Методическая статья

Индуцированное теплом извлечение антигена: эффективный метод обнаружения и идентификации типов клеток-предшественников во время нейрогенеза гиппокампа у взрослого человека

DOI:

10.3791/50769

⸱

30 августа 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurologic Surgery, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Anatomy, Korea University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время нейрогенеза гиппокампа взрослого человека, определенный набор генетических маркеров экспрессируется, когда неподвижная нейральная стволовая клетка последовательно прогрессирует и развивается в функционально интегрированный нейрон в цепи. С помощью индуцированного теплом извлечения антигенов типы клеток-предшественников, которые в противном случае трудно обнаружить, идентифицируются с повышенной эффективностью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционные методы иммуногистохимии (ИГХ) после фиксации тканей позволяют визуализировать различные типы клеток. Они, как правило, сопровождаются применением антител для связывания антигенов и идентификации клеток с характеристиками, которые являются функцией врожденной биологии и развития. Нейрогенез взрослого гиппокампа представляет собой последовательный процесс, в ходе которого неподвижная нейральная стволовая клетка может активироваться и проходить через стадии пролиферации, дифференцировки, созревания и функциональной интеграции. Каждая фаза отличается характерной морфологией и повышением регуляции генов. Идентификация этих фаз важна для понимания действующих регуляторных механизмов и любых изменений в этом процессе, лежащих в основе патофизиологии изнурительных расстройств. Наш подход к извлечению антигенов, индуцированный теплом, улучшает интенсивность обнаруживаемого сигнала и позволяет правильно идентифицировать тип клеток-предшественников. Как обсуждалось в данной статье, это, в частности, позволяет обойти текущие проблемы в обнаружении определенных типов клеток-предшественников.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейрогенез, генерация новых нейронов из нейральных стволовых клеток, как теперь известно, постоянно происходит во взрослом возрасте в двух специализированных областях мозга. К ним относятся субвентрикулярная зона (SVZ) обонятельной луковицы и субгранулярная зона (SGZ) зубчатой извилины в гиппокампе. За последнее десятилетие в области нейрогенеза гиппокампа у взрослых была проделана значительная работа. Эта область вызвала большой интерес, поскольку новорожденные нейроны в SGZ способствуют повышению нейронной пластичности, которая может поддерживать определенные функции мозга1-5. Нейрогенез гиппокампа у взрослых играет важную роль в регуляции настроения, регенерации, обучении и памяти. Таким образом, были предприняты согласованные усилия, чтобы понять развитие и регуляцию нейронов в этой богатой нейрогенной нише.

Неизбежным и важным аспектом изучения нейрогенеза гиппокампа у взрослого человека является идентификация отдельных стадий, через которые проходит активированная нейральная стволовая клетка на пути к тому, чтобы стать полноценным нейроном. В этом процессе неподвижная нейральная стволовая клетка активируется и проходит через ряд ранних активных и поздних активных типов клеток-предшественников (рис. 1). Эти различные популяции нейронных предшественников могут быть идентифицированы по морфологии и экспрессии ими молекулярных маркеров, таких как MCM2, нестин, Tbr2 и Doublecortin (DCX) и NeuN, которые управляют преобразованием RGL в соответствующие типы клеток-предшественников. Нестин является промежуточным филаментным белком, который экспрессируется в радиальных глиаподобных клетках и некоторых ранних типах клеток-предшественников. Другим маркером является Tbr2, который специфически экспрессируется в амплифицирующих клетках-предшественниках. Экспрессия трансгена Tbr2 первоначально отключается в клетках Type-1 (подобно радиальной глии), включается у предшественников Type-2a, Type-2ab и Type-2b и выключается у более дифференцированных нейронов Type-3 и незрелых нейронов (Рисунок 1). DCX — это маркер миграции нейронов, который экспрессируется в нейронных предшественниках Type-2ab, Type-2b и Type-3. Используя эту комбинацию трех маркеров, мы можем обозначить различные подтипы нейронных предшественников. К ним относятся Тип-1 (MCM2+нестин+Tbr2-), Тип-2a (MCM2+нестин+Tbr2+), Тип-2ab (частичный MCM2+нестин-Tbr2+ и частичный MCM2+Tbr2+DCX-), Тип-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) и Тип-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Постмитотические клетки, такие как незрелые и функционально интегрированные нейроны, могут быть идентифицированы с помощью DCX и маркера зрелых нейронов NeuN.

