Подготовка первичных нейронов для визуализации нейриты в Frozen-гидратной государства Использование крио-электронной томографии

Нейроны установить сложных схем, необходимых для функции центральной и периферической нервной системы по разработке дендриты получать информацию и аксоны, часто довольно длительным, общаться с вниз по течению нейронов. Рост нейритов играет фундаментальную роль в процессе эмбрионального развития и дифференцировки нейронов и поддержания нейритах поддерживает критически функцию нервной системы. Нейритных процессы также имеют критически нейронов травмы и регенерации, а также нервной системы. Изучение нейронов архитектуры важно понять как нормальную и больного мозга. К счастью, физиологически соответствующие нейронные системы клеточных культур существуют, которые могут повторять сложные и гетерогенных клеточных структур. На основе выяснения твердых экспериментальных площадок, эффективных стратегий визуализации, которые позволяют качественный и количественный анализ нейронной морфологии необходимы. Особенно полезно будетбыть подробная методология, которая обеспечивает согласованную платформу для визуализации нейриты, как аксонов и дендритов в нанометровом масштабе.

Традиционный электронная микроскопия требует использования органического растворителя в процессе дегидратации и смолы вложения, которые могут вызывать искажения в образцах от их истинное положение. На сегодняшний день большинство структурные характеризации в нанометровом масштабе основаны на больших клеток или тканей, которые подвергаются таких агрессивных химикатов - таким образом, ограничивающих интерпретацию результатов ^4,9,25. Кроме того, для проникновения электронного пучка, секционирование требуется для организмов или клеточных выступов, обладающих толщину большую, чем 1 мкм ^12. Наконец, срезы или измельченный результаты тканей в набор дискретных срез конкретных наборов данных, что делает обременительным определение удлиненного элемента нейритов. Даже для крио-ЭМ, в котором секционирования с замороженными гашеной образец можно, метод вводит сжатия Artifдействует ^1.

В последние годы исследователи научились выращивать гиппокампа нейронов непосредственно на развивающихся сетей и вспышкой замораживания их в жидком этана впоследствии визуализировать нейриты помощью крио-ET ^8,10,18,23. Тем не менее, такие исследования или использовать на заказ устройство ^10,23, или отсутствие детали на промокательной шага для создания достаточного тонкий стекловидный лед для рутинной визуализации ^8,18. Например, в одном исследовании рекомендует использовать 30-40 сек для декантации EM сетки ^10, однако это значение оптимизирован не для общего пользования, но является специфическим для этого заказного глубоководным заморозки устройства. Использование на заказ устройство, а не имеющийся в продаже один ¹⁷ для поддержания влажности до окунуться заморозки образца может создать препятствие для широкого воспроизводимости.

Хотя эти исследования были новаторским в визуализации нейриты на крио-ЭТ, мы взяли еще один шаг вперед, чтобы исследовать арприменимости из крио-ЭТ к различным нейронных образцов (гиппокампа и задних корешков ганглиев нейронов). Кроме того, мы рассмотрим оба оптимальные и неоптимальные результаты, а также потенциальные артефакты, которые можно было столкнуться с помощью крио-ET для таких образцов.

Определение подробную методику для сохранения и визуализации целые нейриты в нанометровом масштабе в почти родной государства должно расширить возможности для более исследователей осуществлять ультраструктурные исследования. С этой целью мы опишем эффективную и подробный протокол с использованием коммерчески доступного оборудования для подготовки нефиксированные, неокрашенные нейроны визуализировать нейриты. Это важный первый шаг к детализации ультраструктуры здоровых невриты и заложить основу для понимания того, что структурные различия присутствуют в моделях заболевание нервной системы. С крио-ЭТ может решить нефиксированные, неокрашенные особенности аксонов в 3-D в нанометровом масштабе, метод позволит как никогда бытьПоэтому, чтобы определить нейритных архитектуры ^12.

