Порядок Создание многоуровневой углубленным круглым сечением Endothelialized Микроканалы-на-чипе

Summary

Микроканалов-на-чипе платформа была разработана комбинация фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики. Endothelialized платформы микроканалов имитирует трехмерную (3D) геометрии в естественных условиях микрососудов, работает в контролируемых непрерывного потока перфузии, позволяет качественно и изображений в реальном времени и может быть применен для микрососудистых исследований.

Abstract

Усилия были сосредоточены на разработке в пробирке анализов для изучения микрососудов, потому что в естественных условиях исследования на животных более трудоемким, дорогим и наблюдения и количественной очень сложным. Однако, обычные в пробирке анализов микрососудов имеют ограничения при представлении в естественных условиях микрососудов по отношению к трехмерной (3D) геометрии и обеспечение непрерывного потока жидкости. Используя комбинацию фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики, мы разработали несколько глубине круглого поперечного сечения микроканалов endothelialized-на-чипе, которая имитирует 3D геометрии в естественных условиях микрососудов и работает под управлением контролируемого непрерывной перфузии потока. Положительный reflowable фоторезиста был использован для изготовления мастер-формы с полукруглое поперечное сечение микроканала сети. По выравнивание и соединение двух полидиметилсилоксана (PDMS) микроканалов REPLвыделенному из главной формы, цилиндрической микроканальной сеть была создана. Диаметры микроканалов может быть хорошо контролируются. Кроме того, первичных человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs) высевают в микросхеме показали, что клетки Вдоль внутренней поверхности микроканалов в контролируемых перфузии продолжительностью периода времени от 4 дней до 2 недель.

Introduction

Микрососуды, как часть системы кровообращения, опосредуют взаимодействие между крови и тканей, поддерживают метаболической активности, определяют ткани микросреду, и играют важную роль во многих здоровья и патологических состояний. Краткое изложение функциональных микрососудов в пробирке может обеспечить платформу для изучения сложных сосудистых явлений. Однако, обычные в пробирке анализов микрососудов, например, миграции эндотелиальных клеток анализы, анализы эндотелиальных формирования трубки и крысы и мыши анализов аорты кольцо, не в состоянии воссоздать в естественных условиях микрососудов в отношении трехмерной (3D) геометрии и непрерывный контроль потока ^1-8. Исследования микрососудов с использованием животных моделей и в естественных анализов, таких как анализ ангиогенеза роговицы, хорионалантоисной мембраны ангиогенеза анализа и Матригель вилка анализа, более трудоемким, высокую стоимость, сложные по отношению к наблюдению и количественных иэтические вопросы, ^{1, 9-13.}

Достижения в MicroManufacturing и микрожидкостной технологии чипа позволило различным понимание медико-биологических наук в то время как сокращение высоких экспериментальных затрат и сложностей, связанных с животными и в естественных условиях исследования ^14, такие, как легко и жестко контролируется биологическими условиями и динамической жидкостной среды, который не будет иметь бы возможно при обычном макромасштабные методов.

Здесь мы представляем подход к построению endothelialized микроканалов-на-чипе который имитирует 3D геометрии в естественных условиях микрососудов и работает под управлением контролируемого непрерывного потока перфузии с помощью сочетания фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики.

Protocol

1. Изготовление фотолитографии фоторезиста Master Mold

Следующий протокол показан процесс для изготовления микроканалов с диаметром 30-60 мкм. Чтобы получить микроканальной с меньшим диаметром (менее 30 мкм), одну спин-покрытия фоторезиста необходимо.

1. Передача оплавления фоторезиста из холодильника при 4 ° С в чистом помещении 24 часов перед использованием и дайте ему прогреться до комнатной температуры.
2. Очистите кремниевой пластины и испечь его в течение одного часа при температуре 150 ° C, чтобы позволить ему обезвоживает. Обезвоживание поможет адгезию фоторезиста на кремниевой подложке.
3. Спин-слой первым слоем фоторезиста с помощью следующей рецептуры:

Шаг	Время (в секундах)	Скорость (RPM)	Ускорение
1	2	300	наивысший
2	10	0
3	3	300	наивысший
4	60	600	наивысший
5	10	500	наивысший
6	10	600	наивысший

4. Затем выпекать пластины на плите при температуре 110 ° С в течение 90 сек. После мягкого печь толщины фоторезиста составит 20-30 мкм.
5. Спин слой второй слой фоторезиста следуя той же рецепт используется для первого слоя.
6. Мягкие выпекать пластины снова, поместив его на плите при температуре 110 ° С в течение 90 сек. После этого мягкой печь толщины фоторезиста будет 40-60 мкм.
7. Генерировать положительный моделей мастера, подвергая photoresist к ультрафиолетовому излучению с экспозиционной дозы 14 500 мДж / см ² через пленку маску.
8. Развести разработчик деионизированной (DI) воде (1:2 (объем / объем)). Промыть пластины повторно в раствор, пока рисунок не будет полностью развита. Затем промыть пластины дистиллированной водой и высушить его с использованием газообразного азота.
9. Оплавления: Место пластины на плите при температуре 120 ° С в течение 4 мин и залить в стеклянную чашку Петри для предотвращения испарения растворителя. Снимите пластину с плитой и дайте ему остыть до комнатной температуры. Толщина фоторезиста после оплавления будет 50-60 мкм.

2. Изготовление мягкой Литография PDMS Microchannel Сети

1. Подготовка полидиметилсилоксана (ПДМС) раствора при массовом соотношении 10:01 (основа: отвердитель) и тщательно перемешать с использованием планетарной центробежной смеситель.
2. Литые решение PDMS на переформатированном формы мастер фоторезиста. Поместите литой PDMS в эксикаторе в течение 15 мин для дегазации. Использование газообразного азота, чтобы удалить оставшиеся пузырьки если это необходимо.
3. Выпекать PDMS в сушильном шкафу при температуре 60 ° C в течение 3 часов, чтобы позволить ему вылечить. Затем удалите слой вылечить PDMS от мастера формы.
4. Используйте заостренный перфоратор для создания на входе / выходе отверстия, пробивая отверстия в канал сети. Очистка поверхности PDMS с использованием газообразного азота.
5. Лечение два PDMS слоев с кислородной плазмой в течение 30 сек в плазме уборщик при рабочем давлении 4,5 × 10 ^-2 торр и расход кислорода от 3,5 фут ³ / мин. Затем выравнивания поверхности PDMS вручную с помощью оптического микроскопа. Использование капли воды, если это необходимо для лучшего контроля выравнивания.
6. Выпекать устройство в печи при 60 ° С в течение 30 мин для достижения постоянного соединения.

3. HUVEC культуры и заполнения в чип

1. Культуры HUVECs с культуральной среде с L-глутамином, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Для йэлектронной эксперимент проходы между 2 и 5 были использованы.
2. После HUVECs являются сливающийся, подсчет клеток и собирать их на первый промывания этих клеток HEPES-солевом буферном растворе (HEPES-BSS), а затем обрабатывать клетки с помощью трипсина / EDTA и инкубируют в течение 2-6 мин при 37 ° С. После обработки трипсином завершения нейтрализации трипсина / EDTA трипсином нейтрализующим раствором. Центрифуги и приостановить клеток в культуральной среде с 8% декстран, чтобы собрать их. Декстран была использована для увеличения средней вязкости, чтобы помочь в лучше посева клеток и крепления.
3. Лечение устройства кислородной плазмой в течение 5 мин при рабочем давлении 4,5 × 10 ^-2 торр и расход кислорода от 3,5 фут ³ / мин. Затем загрузить устройство деионизированной водой и обрабатывают УФ-светом в течение 8 часов в ламинарном шкафу в течение биологической стерилизации.
4. За один день до клетки готовы, мыть устройство с 1x фосфатным буферным раствором (1х PBS), затем слой с фибронектином (100 мкг / мл разбавленнойuted с 1x PBS) и инкубируют в холодильнике при температуре 4 ° С в течение ночи.
5. После фибронектина покрытием, мыть устройство с 1x PBS затем загрузить с культуральной среды. Инкубируйте устройство при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
6. Загрузите HUVEC клеток в 8% культуральной среде декстрана с сотовым концентрации 3-4 х 10 ⁶ клеток / мл. Поместите 20 мкл капли клеток на один вход устройства и наклонить его введения клеток в микрофлюидном канала. Через 15-20 мин клетки начинают прикрепить к боковым стенкам каналов. Поворот через каждые 15 мин, чтобы создать более равномерное распределение клеток. При необходимости дополнительной нагрузки может быть выполнена.

