Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

CD4 + Т-лимфоциты (Т-клетки) играют важнейшую роль в иммунной системы опосредованного защиты от инфекционных микроорганизмов. С другой стороны, Т-клетки также тесно связана с наступлением и развитием аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа 1, системная красная волчанка и ревматоидный артрит. CD4 + Т-лимфоциты активируются путем сочетания Т-клеточного рецептора (TCR) взаимодействия с антигеном / главного комплекса гистосовместимости II (MHCII) молекул, а также взаимодействия рецепторов CD28 с B7.1/B7.2 лигандами ^15. В дополнение к предоставлению TCR стимуляции и CD28 совместной стимуляции, антиген-представляющих клеток также обеспечивают цитокинов среды, которая определяет дифференциации состояние Т-лимфоцит, тем самым направляя реакцию Т-лимфоцитов в к данному антигену. Отдельное патоген / антиген-представляющих клеток взаимодействия создают различных средах цитокинов, которые исказить Т-лимфоцитов вниз различные пути, направленные на Элиной подсветкой инициирующего патогена. К сожалению, T-лимфоцитов эффекторные пути, первоначально направленные на искоренение вторжение болезнетворных микроорганизмов, может быть ошибочно направлена ​​против самостоятельной тканей ^15. Таким образом, более глубокое понимание состояния дифференцировки каждого отдельного CD4 + Т-клеток подмножество имеет решающее значение для нашего понимания того, как модулировать баланс между уничтожения патогенных и терпимости к себе.

В дополнение к Th1, Th2, и индуцируемой клеточной дифференцировки путей регуляторных Т, наивные Т-лимфоциты также может приводиться в действие цитокинов вниз по пути Th17. В то время как Th1 клеток боевых внутриклеточных патогенов, Th2 клетки устранить внеклеточных патогенов, и регуляторные Т-клетки (Tregs) минимизировать воспалительные реакции ^{1, 16;} Th17-клетки играют важную роль в ликвидации внеклеточных бактерий и грибков. Th17 клетки обычно обозначается экспрессии специфических клонов фактора транскрипции RORγT и производства IL-17A, который способствует активации макрофагов и нейтрофилов ^{1, 7.}

Th17 клетки были вовлечены в нескольких аутоиммунных заболеваний, а также связанные с ними модели на грызунах. Например, было продемонстрировано, что IL-23 (который необходим для поддержания фенотип Th17), но не IL-12, был центральной преступник в экспериментальном аутоиммунном энцефалите (ЭАЭ), модель болезни грызунов для MS. Это впоследствии было показано, что снижение производства IL-17 коррелирует с предотвращением EAE ^{2, 6, 17.} Кроме того, клетки Th17 были связаны с другими аутоиммунными нарушениями, включая артрит и системная красная волчанка (СКВ) ^{10, 16.} IL-23 дефицитных p19 ^{- / -} мышей было показано, имеют очень низкие количества клеток Th17, и устойчивы к развитию не только EAE, но и коллаген-индуцированного артрита, модели ревматоидного артрита ^{10, 18.} Кроме того, мыши, получавшие нейтрализации IL-17A антитела кормеэ начало коллаген-индуцированного артрита были также установлено, что разрешение повреждения суставов ^18. Следует отметить, что роль клеток Th17 в прогрессировании аутоиммунных заболеваний остается охарактеризовать как недавние исследования также показали защитную роль Th17-клеток в диабетом типа 1 ^{9, 11} и воспаление кишечника ^14. Эти исследования подтверждают важность Th17 дифференциации в аутоиммунными.