1. Подготовка Посуда с Е. М. сетям для гальванических первичных нейронов

1. Изучите целостность дырявой углерода на золото на развивающихся сеток с использованием светового микроскопа при увеличении не менее 25X. Убедитесь углерода дыры> 98% нетронутыми.
2. Для обшивки первичные нейроны, использовать горелку, чтобы пламя стерилизовать сетки ЭМ и одновременно сделать их гидрофильными. Используйте пинцет, чтобы забрать EM сетку за края, а не центральный решетчатого участка. ВНИМАНИЕ: Никогда не оставляйте зажженную Бунзена горелки без присмотра, и не используйте перчатки или пинцеты с пластиковых компонентов при выполнении действия:
   1. Перед включением горелку, установить настройке воздуха и газа в минимально открытом положении.
   2. Зажгите горелку с помощью форварда кремень или бутан зажигалка.
   3. Измените настройке воздуха и газа для достижения небольшой, синий внутренний огонь внутри повыше, легче синий / фиолетового пламени. Кончик внутренней пламени самая горячая часть пламени. Ручка подНит горелка регулирует количество газа, поступающего в трубу горелки, а ствол горелки могут быть превращены регулировать количество воздуха, поступающего в горелку. Включение регулировки воздуха по часовой стрелке уменьшает воздуха (в результате чего фиолетовым пламенем) и против часовой стрелки увеличивает воздуха (в результате в желтом пламени).
   4. Использование металлических пинцет (не пластиковые части) провести EM сетки, пройти его быстро через пламя дважды, перед углерод-вверх. Боковая углерода появится больше штейна (менее блестящий) и с большим количеством сероватым оттенком, чем другая сторона.
   5. Сразу передачи сетку (углерод-стороной вверх) в центре стеклянным дном блюдо размещается в 10 см от горелку. Используйте одну EM сетку за блюдо (рис. 1). Используйте только с прозрачным дном блюда, которые presterilized, т.е. гамма-излучением.
3. Используйте светового микроскопа, чтобы проверить целостность сетки (углерода отверстия нетронутыми), все еще держа ЭМ сетку внутри стеклянной-Боттаом блюдо (чтобы избежать загрязнения). При применении любого вещества на сетке или что-нибудь, что будет вступать в контакт с нейронами, использовать стерильную порядок и стерильные наконечники пипеток.
4. В капот культуры ткани с использованием стерильной процедуру, применять 250 мкл соответствующего покрывающего вещества медленно и осторожно в центральной части стеклянной чашки Петри. Убедитесь, что соответствующее вещество покрытия охватывает всю EM сетки.
   1. Для нейронов гиппокампа с помощью поли-L-лизин (PLL, 1 мг / мл) в качестве подвижной фазы, полученной, как описано ранее ^19. Обратите внимание, что 250 мкл необходимы в EM сетки, за блюдо, поэтому масштабировать партию соответственно. Для спинной ганглий корень нейронов (DRG), используйте гелеобразную смесь белок выделяется Engelbreth-Холм-Рой (EHS) мыши клеток саркомы (см. Таблицу материалов и реагентов) в качестве покрывающего вещества, подготовьтесь следующим образом. Обратите внимание, что 250 мкл необходимы в EM сетки, за блюдо, поэтому масштабировать партию соответственно.
      1. Оттепель фондовый бутылкуиз желатиновой смеси белок выделяется Engelbreth-Холм-Swarm (EHS) мыши клеток саркомы в течение ночи при 4 ° С.
      2. Держите холодной желеобразные смесь белок выделяется Engelbreth-Холм-Swarm (EHS) мыши клеток саркомы, и всех компонентов, используемых для приготовления раствора, т.е., держа их на льду.
      3. В то время как на льду, разбавить эту гелеобразную смесь белка в Neurobasal среде с получением разбавление 1:20 (т.е. разбавленный 500 мкл желатиновой белковой смеси в 10 мл Neurobasal).
      4. Разделить разбавляют желеобразную смесь белка в 1 мл аликвоты, и сразу же хранить любые дополнительные аликвоты при -20 ° С
      5. Применить 250 мкл на EM сетки, за блюдо, как описано в разделе 1.4.
5. Накройте чашку Петри с его верхней и инкубировать (либо с ФАПЧ для гиппокампа образцов, либо с желатиновой смеси белка для образцов DRG) в течение 1 ч при комнатной температуре в капот культуры ткани.
6. Аспиоценить все PLL (для гиппокампа образцов) или гелеобразную протеиновой смеси (для DRG образцов) из блюд. Чтобы сделать это, используйте вакуумную систему в капот культуры ткани. Используйте стерильный наконечник пипетки, прикрепленный к вакуумной трубки. Избегайте прямого контакта с ЭМ сетки.
7. С помощью регулируемого воздуха смещения пипетку осторожно применять 250 мкл стерильной PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) в EM сетки в центральной области стекла каждую чашку Петри таким образом, что сетка EM полностью покрывается PBS. Тогда, аспирации PBS от каждого блюда. Повторите 3 раза.
8. Позвольте блюда с ЭМ сеток для сушки под капот культуры ткани в течение 15 мин. Убедитесь, что они полностью не высохнут, проверяя под световым микроскопом в комнатной культуре ткани. Убедитесь, что нет пузырьков влаги в сетке. Если это так, тщательно аспирации рядом с EM сетки для устранения этой лишнюю влагу. Сетка покрытием следует использовать сразу для гальванических нейроны.

2. Подготовка и Plating первичных нейронов на EM сетям

1. К пластине первичные нейроны, первый рассекать, Trypsinize (с использованием 2,5% трипсина) и измельченного в порошок диссоциировать гиппокампа (или ганглиев дорзальных корешков 18-дневных эмбрионов крыс) на отдельные клетки, как описано выше ^19.
   1. Triturate является общим термином, используемым для описания нейробиологов диссоциации скопления клеток на отдельные клетки, в частности, путем использования стеклянной пипетки с наконечником огневой полировкой. Результат достигается за счет осторожно и медленно рисования и выпуская клетки, вверх и вниз, несколько раз (~ 30) через пипетку.
2. Следуйте процедурам, ранее описанные для DRG рассечения и выделения клеток ^24, принимая к сведению использовать 0,25% трипсина (в HBSS), чтобы изолировать DRG нейроны крысы, а не использовать ферменты, предложенные (папаин, коллагеназы / диспаза), которые больше подходят для мыши DRG нейроны.
3. Рассчитать количество изолированных нейронов (т.е. использованием гемоцитометра)и использовать это значение для вычисления соответствующего объема клеток для применения в каждую чашку для достижения концентрации 50000 клеток / мл на чашку. Максимальный объем применять составляет 250 мкл. Заметим, что это только заполняет центральную площадь остекления, а не весь блюдо.
4. Выдержите посуду в течение 30 мин в СО _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° С. Разрешить клетки для восстановления и придерживаться.
5. Медленно добавьте 1,5 мл утепленных СМИ к каждому блюду, стараясь не потревожить EM сетки. Тип носителя зависит от типа клеток (гиппокампа или DRG).
   1. Подготовка соответствующий носитель для нейронов гиппокампа либо ¹⁹ или нейронов ганглиев дорзальных корешков ^24, который должен быть нагревают в 37 ° С водяной бане до использования. Выдержите посуду на ночь в СО _{2-инкубаторе.}
   2. Для нейронов гиппокампа, смены носителя на следующий день. Изменение половина СМИ каждые два дня дальнейшими течение 14 дней. Теплый СМИ в 37 ° С водяной бане до использования. Для DRG нейронов, на следующий день после вскрытия / обшивки, подготовить свежий запас СМИ с антимитотические агента (Уридин и 5'-фтор-2'-дезоксиуридина) сделать 10 мМ маточного раствора каждого, отдельно; использовать окончательное концентрации 10 мкМ каждого из них. Удалить половина DRG информации (875 мкл) и добавляют 875 мкл свежей среды с анти-митотического агента.
      1. Для DRG нейронов, каждые два дня в течение первой недели, альтернативный сменить носитель между антимитотические СМИ и стандартной DRG СМИ. Для второй недели, изменить стандартные DRG СМИ каждые два дня.