Традиционные методы ИГХ используют антитела для идентификации антигенов для конкретных типов клеток на основе их экспрессии генов. Последующая визуализация с помощью методов визуализации с высоким разрешением, таких как конфокальная микроскопия, может быть использована для их идентификации. Тем не менее, в настоящее время существуют проблемы, связанные с этими методами, которые не позволяют эффективно идентифицировать радиальные глиоподобные клетки и ранние типы клеток-предшественников. Идентифицировать именно эти типы клеток сложно, потому что применяемое антитело не способно проникать и эффективно связывать белок нестина. Нестин является промежуточным филаментным белком, который включает в себя радиальные отростки, производимые радиальной глиа-подобной клеткой. Неэффективное связывание антитела с антигеном может быть результатом многих факторов, включая время фиксации, температуру ииспользуемую технику. Чтобы помочь решить такие вопросы, мы разработали метод восстановления антигенов или «кипячения». Помимо нестина, этот метод восстановления антигена также улучшает окрашивание других маркеров, таких как Ki67, BrdU, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), Tbr2 и MCM2. Наш метод сочетает в себе химический и физический подходы. Он включает в себя химическую фиксацию ткани в параформальдегиде и последующее высокотемпературное кипячение тонких корональных участков гиппокампа в буфере денатурантной и хаотропной терапии. Это повышает доступность антигена к антителу, улучшает специфичность антител и позволяет лучше идентифицировать типы клеток-предшественников. Наш подход прост в использовании и требует в основном уже имеющихся в лаборатории инструментов и реагентов. Мы широко использовали его для изучения развития нейральных стволовых клеток и их регуляции с помощью внутренних генетических или внешних факторов окружающей среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Преиммуногистохимия: перфузия и гистология

  1. Перфузируйте мышей в соответствии с общим транскардиальным протоколом, адаптированным для мышей, и экстрагируйте мозг до 4% параформальдегида (PFA)9.
  2. Оставьте мозг в PFA на ночь при температуре 4 °C (например, в конической трубке объемом 10 мл, заполненной PFA). Держать в ПФА не менее 12-24 ч, не более 36 ч для полной фиксации. После ночной фиксации опорожните PFA из конической трубки, но оставьте мозг внутри. Налейте 30% сахарозы в тюбик и промойте мозги в течение коротких 5 секунд, чтобы удалить остатки PFA. Наконец, снова наполните пробирку с мозгами 30% сахарозой. Держите мозги в сахарозе при температуре 4 °C, пока они не опустятся на дно пробирки.
  3. Вырежьте на микротоме срезы мозга размером 40 мкм. Обратитесь к атласу мозга мыши, чтобы начать собирать срезы от начала зубчатой извилины до ее конца. Законсервируйте срезы в растворе антифриза (простой рецепт – 300 г сахарозы в 500 мл 0,1 М ПБС и 300 мл этиленгликоля) до готовности для иммуногистохимии.
  4. Закрепите разрезанную ткань на предметных стеклах микроскопа, специально разработанных для прочного прилегания к ткани. Эти предметные стекла обеспечивают прочную фиксацию тканей на стадии кипячения. После монтажа салфетки дайте предметному стеклу высохнуть в течение 10 минут или пока оно полностью не высохнет. Сушку можно ускорить, если предметное стекло упереться в вертикальную поверхность нижним краем предметного стекла на бумажное полотенце. Если устанавливается более одного предметного стекла, другой предметный предмет (стекла) можно оставить сухим в течение этого времени (достаточно 1-2 часа) до тех пор, пока он не будет готов перейти к следующему этапу.
  5. После высыхания предметного стекла промойте PBS три раза по 5 минут каждый раз и снова высушите (буфер PBS = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na2PO4). Это гарантирует, что любое предыдущее химическое вещество (например, глицерин из раствора для хранения антифриза) будет в достаточной степени удалено и не сможет нарушить адгезию ткани к предметному стеклу.