В пробирке дифференциации Th17 является необходимым методом в исследовании Т-клеток, потому что есть по крайней мере два трудных вопросов, которые требуют дальнейшего изучения: 1) Как именно ИЛ-6 регулируют баланс между Treg и Th17 дифференциации, и 2) каковы точные механизмы за Ил-17-индуцированной воспалительных заболеваний? Наша методика использует CD4 + CD25-Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов C57BL / 6 мыши. Важно отметить, что хотя можно индуцировать дифференцировку Th17 с помощью нечистойнаселение, приобретая по крайней мере, 80% чистого CD4 + CD25-Т-клеток населения сводит на нет любое беспокойство загрязнения и обеспечивает более успешные результаты Th17 дифференциации. Для того чтобы достичь надлежащего дифференцировку Th17, CD4 + CD25-Т-клетки инкубировали в присутствии анти-CD3 и анти-CD28, которые обеспечивают сигналы активации, 1 и 2, соответственно, и IL-6, и TGF-β. Хотя сообщалось, что IL-23 только может быть использована для достижения Th17 дифференциацию, позднее было показано, что IL-23 является необходимым для стабильности клеточной популяции Th17, но IL-6 и TGF-β имеют важное значение для дифференциации Th17 ^{3, 18, ​​19.} Мышиные исследования показали, что рецептор IL-23 экспрессируется на CD4 + Т-клеток только после их стимулировали IL-6 и TGF-β ^{13, 18.} Кроме того, клетки Th17 будет успешно развиваться в присутствии IL-23-антитела блокируют до тех пор, IL-6 и TGF-β присутствуют ^{18, 19.} Таким образом, этот протокол пров Th17 дифференциацияIDES соответствующие условия для успешного вызвать Th17 дифференциации. Развитие лучшего понимания механизмов, лежащих Th17 дифференциации и IL-17 производства представить возможность для разработки более совершенных терапии, направленных на аутоиммунными нарушениями ^13.

Любое использование животных было проведено в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по Уходу за животными и использования.

1. Приготовления смесей и СМИ

1. Стерильная PBS рН: 7.3 (1 л)
   0,23 г NaH ₂ PO ₄
   1,15 г Na ₂ HPO ₄
   9,0 г NaCl
   Возьмите объем дистиллированной водой. Стерилизовать с автоклаве.
2. Культура клеток Медиа (100 мл)
   89 мл RPMI
   10 мл 10% FBS
   1 мл Антибиотик Противогрибковая (ABAM) 100 мкг 50 мМ 2-меркаптоэтанола (3,5 мкг акции 2-меркаптоэтанола в 96,5 мкг PBS)
3. СУИМ буфера (флуоресцентная Включение сортировки клеток) (будет использоваться во время проточной цитометрии) 2% FBS в стерильной PBS
4. iTh17 Mix (На основе количества образцов, определения объема необходимой для всех смесей и средств массовой информации)
   1,5 мкг / мл анти-CD28
   20 нг / мл IL-6
   5 нг / млTGF-β

2. Клетки будут покрыл в трех экземплярах при соблюдении следующих условий

1. Связаны анти-CD3 плиты, анти-CD28 (это управление активация смеси).
2. iTH17: пластина связана анти-CD3, анти-CD28, ИЛ-6, TGF-β.

3. Тарелка с привязкой к анти-CD3 (10 мкг / мл)

Рекомендуется, чтобы подготовка пластин с привязкой к анти-CD3 пластин делается по крайней мере 4 ч до времени клетки будут добавлены к пластинам.

1. Добавить 30 мкл анти-CD3 в лунки (анти-CD3 разбавляют в стерильном PBS) новой 96 и U нижней Микротест планшета для культуры ткани, и нажмите боковые стороны пластины, чтобы обеспечить равномерное покрытие лунок. Инкубировать при 37 ° С в течение 4 ч, а затем поставить в холодильник, пока не пришло время, чтобы добавить миксы и клетки к пластине.