4. Долгосрочные перфузии Настройки

Через 5-6 ч статической культуры, прилагаемой HUVECs начнет в полной мере распространяться. Настройка перфузии помощью дистанционного управления системой шприцевой насос с постоянным расходом 10 мкл / час. Перфузии можно регулировать еили с большей скоростью потока, и может длиться в течение периода времени от 4 дней до 2 недель.

5. Окрашивание клеток и микроскоп характеристика

1. Когда клетки достигают слияния внутри устройства, во-первых, мыть устройство с 1x PBS, чтобы тщательно удалить среды. После загрузки устройства с красным красителем разбавляют разбавителем (4 мкл-1 мл). Загрузите красителя аналогична процедуре загрузки ячейки. Инкубируйте устройство в темноте в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем промыть устройство с культуральной средой, чтобы остановить окрашивания. Длинные инкубации краситель может привести к клеточной токсичности и disadhesion.
2. Поместите устройство с голубой краситель разводили 1х PBS (2 капли на мл). Инкубируют в темноте в течение 5 мин при комнатной температуре, затем тщательно промыть устройство с 1x PBS.
3. Изучите окрашивания клеток с помощью инвертированного оптического микроскопа. Если окрашивание было хорошо, загрузите микроканалов с фиксацией среды (3,5% параформальдегиде разбавляют 1x PBS), затем погрузитеУстройство фиксации в средних и полностью покрывать его алюминиевой фольгой. Храните прибор в холодильнике при температуре 4 ° С, чтобы предотвратить устройство от высыхания и фотообесцвечивания. Фиксированной Теперь устройство готово для конфокальной микроскопии, которое может быть сделано путем конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Results

Наш подход для изготовления нескольких глубины микроканальной сеть имитирует сложные 3D геометрии в естественных условиях микрососудов, в котором микроканалов имеют закругленные сечений ^15. Кроме того, диаметры родителей ветвления каналов и каналов дочь примерно подчиняются закону Мюррея для поддержания потока жидкости на необходимом уровне, так что общее сопротивление канала слишком низко, скоростях потока более равномерным по всей сети ^16-18. Процессов и результатов для изготовления полу...

Discussion

1. Мастер изготовления форм

Один из проектирования и руководящих принципов сосудистой морфометрией известен как закон Мюррея ^16, в котором говорится, что распределение диаметре сосудов по всей сети регулируется минимальная рассмотрения энергии. В нем также говорится, что куб диаметров родитель сосуде при бифуркации равна сумме кубов диаметров дочь сосудов (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильно>реагент/материал фоторезист AZ Электронные материалы >AZP4620
проявитель	AZ Электронные материалы	AZ 400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Питательная среда	Invitrogen	10372-019
NacBlue Окрашивание ядер	Invitrogen	H1399
PKH Красное окрашивание	Sigma	MINI26 и PKH26GL
Фибронектин	Gibco	PHE0023
L-глутамин	Sigma	G7513
Фосфат Буферизованный Физраствор	Invitrogen	14040-133
HEPES Буферный Солевой Раствор	Lonza	CC-5024
Трипсин/ЭДТА	Инвитроген	25300-062
Нейтрализующий раствор трипсина	Lonza	CC-5002
Лечебный агент PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека	Lonza	CC-2517
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Lonza	14-501F
Разбавитель C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Инвитроген, молекулярные зонды	R37605
Дексон	Сигма	95771
3,5% Параформальдегид	Электронная микроскопия Наука	15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/ Десикатор LITE
	BelArt Продукция	999320237
инвертированный микроскоп	Nikon	Eclipse Ti
Шприцевая насосная система	Гарвардский аппарат	PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood	Thermo	Scientific 1300 series A2
Планетарный центробежный миксер	Thinky	ARE-310
Печь Isotemp Fisher	Scientific	13-246-516GAQ
Оптический микроскоп	Zeiss	Invertoskop 40C
Очиститель плазмы	Harrick Plasma	PDC-32G
Горячая плита	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
лазерный сканирующий конфокальный микроскоп	Zeiss	LSM 510