Измельчить органы в стерильной капот с использованием 2 заморозили микроскопа. Наведите лимфатических узлов или селезенки наматовое сбоку одного стекло микроскопа, и втирают с матовым стороне второго слайда до распалась. Повторите, пока все лимфатические узлы и селезенка не были массу.

Примечание: Рекомендуется начать с лимфатических узлов и закончить с селезенкой, как кровь будет трудно, чтобы увидеть остальные лимфатические узлы в буфере AutoMACS.

  1. Для фильтрации наземные органы в суспензии отдельных клеток, начинают путем складывания за кусок 40 мкм нейлоновый материал в несколько раз, и размещение в верхней части 15 мл центрифужную пробирку. Нейлон материал должен быть примерно 3 х 3 дюйма
  2. Используйте шприц 5 мл и 21 г иглы для аспирации 5 мл AutoMACS Бег буфера и наземные органы. Не включать медленно в сложенном материала нейлона. Позаботьтесь, чтобы избежать прокалывания материала с иглы.

Примечание: После того, как один суспензию клеток достигается, решение должно появиться в виде бледно-, последовательного решения с не visibле куски твердой ткани. Если твердые остаются, повторно аспирации и отказаться через новый сложенный лист нейлона размещены в новом 15 мл трубки центрифуги.

  1. Всегда держите клетки на льду, когда он не используется.

5. Сотовый Разделение

  1. Для получения оптимальных результатов, получить по крайней мере 80% чистого CD4 + CD25-популяции клеток через AutoMACS Cell Сепаратор Pro с помощью MACS CD4 + CD25 + регуляторных Т-изолятор комплект, мышь. Протокол для отрицательного сохранением CD4 + CD25-популяции клеток получают посредством Miltenyi Biotec.

6. Th17 Дифференциация

  1. Соберите CD4 + CD25-популяции клеток после отделения с AutoMACS Pro сотовый Сепаратор.
  2. Граф клеток развести в соотношении 1:1000 с использованием трипанового синего гемоцитометра.
  3. После того, как концентрация была определена от числа клеток, разбавленной клеточной суспензии в 1 × 10 6 клеток / мл в культуральной среде клеток.
  4. Выньте 96-луночных планшетов с пластиной связанного анти-CD3 после 4 часов.
  5. Промыть анти-CD3-лунок 200 мкл PBS. Повторите 2 раза.
    1. Для мытья добавить 200 мкл стерильной PBS, чтобы анти-CD3 покрытием скважин и удалить PBS в контейнер для отходов.
  6. Добавить 100 мкл смеси iTh17 или управления активация смеси (см. пункт № 2) в лунки в трех экземплярах.
  7. Добавьте 100 мкл клеток в каждую лунку, в которой либо смесь Th17 или управления активацией смесь была помещена.
  8. Инкубируйте клетки, по крайней мере 72 ч или до 5 дней (Th17 дифференциация может быть получен после 72 часов или через 5 дней.)
  9. Th17 дифференцирование может быть оценена путем внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии анализа, ELISA или количественной ПЦР

7. Сотовый активации (необходимо только для внутриклеточного окрашивания)

  1. Удалить 96-луночных планшетов из инкубаторов в конце либо 72 ч или 5 дней
    1. Напомним, что Th17 differentiatioн может быть достигнуто после либо 72 часов или 5 дней.
  2. Для каждого состояния (например, управления или активации iTh17), передача клетки, которые в трех экземплярах в одну лунку 24-луночного культурального планшета клеток. Клетки для одного состояния в настоящее время объединены в одну лунку 24-луночного планшета культуры, в отличие от быть в трех экземплярах на 96-луночный U нижней культурального планшета.
  3. Общий объем каждой лунки в клеточной культуральной пластины 24 а теперь 600 мкл. Поднимите объем каждой лунки по 1 мл с клеточной культуры.
  4. Добавить PMA (форболмиристатацетата) (50 нг / мл), иономицин (1 мкМ), и БФА (брефелдин-A) (10 мкг / мл) в каждую лунку в 24-луночного культурального планшета клеток в указанных концентрациях.
  5. Инкубировать при 37 ° С в течение 4 часов.