4. Мышь Рассечение

1. Этот протокол основан на использовании C57BL / 6 микрофономе, 3-8 месячного возраста, а также купленных у Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
2. Жертвоприношение мышь с помощью СО ₂ удушье, и подтвердите смерть с последующим смещением шейных позвонков.
3. Стерилизовать мышей рассечение инструментов и разрез область с 70% этанола и начать вскрытие.
4. С брюшной стороны, захватить кожу, что наступили до отверстие мочеиспускательного канала и начать не резать с ножницами до вентральной срединной линии до достижения область подбородка. Примите меры предосторожности, не следует разрезать в подкладку брюшную стенку.
5. Отойдите назад на коже и придавить, чтобы позволить удобный доступ к лимфатических узлов во время удаления.
6. Лимфатических узлов и селезенки, собранных все будут удалены пинцетом и помещают в стерильную чашку Петри, содержащую 5 мл рабочего буфера AutoMACS приобретены у Miltenyi Biotec (см. фиг.2 и 3 для лимфатического узла и диаграмм удаление селезенки).
   1. Удалите подмышечных лимфатических узлов, которыенайдено рядом с подмышечной впадине (подмышки) за грудными мышцами каждой мыши.
   2. Удалить плечевого лимфатические узлы, которые находятся в соединительной ткани, расположенных вблизи каждой подмышечной впадине.
   3. Удалить поверхностные шейные лимфатические узлы, найденные в шее каждой мыши.
   4. Удалите паховые лимфатические узлы, которые расположены в области бедра в сочетании из 3 кровеносных сосудов.
   5. Чтобы получить доступ к брыжеечных лимфатических узлов, прорезать в брюшную выстраиваются вентральной срединной линии. Брыжеечные лимфатические узлы находятся в соединительной ткани, которая удерживает кишечник вместе. Они обычно находятся в строке 4-8 узлов, и может появиться как "нить жемчуга". Убедитесь в том, чтобы вытащить всю строку.
   6. Селезенка находится в области живота, позади желудка и кишечника. Удалите ее, потянув и снятие его с поджелудочной железой.
7. Измельчить органы в стерильной капот с использованием 2 заморозили микроскопа. Наведите лимфатических узлов или селезенки наматовое сбоку одного стекло микроскопа, и втирают с матовым стороне второго слайда до распалась. Повторите, пока все лимфатические узлы и селезенка не были массу.

Примечание: Рекомендуется начать с лимфатических узлов и закончить с селезенкой, как кровь будет трудно, чтобы увидеть остальные лимфатические узлы в буфере AutoMACS.

9. Для фильтрации наземные органы в суспензии отдельных клеток, начинают путем складывания за кусок 40 мкм нейлоновый материал в несколько раз, и размещение в верхней части 15 мл центрифужную пробирку. Нейлон материал должен быть примерно 3 х 3 дюйма
10. Используйте шприц 5 мл и 21 г иглы для аспирации 5 мл AutoMACS Бег буфера и наземные органы. Не включать медленно в сложенном материала нейлона. Позаботьтесь, чтобы избежать прокалывания материала с иглы.

Примечание: После того, как один суспензию клеток достигается, решение должно появиться в виде бледно-, последовательного решения с не visibле куски твердой ткани. Если твердые остаются, повторно аспирации и отказаться через новый сложенный лист нейлона размещены в новом 15 мл трубки центрифуги.

11. Всегда держите клетки на льду, когда он не используется.

5. Сотовый Разделение

1. Для получения оптимальных результатов, получить по крайней мере 80% чистого CD4 + CD25-популяции клеток через AutoMACS Cell Сепаратор Pro с помощью MACS CD4 + CD25 + регуляторных Т-изолятор комплект, мышь. Протокол для отрицательного сохранением CD4 + CD25-популяции клеток получают посредством Miltenyi Biotec.

6. Th17 Дифференциация

1. Соберите CD4 + CD25-популяции клеток после отделения с AutoMACS Pro сотовый Сепаратор.
2. Граф клеток развести в соотношении 1:1000 с использованием трипанового синего гемоцитометра.
3. После того, как концентрация была определена от числа клеток, разбавленной клеточной суспензии в 1 × 10 ⁶ клеток / мл в культуральной среде клеток.
4. Выньте 96-луночных планшетов с пластиной связанного анти-CD3 после 4 часов.
5. Промыть анти-CD3-лунок 200 мкл PBS. Повторите 2 раза.
   1. Для мытья добавить 200 мкл стерильной PBS, чтобы анти-CD3 покрытием скважин и удалить PBS в контейнер для отходов.
6. Добавить 100 мкл смеси iTh17 или управления активация смеси (см. пункт № 2) в лунки в трех экземплярах.
7. Добавьте 100 мкл клеток в каждую лунку, в которой либо смесь Th17 или управления активацией смесь была помещена.
8. Инкубируйте клетки, по крайней мере 72 ч или до 5 дней (Th17 дифференциация может быть получен после 72 часов или через 5 дней.)
9. Th17 дифференцирование может быть оценена путем внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии анализа, ELISA или количественной ПЦР

7. Сотовый активации (необходимо только для внутриклеточного окрашивания)

1. Удалить 96-луночных планшетов из инкубаторов в конце либо 72 ч или 5 дней
   1. Напомним, что Th17 differentiatioн может быть достигнуто после либо 72 часов или 5 дней.
2. Для каждого состояния (например, управления или активации iTh17), передача клетки, которые в трех экземплярах в одну лунку 24-луночного культурального планшета клеток. Клетки для одного состояния в настоящее время объединены в одну лунку 24-луночного планшета культуры, в отличие от быть в трех экземплярах на 96-луночный U нижней культурального планшета.
3. Общий объем каждой лунки в клеточной культуральной пластины 24 а теперь 600 мкл. Поднимите объем каждой лунки по 1 мл с клеточной культуры.
4. Добавить PMA (форболмиристатацетата) (50 нг / мл), иономицин (1 мкМ), и БФА (брефелдин-A) (10 мкг / мл) в каждую лунку в 24-луночного культурального планшета клеток в указанных концентрациях.
5. Инкубировать при 37 ° С в течение 4 часов.

8. Внутриклеточного окрашивания

1. Пятно клетки с нужными внеклеточных и внутриклеточных маркеров для проточной цитометрии анализа. Для обнаружения присутствия Oе IL-17, внутриклеточное окрашивание делается с анти-IL-17A антител. Рекомендуемые поверхностно внеклеточные маркеры включают CD4, CD8, и CD25.
   1. Используйте внутриклеточных окрашивание цитокинов Starter Kit-Mouse от BD Bioscience для окрашивания IL-17 внутриклеточного.
   2. Для каждого образца гранул клетки, удалить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл FACS буфера (2% FBS в PBS).
   3. Трансфер ресуспендировали клетки до 96 потока клеток цитометрии пластины.
   4. Спин клетки вниз в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту и ​​отбросить супернатант.
   5. Добавить 200 мкл буфера PBS FACS, центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту, и отбросить супернатант.
   6. Ресуспендируют клеток в 100 мкл FACS буфера и применять 100 мкл внеклеточного антитела (Ab) смесь (внеклеточный Ab смесь выполнен в FACS буфере). Инкубировать 15 мин при комнатной температуре, покрытые пленкой.
   7. Повторите шаг 8.1.4.
   8. Повторите шаг 8.1.5 2x.
   9. Ресуспендируют клеток в 100 мкл BD Cytofix / Cytoperm буфера. Incubели в течение 20 мин при комнатной температуре, покрытых пленкой.
   10. Добавить 100 мкл 1x BD Пермь / промывочного буфера, центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту, и отбросить супернатант. Повторите.
   11. Добавить 50 мкл внутриклеточного Ab смеси. (Внутриклеточный Ab смесь выполнен в 1x BD Пермь / стирка) Инкубировать 15 мин при комнатной температуре, покрытые пленкой.
   12. Повторите шаг 8.1.10.
   13. Ресуспендируют клеток в 200 мкл BD окрашивающего буфера.
   14. Поместите ресуспендировали клетки в проточной цитометрии пробирки, содержащие 200 мкл окрашивающего буфера BD (конечный объем 400 мкл).
   15. Хранить при 4 ° С до образцы не будут готовы для чтения.

9. Анализ проточной цитометрии

1. Ворота живая клетка населения.
2. Из живой клеточной популяции, ворота на CD4 + CD8-населения.
3. С CD4 + CD8-населения, ворота на IL-17A + населения.
   1. На основе наших предыдущих экспериментальных результатов, 100% от IL-17A + населения будет CD25 +.

* Всего на счету абсолютные клеток были получены после объединения образцы трижды
** Абсолютное число CD4 + CD25 + IL-17A + клеток определяли путем умножения общего количества клеток в живой процент и процент от общего объема клеток, несущих происхождение конкретных маркеры, CD4, CD25 и IL-17A ворот, как определяется с помощью проточной цитометрии.

10. КПЦР и ИФА

1. Место клетки не используются для анализа проточной цитометрии в 1,5 мл пробирку Эппендорфа и центрифуге при 13000 оборотах в минуту в течение 5-10 мин. Клетки, обнаруженные в осадок клеток после центрифугирования будет использоваться для анализа КПЦР. Анализ КПЦР проводили с использованием PTC-200 Пельтье Термоциклер (BioRad).
2. Сбор супернатант из центрифугированных труб для ИФА. IL-17A ИФА проводили с использованием антитела пара TC11-18h10 (захват, каталожный номер 555068) и TC11-8х4 биотин (обнаружение, каталожный номер 555067), приобретенного у BD Biosciences. IL-17A ИФА станцииndards были получены из eBioscience (номер по каталогу 14-8171-80).
3. После удаления жидкости, ресуспендируют остальные ячейки, которые будут использоваться для количественной ПЦР в 175 мкл буфера для лизиса РНК (немедленно использовать для экстракции РНК, синтез кДНК и количественной ПЦР, или хранить при температуре -80 ° С для последующего использования).
   1. Обратитесь к таблице II для последовательностей праймеров для IL-17A и актина (гена уборки)

Этот протокол дифференциация Th17 начинается с удаления селезенки и подмышечных, плечевых, мезентериальных, шейки матки, и паховых лимфатических узлов. Представление из мест каждого можно найти на рисунках 2 и 3. На рисунках 1 и 5 и дают наглядное представление из методов, описанных в этом протоколе.

Этот протокол Th17 фокусируется на дифференциации от популяции лимфоцитов CD4 + CD25-T. Важно отметить, насколько эффективно Pro разделени клеток AutoMACS обогащает желаемый CD4 + CD25-популяции из объединенных общей лимфатического узла и селезенки (фиг. 4). Нефракционированного, объединяли лимфатических узлов и спленоциты, и AutoMACS разделенных фракции окрашивали antiCD4 и antiCD25 антител с последующим анализом проточной цитометрии (рис. 4). 4А показывает, представитель профиля процент CD4 + CD25 +и CD4 + CD25-лимфоциты, присутствующие в нефракционированных, объединенных лимфатических узлов и селезенки методом проточной цитометрии. Процедура изоляция также обеспечивает обогащенный население CD4 + CD25 + Treg из C57BL / 6 мышей, которые могут быть использованы в дополнительных экспериментах (фиг.4В). Фиг.4С показан наш нужное обогащение клеток с населением, что составляет 84% CD4 + CD25-Т-клетки, с подавляющее большинство CD4 + CD25 + Tregs удалены. Мы последовательно имеют небольшой НЕЛИМФОИДНОЙ клеточной популяции, которая присутствует в обогащенном CD4 + CD25-, но это не мешает процессу дифференциации (фиг.4С). Наш обогащенный CD4 + CD25-Т-клеток населения помогает обеспечить более успешное дифференциацию Th17.

На рисунке 5 показана схема нашей процедуры дифференциации Th17. Наш обогащенный CD4 + CD25-популяции либо инкубируют в условиях Th17 дифференцированием (анти-CD3, анти-CD28, IL-6 и TGF-β) или контроль (анти-CD3, анти-CD28). Как видно на фиг.6, что в то время как инкубация CD4 + CD25-Т-лимфоцитов анти-CD3, анти-CD28 в течение 5 дней дало CD25 + Т-лимфоциты, инкубации при Th17 условий, индуцирующих дали подмножество IL17 производства CD25 + лимфоцитов CD4 +. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 приведены примеры CD4 + CD25 + IL-17A + абсолютных урожайности номер мобильного после 5 дней инкубации в условиях iTh17.

Th17 статус дифференциация может быть дополнительно оценены через количественной ПЦР и ИФА. Рисунке 7 показаны данные из обогащенных CD4 + CD25-Т-лимфоцитов инкубировали под контролем или Th17-индуцирующих условиях. CD4 + CD25-T-лимфоцитов инкубируют в условиях Th17 до регулировать IL17A, который может быть установлено через количественной ПЦР (7А) и ELISA (фиг. 7b). Th17-специфический фактор транскрипции RORγT также активируется с помощью CD4 + CD25-Т-клеток, инкубированных при Th17-индуцирующих условиях, и может быть установлено THRух КПЦР (рис. 7А).

Рисунок 1. Th17 Дифференциация схематично. 1. Coat скважины U-дном 96-луночный планшет с анти-CD3 (10 мкг / мл) разводили в PBS. 2. Разместить пластина в инкубаторе в течение 4 ч при 37 ° С. В то время как пластина инкубации, рассекают лимфатические узлы (LN) и селезенки от мыши. Измельчите органы и фильтрации с получением суспензии отдельных клеток. Изолировать CD4 + CD25-Т-клеток с использованием клеток Isolation Kit CD4 + CD25 + регуляторных Т-и Miltenyi AutoMACS Pro сепаратора. CD4 + CD25-клетки должны быть разведено до 1 х 10 6 клеток / мл. 3. После 4 ч инкубации 96-луночного планшета будет завершена, мыть скважин с PBS (200 мкл / лунку) 3x. 4. Добавить 100 мкл CD4 + CD25-Т-клетки к пластине с привязкой (Pb) анти-CD3 лунок. 5. Добавить 100 мкл анти-CD28 или 100 мкл iTh17 COCktail (antiCD28, TGF-β, и ИЛ-6). 6. Инкубируйте пластины в течение 3 или 5 дней при 37 ° С После инкубации оценивают дифференцировку внутриклеточным окрашиванием, КПЦР и / или ELISA.

Рисунок 2. Л.Н. Руководство Рассечение. А) 1 плечевой лимфатических узлов можно найти в соединительной ткани, расположенной рядом с каждым подмышечной впадине (подмышки) мыши. B) 1 подмышечных лимфатических узлов можно найти в каждой подмышечной впадине, за грудными мышцами. C) мезентериальных лимфатических узлов, расположенных в соединительная ткань кишечника. Они похожи на нитку жемчуга. D) 4 поверхностные шейные лимфатические узлы находятся в области шеи мыши. E) 2 паховые лимфоузлы (1 с каждой стороны) может быть расположена в области тазобедренного сустава в месте, где три кровеносные сосуды удовлетворения .

. Внутри-странице = "всегда">
Рисунок 3. Селезенка рассечение руководство. Селезенки мыши можно найти на левой стороне тела позади желудка и кишечника. Просто удалите, потянув и отделения с пинцетом.

Рисунок 4. Сотовые фракции из объединенной LN и клетки селезенки до и после Pro разделение AutoMACS.) LN и клеток селезенки были окрашены, экс естественных, определить исходные клеточные популяции до разделения. После разделения, CD4 + CD25 + (В) и CD4 + CD25-(C) фракции окрашивали для оценки чистоты CD4 + CD25 + и CD4 + CD25-T популяциях лимфоцитов соответственно. Все образцы окрашивали CD4 + и CD25 + антитела и проанализированы с помощью проточной цитометрии.

Рисунок 6. Th17 дифференциация оценивали с помощью проточной цитометрии. CD4 + CD25-Т-лимфоциты инкубировали в присутствии пластины с привязкой к анти-CD3, анти-CD28, IL-6 и TGF-β (iTh17) или пластины с привязкой к анти-CD3 и анти-CD28 один (контроль) в течение 5 дней. Затем клетки активируются ФМА и иономицином в течение 4 часов при 37 ° С. После активации клетки окрашивали анти-CD4, анти-CD8, анти-CD25 и анти-IL-17A антител для проточной цитометрии анализа для оценки Th17 дифференциации. iTh17 = Th17 вызывая сonditions.

Рисунок 7. Th17 дифференциация оценивали по количественной ПЦР и ELISA. Лимфоциты мышей C57BL / 6 были отсортированы и CD4 + CD25-Т-клетки инкубировали в присутствии пластинчатых связан анти-CD3 (10 мкг / мл), анти-CD28 (1,5 мкг / мл ), IL-6 (20 нг / мл), и TGF-β (5 нг / мл) или пластины с привязкой к анти-CD3 и анти-CD28 один (контроль) в течение 5 дней. A) Клетки затем собирают для оценки RORγT и IL-17A экспрессии сообщение через КПЦР. B) Супернатанты собирали для оценки экспрессии белка IL-17A по ELISA.

Нет раскрытия объявить.