2. Подготовка реагентов и вспомогательного оборудования

  1. Приготовьте раствор А (0,1 М или 19,21 г/л лимонной кислоты) и раствор Б (0,1 М или 24,9 г/л трис-цитрата натрия), в которых будут кипятиться срезы тканей.
  2. В градуированном цилиндре смешайте 9 мл раствора А и 41 мл раствора В. Добавьте к этой смеси 450 мл ддН2О.
  3. Налейте эту смесь в пустую емкость (например, пустую коробку из-под наконечников для дозатора), пригодную для использования в микроволновой печи.

3. Извлечение антигена, вызванное теплом

  1. Кипятить раствор, сделанный на шаге 2, в течение 5 мин при стандартной настройке в стандартной микроволновой печи. Раствор начнет кипеть при температуре 100 °C или выше.
  2. Как только кипячение завершится, осторожно достаньте контейнер из микроволновой печи и поместите в него высушенные предметные стекла, убедившись, что поверхность горки с участками гиппокампа обращена вниз и полностью открыта для жидкости. По возможности разместите горки под углом к стенкам коробки и сложите вокруг них другие горки. Убедитесь, что их «прилегание» внутри коробки плотное, чтобы у горок не было места для перемещения друг на друга.
  3. Варите эту смесь горками в течение 7 мин при стандартных настройках в микроволновой печи. В течение этого времени раствор будет кипеть при температуре 100 °C или выше.
  4. Во время этой стадии кипячения наполните льдом два ведра со льдом наполовину.
  5. Как только кипячение на шаге 3.3 будет завершено, выньте контейнер из микроволновой печи и поместите его в одно из ведерок со льдом. Высыпьте оставшийся лед из другого ведра по всему контейнеру и полностью накройте его. Оставьте на 1 час.