8. Внутриклеточного окрашивания

  1. Пятно клетки с нужными внеклеточных и внутриклеточных маркеров для проточной цитометрии анализа. Для обнаружения присутствия Oе IL-17, внутриклеточное окрашивание делается с анти-IL-17A антител. Рекомендуемые поверхностно внеклеточные маркеры включают CD4, CD8, и CD25.
    1. Используйте внутриклеточных окрашивание цитокинов Starter Kit-Mouse от BD Bioscience для окрашивания IL-17 внутриклеточного.
    2. Для каждого образца гранул клетки, удалить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл FACS буфера (2% FBS в PBS).
    3. Трансфер ресуспендировали клетки до 96 потока клеток цитометрии пластины.
    4. Спин клетки вниз в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту и ​​отбросить супернатант.
    5. Добавить 200 мкл буфера PBS FACS, центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту, и отбросить супернатант.
    6. Ресуспендируют клеток в 100 мкл FACS буфера и применять 100 мкл внеклеточного антитела (Ab) смесь (внеклеточный Ab смесь выполнен в FACS буфере). Инкубировать 15 мин при комнатной температуре, покрытые пленкой.
    7. Повторите шаг 8.1.4.
    8. Повторите шаг 8.1.5 2x.
    9. Ресуспендируют клеток в 100 мкл BD Cytofix / Cytoperm буфера. Incubели в течение 20 мин при комнатной температуре, покрытых пленкой.
    10. Добавить 100 мкл 1x BD Пермь / промывочного буфера, центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту, и отбросить супернатант. Повторите.
    11. Добавить 50 мкл внутриклеточного Ab смеси. (Внутриклеточный Ab смесь выполнен в 1x BD Пермь / стирка) Инкубировать 15 мин при комнатной температуре, покрытые пленкой.
    12. Повторите шаг 8.1.10.
    13. Ресуспендируют клеток в 200 мкл BD окрашивающего буфера.
    14. Поместите ресуспендировали клетки в проточной цитометрии пробирки, содержащие 200 мкл окрашивающего буфера BD (конечный объем 400 мкл).
    15. Хранить при 4 ° С до образцы не будут готовы для чтения.

9. Анализ проточной цитометрии

  1. Ворота живая клетка населения.
  2. Из живой клеточной популяции, ворота на CD4 + CD8-населения.
  3. С CD4 + CD8-населения, ворота на IL-17A + населения.
    1. На основе наших предыдущих экспериментальных результатов, 100% от IL-17A + населения будет CD25 +.

* Всего на счету абсолютные клеток были получены после объединения образцы трижды
** Абсолютное число CD4 + CD25 + IL-17A + клеток определяли путем умножения общего количества клеток в живой процент и процент от общего объема клеток, несущих происхождение конкретных маркеры, CD4, CD25 и IL-17A ворот, как определяется с помощью проточной цитометрии.

10. КПЦР и ИФА

  1. Место клетки не используются для анализа проточной цитометрии в 1,5 мл пробирку Эппендорфа и центрифуге при 13000 оборотах в минуту в течение 5-10 мин. Клетки, обнаруженные в осадок клеток после центрифугирования будет использоваться для анализа КПЦР. Анализ КПЦР проводили с использованием PTC-200 Пельтье Термоциклер (BioRad).
  2. Сбор супернатант из центрифугированных труб для ИФА. IL-17A ИФА проводили с использованием антитела пара TC11-18h10 (захват, каталожный номер 555068) и TC11-8х4 биотин (обнаружение, каталожный номер 555067), приобретенного у BD Biosciences. IL-17A ИФА станцииndards были получены из eBioscience (номер по каталогу 14-8171-80).
  3. После удаления жидкости, ресуспендируют остальные ячейки, которые будут использоваться для количественной ПЦР в 175 мкл буфера для лизиса РНК (немедленно использовать для экстракции РНК, синтез кДНК и количественной ПЦР, или хранить при температуре -80 ° С для последующего использования).
    1. Обратитесь к таблице II для последовательностей праймеров для IL-17A и актина (гена уборки)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол дифференциация Th17 начинается с удаления селезенки и подмышечных, плечевых, мезентериальных, шейки матки, и паховых лимфатических узлов. Представление из мест каждого можно найти на рисунках 2 и 3. На рисунках 1 и 5 и дают наглядное представление из методов, описанных в этом протоколе.

