Определение конкретных сенсорных нейронов населения для изучения выразил ионных каналов

Краткое содержание

Афферентные сенсорные нейроны передают сенсорную информацию с периферии в центральную нервную систему. Идентификация конкретных афферентных нейронов поможет в понимании их физиологии. Мы описываем метод ретроградного мечения для идентификации афферентных нейронов, а также изучаем потенциал-зависимые ионные каналы в этих нейронах с помощью электрофизиологии и иммуноцитохимии

.

Аннотация

Сенсорные нейроны передают сигналы из различных частей тела в центральную нервную систему. Сомы для этих нейронов расположены в ганглиях дорсальных корешков, которые выстилают позвоночный столб. Понимание рецепторов и каналов, экспрессируемых этими сенсорными афферентными нейронами, может привести к новым методам лечения заболеваний. Первым шагом является идентификация конкретного подмножества сенсорных нейронов, представляющих интерес. В данной работе мы опишем метод идентификации афферентных нейронов, иннервирующих мышцы, путем ретроградного мечения с помощью флуоресцентного красителя DiI (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлората). Понимание вклада ионных каналов в возбуждение мышечных афферентов может помочь лучше контролировать чрезмерную возбудимость, вызванную определенными болезненными состояниями, такими как заболевание периферических сосудов или сердечная недостаточность. Мы использовали два подхода к идентификации вольт-зависимых ионных каналов, экспрессируемых этими нейронами: электрофизиологию патч-хомута и иммуноцитохимию. В то время как электрофизиология и фармакологические блокаторы могут идентифицировать функциональные типы ионных каналов, мы использовали иммуноцитохимию для выявления каналов, для которых специфические блокаторы были недоступны, и для лучшего понимания схемы распределения ионных каналов в клеточной популяции. Эти методы могут быть применены к другим областям нервной системы для изучения конкретных групп нейронов.

Введение

Ганглии дорсальных корешков (DRG) состоят из соме афферентных нейронов, иннервирующих различные части тела, и важные выводы могут быть получены при изучении сенсорных нейронов с различными мишенями иннервации¹. Для выделения и идентификации афферентных нейронов используются различные непрямые или инвазивные методы, например, введение в нерв маркеров, таких как фторзолото¹, введение красителя в мышцы хирургическим методом². Из различных красителей, которые были успешно использованы для маркировки нейронов и нервных путей, флуоресцентные красители, такие как DiI, широко используются в нейроанатомических трассировках из-за их быстрого поглощения окончаниями нейронов, длительного удержания в нейронах и отсутствия переноса между^{нейронами.} Афферентные нейроны, помеченные DiI, можно легко визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа для детального изучения. Однако одним из ограничений является то, что такие маркеры, как DiI, могут быть потеряны из клеток во время клеточной пермеабилизации, необходимой для иммуноцитохимии с внутриклеточными^{эпитопами.} Здесь мы опишем метод, в котором используется DiI, введенный в скелетные мышцы, для идентификации мышечных афферентных нейронов в DRG. Мы также описываем метод пемеабилизации клеток, который сохраняет DiI в нейроне, обеспечивая доступ антител к внутриклеточным эпитопам. Мы демонстрируем использование электрофизиологии и иммуноцитохимии для изучения этих идентифицированных нейронов, а также описываем явные преимущества каждого метода в изучении ионных каналов, контролирующих возбудимость нейронов. Наконец, мы описываем потенциальные проблемы, которые могут затруднить интерпретацию электрофизиологических данных. Мы использовали эти методы для идентификации мышечных и кожных афферентных нейронов и определения потенциал-зависимых натриевых каналов (NaV), экспрессируемых в этих идентифицированных нейронах⁸. Тем не менее, эти методы могут быть адаптированы к различным препаратам для изучения идентифицированных подмножеств нейронов, иннервирующих конкретную целевую ткань или ядро мозга.

Протокол

Примечание: Вся работа с животными должна выполняться в соответствии с рекомендациями по уходу за животными.