4. Окрашивание первичными и вторичными антителами

  1. По истечении 1-часового периода ожидания извлеките предметные стекла из контейнера и промойте буфером TBS-T 3 раза в течение 5 минут каждый. Для выполнения этих основных промывок может быть использован любой аппарат. (Буфер TBS = 50 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, TBS-T = 0,05% буфер Triton X-100 TBS, TBS-TT = 4% буфер TBS-T в сыворотке осла).
  2. После мытья дайте слайдам высохнуть в темном месте (например, внутри ящика скамейки, положите внутрь ящика бумажное полотенце и наклоните слайд к нему) в течение 5-10 минут или пока слайд полностью не высохнет. В этот период подготовьте камеру для ночного первичного окрашивания антителами. Простая камера окрашивания может включать в себя контейнер с большой площадью поверхности, заполненный ddH2O, и предметный столик внутри контейнера, на котором предметное стекло может быть установлено над ddH2O.
  3. После того, как предметное стекло высохнет, нарисуйте контур вокруг участков ткани с помощью водоотталкивающей ручки. На этапе 4.5 этот контур действует как барьер, препятствующий протеканию смеси антител.
  4. Готовят первичную смесь антител при ТБС-ТТ. Для покрытия всего предметного стекла требуется не менее 500 μл, например, если запас антител находится в концентрации 1:500, добавьте 1 μл определенного антитела к 500 μл TBS-TT). Используйте первичные антитела, как указано в таблице реагентов.
  5. Поместите высохшее предметное стекло на верхнюю часть предметного стекла в камеру окрашивания. Медленно добавляйте 500 мкл первичных антител и покрывайте всю поверхность. Накройте весь аппарат и оберните алюминиевой фольгой, чтобы блокировать внешний свет. Оставьте на ночь при комнатной температуре.
  6. На следующий день промойте предметное стекло три раза по 5 минут с буфером TBS-T. Дайте ему высохнуть в темном месте, как описано в шаге 4.2.
  7. Приготовьте вторичную смесь антител аналогично шагу 4.4. Обратитесь к таблице реагентов для вторичных антител.
  8. Поместите высохшее предметное стекло в камеру для окрашивания, как описано в шагах 4.2 и 4.5. Медленно добавьте 500 мкл вторичных антител и покройте всю поверхность. Оберните камеру для окрашивания алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от внешнего света. Оставьте его накрытым и защищенным от внешнего света не менее 2 часов при комнатной температуре.
  9. После завершения вторичного окрашивания промойте предметное стекло три раза по 5 минут с буфером TBS-T. Дайте предметному стеклу высохнуть в темном месте. После высыхания налейте монтажный раствор и тщательно накройте горло защитным накладкой, не допуская попадания пузырей. Дайте предметному стеклу постоять в темном месте не менее 2 часов перед последующим анализом.
  10. Проведите покадровый или конфокальный анализ окрашенной ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейрогенез в гиппокампе взрослых представляет собой последовательный процесс, при котором репрезентативный тип клеток-предшественников на каждом этапе может быть идентифицирован с помощью комбинации маркеров. Тщательная химическая фиксация и демаскировка антигенов повышают эффективность и доступность маркеров, которые в противном случае трудно обнаружить. Одним из таких маркеров является nestin, который экспрессируется в радиальных глияподобных нейральных стволовых клетках и некоторых типах ранних активных клеток-предшес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важными этапами для успешного восстановления антигена и окрашивания типов клеток-предшественников являются: 1) использование хорошо перфузированной и фиксированной ткани оптимальной толщины короны; 2) предоставление достаточного времени для кипячения и последующего охлаждения при извлечении антигена; 3) ловкость рук при монтаже неподвижных коронковых секций и предупреждение их повреждения при этом.

При ИГХ крайне важно использовать перфузированную ткань, которая подверглась достаточно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методология была первоначально разработана в лаборатории доктора Хунцзюнь Сонга в Институте клеточной инженерии, отделении неврологии, Медицинской школе Джона Хопкинса. Эта работа финансировалась NIMH (R00MH090115), NARSAD, Фондом исследований рака Майо Братского ордена орлов и стартовым пакетом от фонда Майо, предоставленным M.H.J., и Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и технологий (A3014385), присужденной W.R.K.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
SuperFrost Plus SlideFisherbrand12-550-15Обеспечивает прочное сцепление с тканью гиппокампа при кипячении
ПВА/DABCO Монтажный материалSigma Aldrich10981-100 мл
Нестин (курица) Aves LabNESМаркер нейральных стволовых клеток
GFAP (кролик)Dako North AmericaZ033401-2Астроциты и маркер нейральных стволовых клеток
MCM2 (мышь)BD Трансдукция Лаборатория610701Маркер пролиферации
DCX (коза)Santa Cruz BiotechnologySC8066Маркер незрелых нейронов
Tbr2 (кролик)AbcamAb23345Амплифицирующий маркер-предшественник
NeuN (мышь)MilliporeMAB377Маркер зрелых нейронов
Cy2 (антикролик)Jackson Immunoresearch111-226-047
Cy2 (против курицы)Jackson Immunoresearch303-165-006
Cy5 (против мышей)Jackson Immunoresearch315-175-047
Cy5 (против козы)Jackson Immunoresearch305-165-047
DAPILife Technologies CorporationD1306
Dako PenS2002DakoВодоотталкивающая ручка

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
  2. Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301 (5634), 805-809 (2003).
  3. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).
  4. Clelland, C. D., Choi, M., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325 (5937), 210-213 (2009).
  5. Wang, J. W., David, D. J., et al. Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).
  6. D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).
  7. Daneshtalab, N., et al. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).
  8. Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis. Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  10. Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system. FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).
  11. Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval. Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи