С эффекторных функций, отличных от других клеточных подмножеств Т, клетки Th17 были централизованно вовлечен в воспалительный аутоиммунными. Это пробирке протокол в Th17 дифференциация предоставляет средства для определения, является ли наивные CD4 + Т-лимфоциты могут дифференцироваться в клеток Th17, и для дальнейшего изучения их роли в аутоиммунных и ответа хозяина.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Th17 клетки особым подмножество Т-клеток, как было обнаружено, продуцируют интерлейкин 17 (IL-17), и отличаются в зависимости от других клеточных подмножеств т с Th1, Th2 и регуляторных Т-клеток. Клетки Th17 появились в качестве центрального виновника в переусердствовать воспалительных иммунных реакций, связанных с многих аутоиммунных расстройств. В этом методе мы очистить Т-лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов мышей C57BL / 6, а также стимулировать очищенные CD4 + Т-клеток под контролем и Th17-индуцирующих средах. Th17-индуцирующей среда включает в себя стимуляцию в присутствии анти-CD3 и анти-CD28 антителами, IL-6 и TGF-β. После инкубации в течение по крайней мере 72 часов и на срок до пяти дней при 37 ° С, клетки затем анализировали на способность производить IL-17 через проточной цитометрии, КПЦР и ИФА. Th17 дифференцированными CD4 + CD25-Т-клетки могут быть использованы для дальнейшего выяснения роли, что Th17-клетки играют в возникновении и прогрессировании аутоиммунных и принимающей деFense. Кроме того, Th17 дифференциация CD4 + CD25-лимфоцитов из различных моделей мышей нокаутом / болезни может способствовать нашему пониманию клеточных судеб пластичности.
Введение
CD4 + Т-лимфоциты (Т-клетки) играют важнейшую роль в иммунной системы опосредованного защиты от инфекционных микроорганизмов. С другой стороны, Т-клетки также тесно связана с наступлением и развитием аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа 1, системная красная волчанка и ревматоидный артрит. CD4 + Т-лимфоциты активируются путем сочетания Т-клеточного рецептора (TCR) взаимодействия с антигеном / главного комплекса гистосовместимости II (MHCII) молекул, а также взаимодействия рецепторов CD28 с B7.1/B7.2 лигандами 15. В дополнение к предоставлению TCR стимуляции и CD28 совместной стимуляции, антиген-представляющих клеток также обеспечивают цитокинов с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Любое использование животных было проведено в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по Уходу за животными и использования.
1. Приготовления смесей и СМИ
- Стерильная PBS рН: 7.3 (1 л)
0,23 г NaH 2 PO 4
1,15 г Na 2 HPO 4
9,0 г NaCl
Возьмите объем дистиллированной водой. Стерилизовать с автоклаве. - Культура клеток Медиа (100 мл)
89 мл RPMI
10 мл 10% FBS
1 мл Антибиотик Противогрибковая (ABAM) 100 мкг 50 мМ 2-меркаптоэтанола (3,5 мкг акции 2-меркаптоэтанола в 96,5 мкг ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол дифференциация Th17 начинается с удаления селезенки и подмышечных, плечевых, мезентериальных, шейки матки, и паховых лимфатических узлов. Представление из мест каждого можно найти на рисунках 2 и 3. На рисунках 1 и 5 и дают наглядное представление из методов, описанных в этом протоколе.
Этот протокол Th17 фокусируется на дифференциации от популяции лимфоцитов CD4 + CD25-T. Важно отметить, насколько эффективно Pro разделени клет.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описали протокол для достижения в пробирке Th17 дифференциации. Изучение Th17 дифференциации важно, так как дифференциация Т-лимфоцитов в подгруппе Th17 имеет решающее значение для эффективной ликвидации человеческих патогенов 13. И наоборот, IL17 производство было связано с аутоиммунным прогрессирования заболевания 13. Способ Th17 дифференциации применимо к многих научных исследованиях как он может быть применен в многочисленных различных мышиных моделях иммунной регуляции и ауто.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет раскрытия объявить.
Благодарности
Эта работа частично поддержана на NIH / NCATS клинических и трансляционных науки Awards в Университете Флориды TL1 TR000066 и UL1 TR000064, разнообразие дополнения от родителей Грант R01AI056152 из Национального института здравоохранения, гранта реагента BD Biosciences и университета Флориды.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 мм x 15 мм |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Предметные стекла для микроскопа премиум-класса, матовые | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 мм |
| 5 мл 21G1 Шприц и игла без латекса | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 мл Центрифужные пробирки | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| нейлон 40 микрон | Miami Aquaculture | Нейлон 40/26 | |
| Микротестовая тарелка для культуры тканей 96 лунок U дно | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 лунки клеточные культуральные планшеты | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Пробирки Eppendorf 1,5 мл | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Очищенный NA/LE Хомяк против мыши CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Очищенный NA/LE Хомяк против мыши CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| мыши IL-6 рекомбинантный белок | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R& D Systems | 240-B-002 | |
| Трипановый синий раствор 0,4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Антимышиный CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Конъюгированный антимышиный CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Крыса Антимышиный IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Стартовый набор для окрашивания внутриклеточных цитокинов мышью | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ регуляторный набор для выделения Т-клеток, мышь | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt– танол | MP Biomedical | 194834 | опасный |
| форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) | |||
| Иономицин кальциевая соль | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | опасный |
| брефельдин А (BFA) | MP биомедицинские | 159027 | |
| ИФА IL-17A захват mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ИФА IL-17A Обнаружение mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Стандарт | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 Набор ИФА | BD Biosciences | 555148 | |
| Набор субстратов TMB | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Сепаратор ячеек | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Центрифуга Sorvall Legend RT+ | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Инкубатор | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
Ссылки
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleuk....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