1. Подготовка животных и маркировка

1. Обезболивание крыс: Обезболивание крысы (обычно 150-400 г) с помощью внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина (50 мг/кг массы тела), ксилазина (5 мг/кг) и ацепромазина (1 мг/кг). Проверьте наличие рефлексов, ущипнув ногу, подождите, пока ответа не будет. Поскольку реакция на анестезию у разных животных варьируется, лучше всего определить эффект анестетиков путем тестирования болевых рефлексов.
2. Раствор DiI: Взвесьте порошок DiI и растворите в стерильном 100% ДМСО до получения 1,5% раствора (15 мг/мл). Храните раствор при комнатной температуре в сухой атмосфере до использования.
3. Инъекции DiI: сбривайте шерсть в области икры на обеих ногах крысы, находящейся под наркозом, с помощью электрической бритвы.
   1. Наполните стерильный шприц объемом 1 мл (игла 11/4 in 27 G) 200 мкл 1,5% раствора DiI. Медленно введите иглу параллельно длинной оси каждой икроножной мышцы и введите 100 μl DiI в мышцу, медленно выводя иглу из мышцы (~10 секунд), не отрываясь от мышцы.
   2. Прежде чем извлечь иглу из мышцы, потяните поршень шприца назад, чтобы убедиться, что краситель больше не вытекает из кончика, подождите 10 секунд, а затем извлеките иглу из мышцы. Этот шаг предотвращает утечку DiI из иглы на кожу, которая может обозначать кожные афференты.
   3. Повторите для другой ноги.
   4. Подождите 4-5 дней, чтобы DiI был транспортирован из мышцы в DRG.

2. Диссекция и выделение нейронов

1. Решения:
   1. Приготовьте сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) и сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS) в соответствии с инструкциями производителя, простерилизуйте фильтр и храните при температуре 4 °C.
   2. Питательные среды (MEM Plus): Смешайте 89 мл минимально незаменимых сред (MEM), 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 мл раствора пенициллина-стрептомицина, процедите и храните при температуре 4 °C.
   3. Раствор полилизина: поли-L-лизина гидробромид порошок (10 мг/100 мл) растворить в 0,1 М растворе бората натрия, рН 8,4, отфильтровать стерилизовать и хранить аликвоты при -20 °С.
2. Покрытие покровных стекол
   1. Стеклянные покровные стекла (круглые 12 мм) очистить в 70% этаноле в течение 3-4 часов и высушить на воздухе в стерильном культуральном колпаке.
   2. Поместите высохшие покровные стекла в раствор полилизина O/N.
   3. Удалите из раствора полилизина и промойте в стерильной дистиллированной воде 2 раза по 5 минут, чтобы удалить избыток полилизина.
   4. Отделите покровные стежки, высушите в культурном колпаке и храните при температуре 4 ^°C.
3. Подготовка к диссекции
   1. Положите на лед стакан с 10 мл HBSS, чашку Петри 35 мм и чашку Петри 100 мм.
   2. Взвесьте ферменты: 7 мг коллагеназы, 1 мг ДНКазы и 10 мг трипсина.
   3. Разогрейте встряхивающую водяную баню до 37 ^°C и поместите в ванну центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл EBSS для нагрева.
4. вскрытие:
   1. Жертва крысы в соответствии с протоколом, утвержденным IACUC. Carbon диоксид был использован для усыпления крысы.
   2. Быстро снимите спину, разрезав кожу на спине, удалите соединительную и мышечную ткань вдоль позвоночного столба для лучшего обнажения и удалите поясничный отдел позвоночного столба (конец грудного отдела к подвздошной кости; Рисунок 1).
   3. Поместите изолированный позвоночный столб в чашку Петри диаметром 100 мм и с помощью стерильной пипетки Пастера нанесите охлажденный раствор HBSS, чтобы препарат оставался влажным и холодным.
   4. Разрежьте мышцы с боков позвоночного столба. Выполните дорсальную ламинэктомию с помощью ронжеров или ножниц и аккуратно удалите кость, окружающую углубления, содержащие DRG.
   5. Многократно наносите ледяной HBSS (~1 мл) во время этой процедуры.
   6. Изолируйте DRG, перерезав периферические и центральные нервы (оставив 1-2 мм нерва для облегчения работы с ганглиями)
   7. Поместите изолированную DRG в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую ледяной буфер HBSS.
   8. Повторяйте до тех пор, пока не будут изолированы все ДРГ L-4 и L-5. Грудной DRG может быть выделен и обработан отдельно в качестве отрицательного контроля для мечения DiI.
   9. Поместите чашку с изолированной DRG под диссекционный микроскоп и удалите лишние нервы и кровеносные сосуды с помощью микроножниц и щипцов.
   10. Разрежьте DRG для лучшего воздействия ферментов, но не очищайте DRG.
5. Диссоциация нейронов DRG:
   1. Добавьте ферменты в теплую среду EBSS (храните на водяной бане). Коротко встряхните до полного растворения, а фильтр простерилизуйте.
   2. С помощью стерильной пастеровской пипетки поместите все DRG в раствор фермента. Сведите к минимуму объем HBSS, добавляемого с DRG, так как HBSS разбавляет смесь ферментов. Опарите колбу 95%_О2 и 5%_СО2 в течение 60 секунд, прежде чем плотно закрыть колбу.
   3. Инкубируйте колбу в водяной бане, установленной при температуре 37 °C, в течение 60 минут при 240 оборотах в минуту.
   4. В конце инкубации энергично встряхните колбу 50 раз, чтобы диссоциировать DRG⁵.
   5. В стерильных условиях добавьте в колбу 5 мл MEM Plus, чтобы остановить действие ферментов.
   6. Переложите содержимое колбы в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 16 x g в течение 6 минут.
   7. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость, добавьте в образец 5 мл MEM Plus. Аккуратно растирайте пипеткой, чтобы разбить гранулу.
   8. Повторите этап центрифугирования, удалите надосадочную жидкость и выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 500 мкл MEM Plus. Аккуратно разотрите наконечником пипетки объемом 1 мл на пипетке, чтобы получилась клеточная суспензия.
   9. Поместите одну стеклянную покровную крышку с полилизиновым покрытием в пустую стерильную посуду диаметром 35 мм. Добавьте каплю (~50 мкл) суспензии ячеек в центр покровного стекла.
   10. Повторяйте до тех пор, пока клеточный раствор не закончится.
   11. Поместите чашки диаметром 35 мм в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 на 1 час, чтобы нейроны могли прилипнуть к покровным стеклам.
   12. Добавьте еще по 2 мл фильтрующего материала в каждую посуду и верните в инкубатор.

3. Запись патч-зажима

1. Решения для записи: эти решения предназначены для регистрации токов NaV. Примеры решений с различным составом можно найти в этих ссылках^5-7.
   1. Наружный раствор: (в мМ) 45 NaCl, 100 N-метил-d-глюкамина (NMG)•Cl, 4 MnCl₂, 10 Na•HEPES и 10 глюкозы, с pH = 7,4 и осмолярностью = 320 мОсм.
   2. Внутренний раствор: (в мМ) 104 НМГ•Cl, 14 Креатин•PO₄, 6 MgCl2, 10 НМГ•HEPES, 5 Трис•АТФ, 10 НМГ2•EGTA и 0,3 Трис ₂•ГТФ с pH 7,4 и осмолярностью = 300 мОсм.
2. Измерение ионных токов:
   1. Вытяните записывающие электроды из стеклянных капилляров на съемник электродов и отполируйте наконечники с помощью микрокузницы. Сопротивление электродов обычно составляет 2-3 МОм
   2. Идентификация меченых DiI нейронов DRG с помощью микроскопа с эпифлуоресценцией и куба TRITC. DiI имеет длину волны возбуждения 550 нм и длину волны излучения 570 нм.
   3. Заполните стеклянный электрод внутренним раствором (только подпиливание ~ 1 см кончика электрода) и осторожно постучите, чтобы удалить все захваченные пузырьки. Поместите в держатель электродов и переместите в ячейку с помощью микроманипулятора.
   4. Как только электрод коснется элемента, мягко всасывайте через всасывающую трубку до тех пор, пока не образуется плотное уплотнение (определяемое увеличением сопротивления электрода).
   5. Зажмите напряжение мембраны на желаемом удерживающем потенциале (обычно от -60 до -120 мВ).
   6. Получите конфигурацию зажима для целых ячеек, применяя более сильное всасывание для удаления мембранного зажима на кончике электрода. Переход к цельноэлементной конфигурации наблюдается электрически как увеличение емкостного тока^8-10.
   7. Компенсация последовательного сопротивления с помощью компенсационной схемы усилителя патч-клещей (использовать не менее 80% компенсации)^8,10.

4. Иммуноцитохимия

1. Зафиксируйте нейроны на покровных стеклах с помощью 4% параформальдегида на 1 час, а затем пропитайте 2% Tween 20 в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 10 минут.
2. Инкубируйте O/N фиксированных клеток в блокирующем растворе (обычной сыворотке или бычьем сывороточном альбумине) плюс первичное антитело, которое представляет собой антитело, разработанное для связывания со специфическим антигеном, представляющим интерес.
3. Инкубируйте контрольный набор нейронов O/N в блокирующем растворе, в котором отсутствуют первичные антитела.
4. Промойте покровные стекла буфером PBS 3 раза в течение 5 минут, а затем 2 промывки по 5 минут каждая с 1% Tween 20 для удаления несвязанного первичного антитела.
5. Инкубируйте тестируемые и контрольные покровные листы с соответствующим вторичным антителом, помеченным флуоресцентной меткой, которое связывается с первичным антителом для обеспечения визуализации.
6. Промойте покровные листы PBS 3x в течение 5 минут, чтобы удалить избыток вторичных антител.
7. Закрепите покровные стекла на чистом предметном стекле с помощью монтажного материала.
8. Нанесите прозрачный лак для ногтей на край покровного стекла, чтобы зафиксировать его место. После высыхания визуализируйте нейроны и сделайте снимки с помощью программного обеспечения, прилагаемого к флуоресцентному микроскопу.
   Примечание: В данной работе использовался микроскоп Nikon с программным обеспечением NIS-elements BR 3.2. Время экспозиции было оптимизировано и сохранено на прежнем уровне для контрольных и тестовых стекол.
9. Измеряйте интенсивность флуоресценции и размер клеток отдельных нейронов с помощью программного обеспечения для визуализации, такого как ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

Результаты

Используя описанный здесь метод, мы идентифицировали мышечные афферентные нейроны в DRG и перешли к определению потенциал-зависимых натриевых каналов (NaV), экспрессируемых этими нейронами. Меченые DiI мышечные афферентные нейроны (рис. 1C) составляли небольшую долю от общей популяции нейронов в DRG, в среднем 16% помеченных нейронов (167/1047). Количественная оценка проводилась путем измерения флуоресценции с помощью ImageJ и построения гистограмм данных об интенсивности для определения порога для полож...

Обсуждение

Мышечные афференты, происходящие из мышц трицепса surae (например, икроножной мышцы), использовались в многочисленных исследованиях для изучения рефлекса прессора упражнений (ЭПР)¹³. Учитывая интерес к изучению сенсорных нейронов, опосредующих ЭПР, были выбраны икроножные мышцы для инъекции красителя. DiI был выбран из-за его липофильной природы и поскольку он не теряется из нейрона при диффузии через интактную плазматическую мембрану^3,14. Используя этот метод в качестве руководства, можно ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 и 1.9	Alamone Labs, Иерусалим, Израиль	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor Fluor вторичные антитела	Invitrogen
Нормальная козья сыворотка
Фтор-гель	Электронная микроскопия Sciences	17985