Этот протокол Th17 фокусируется на дифференциации от популяции лимфоцитов CD4 + CD25-T. Важно отметить, насколько эффективно Pro разделени клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали протокол для достижения в пробирке Th17 дифференциации. Изучение Th17 дифференциации важно, так как дифференциация Т-лимфоцитов в подгруппе Th17 имеет решающее значение для эффективной ликвидации человеческих патогенов 13. И наоборот, IL17 производство было связано с аутоиммунным прогрессирования заболевания 13. Способ Th17 дифференциации применимо к многих научных исследованиях как он может быть применен в многочисленных различных мышиных моделях иммунной регуляции и ауто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет раскрытия объявить.

Благодарности

Эта работа частично поддержана на NIH / NCATS клинических и трансляционных науки Awards в Университете Флориды TL1 TR000066 и UL1 TR000064, разнообразие дополнения от родителей Грант R01AI056152 из Национального института здравоохранения, гранта реагента BD Biosciences и университета Флориды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri DishFisher Scientific0875713A60 мм x 15 мм
autoMACS Running BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Предметные стекла для микроскопа премиум-класса, матовыеFisher Scientific12-544-33" x 1"1 мм
5 мл 21G1 Шприц и игла без латексаBD Biosciences309632
Corning 15 мл Центрифужные пробиркиSigma-AldrichCLS430791
нейлон 40 микронMiami AquacultureНейлон 40/26
Микротестовая тарелка для культуры тканей 96 лунок U дно BD Biosciences35-3077
Corning Costar 24 лунки клеточные культуральные планшетыSigma-AldrichCL3524
Пробирки Eppendorf 1,5 млFisher Scientific05-408-129
Очищенный NA/LE Хомяк против мыши CD3eBD Biosciences553057
Очищенный NA/LE Хомяк против мыши CD28BD Biosciences553294
мыши IL-6 рекомбинантный белокeBioscience14-8061-62
TGFbetaR& D Systems240-B-002
Трипановый синий раствор 0,4 %Sigma-Aldrich66H2364
Pac Blue Rat Антимышиный CD4BD Biosciences558107
APC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553035
PE Конъюгированный антимышиный CD25eBioscienceE01155-516
Alexa Fluor 700 Крыса Антимышиный IL-17BD Biosciences560820
Стартовый набор для окрашивания внутриклеточных цитокинов мышьюBD Biosciences51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ регуляторный набор для выделения Т-клеток, мышьMiltenyi Biotec130-091-221
ABAM Cellgro30-004-CI
RPMICorning, Cellgro10-040-CM
B 2-Mercapt– танолMP Biomedical194834опасный
форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA)
Иономицин кальциевая сольSigma-Aldrich13909-1MLопасный
брефельдин А (BFA)MP биомедицинские159027
ИФА IL-17A захват mAb BD Biosciences555068
ИФА IL-17A Обнаружение mAb BD Biosciences555067
ELISA IL-17A СтандартeBioscience14-8171-80
IL-2 Набор ИФАBD Biosciences555148
Набор субстратов TMB BD Biosciences555214
Equipment
autoMACS Pro Сепаратор ячеекMiltenyi Biotec130-092-545
Центрифуга Sorvall Legend RT+ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 ИнкубаторThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal CyclerBiorad

Ссылки

  1. Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
  2. Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
  3. El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  4. Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
  5. L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
  6. Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
  7. Kimura, A., Kishimoto, T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).
  8. Korn, T., Bettelli, E., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  9. Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
  10. Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
  11. Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
  12. Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
  13. Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
  14. O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
  15. Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
  16. Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53(2010).
  17. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).
  18. Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
  19. Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
  20. Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение лимфатических узловпрепарирование селезенкисепарация AutoMaxпроточная цитометрияанализ методом количественной ПЦРопределение методом ИФАусловия индуцирования Th17экспрессия ИЛ-17
Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.