3. Стеклующихся нейронов на EM сетям

1. Подготовка оборудование и все материалы для замораживания и хранения золото EM сетки при криогенной температуре: а стеклования устройство с влажной камере ^17, тонкой точкой специализированные пинцет для стеклования машины, длинный плоский пинцет, точечных Дьюара (ы) с жидким азотом (LN _2), вoolant контейнер, ящик для хранения ЭМ сетки, кальций без фильтровальной бумаги.
2. Запустите стеклования устройство. Установка влажности до 100% и температуре 32 ° С. В разделе "Консоль", установить время пятно на ноль секунд. Это позволяет руководству промокательной через боковую окна камере влажности стеклованию машины.
3. Обращайтесь с кальцием бесплатно фильтровальную бумагу в перчатках, отводками их таким образом, что три документа укладываются. Разрежьте стек в 0,5 см широкими полосами, которые ~ 2 см длиной. Согните их под углом 90 °, что одна сторона бумаги имеет 0,5 см х 0,5 см лица (рис. 2). С помощью пинцета удалите средний бумагу и поместите ее на другую бескальциевой фильтровальной бумаги до использования.
4. Положите кнопку хранения сетки в держатель кнопки в остекловыванию камеры. Заполните внутреннюю камеру контейнера охлаждающей жидкости с жидким азотом и подождать до полного испарения. Заполните внешнюю камеру гое охлаждающей жидкости контейнер с жидким азотом, пока она не достигает стабильной температуры для перехода к следующему шагу. Заполните внутреннюю камеру с высокой чистоты газообразного этана, который будет конденсироваться в жидком состоянии в охлаждаемой камере.
5. Переместите тарелку (адреса) из инкубатора в значительной 100 мм полистирола блюдо для транспортировки в остекловыванию комнате, если не в непосредственной близости. Используйте специализированные пинцет стеклования тщательно выбрать EM сетку из чашки. Примечание какой стороны нейроны растут на EM сетки; позиция будет иметь значения для следующего шага. Используйте черный скользящий замок на пинцета надежно запирает пинцет на EM сетки.
6. Вставьте пинцет в стеклования машины таким образом, чтобы стороны от EM сетки, на которой нейроны придерживался лица слева, от бокового открытия отверстие стеклования машины. Уберите специализированные пинцетом в остекловыванию машины.
7. Поместите контейнер охлаждающей жидкости в соответствующем держателеиз стеклования машины. Это должны быть заполнены с адекватной LN ₂ и жидкого этана. Использование соответствующую команду экрана стеклования машины, поднять камеру охлаждающей жидкости вверх, пока он не промыт в нижней части камеры влажности.
8. С плоских точечных пинцетом, понять один край фильтровальной бумаги такого, что короткая сторона (в 0,5 см х 0,5 см лицо) перпендикулярна помощью пинцета. Это лицо будет вступать в непосредственный контакт с EM сетки для блоттинга (рис. 2б). Осторожно вставьте фильтровальную бумагу в боковой отверстие камере влажности стеклованию машины (рис. 2А). Стабильно держать бумагу против EM сетки (сторона, обращенная в сторону от образца) на 10 сек. Откажитесь бумагу позже и сразу окунуться-заморозить образец в жидком этана с использованием средств автоматизации стеклованию машины.
9. Осторожно перенести замороженные гидратированных EM сетки в один из слотов в одном изКнопки хранения сетки. Повторите эту процедуру для дополнительных сеток ЭМ в блюдах. Кнопки хранения сетки EM, используемые в этих экспериментах можно хранить несколько замороженных гидратированных сетки ЭМ.

4. Коллекция изображений, обработку и Аннотация

1. Продолжать собирать 2-D электронные микрофотографии и / или наклона серии 3-D ⁵ из невриты, используя крио-электронного микроскопа при условии низких доз. В 2-D изображения были предназначены, чтобы оценить качество сетки с точки зрения толщины льда и возможных областях, чтобы быть полезным для наклона серии 3-D.
   1. В этом случае, все изображения были собраны с помощью ПЗС-камеры 4k 4k х, прикрепленный к электронным 200 кВ микроскопа, снабженного одной держателя наклона жидкий азот передачи крио, при увеличении микроскопа 20k в цель дефокусировки 7 мкм и отбора проб 4,4 A / пиксель.
   2. Для получения 3D томограмма образца, принять ряд проекционных изображений в то время как постепенно наклоняя образец альОнг одна ось из просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). Учитывая углы наклона и другие экспериментальные установки, существует несколько различных программного обеспечения, доступные для автоматического сбора наклона серии ^5. Наклон серии 3-D показано здесь были собраны на одном микроскопе с помощью полу-автоматизированное программное обеспечение сбора наклона серии 26 в диапазоне -60 ° до 60 ° при 5 ° с шагом с накопленной дозы ~ 60 E / A ^2.
2. Реконструировать наклона ряд нейриты с использованием программного обеспечения для обработки изображений ^21, как описано выше для других образцов ^5,29.
3. Цвет-аннотировать 3-D черты невриты, сначала сегментации томограмму и создания модели поверхности с помощью программного обеспечения для обработки изображений 3-D, как описано выше ^5.

До замораживания и обработки изображений с помощью крио-ЭТ, световым микроскопом изображения должны быть приняты в EM сетки, на которой нейроны растут. Нейриты должен быть отчетливо виден без существенных перекрытия друг с другом. Цветной блок на фиг.3А представляет собой область, которая будет увеличено в показать большее увеличение на фиг.3В, в котором нейритов проходить по решетчатой ​​сетки. Каждая сетка-квадрат состоит из дырявой углеродной пленки, которая поддерживает нейроны и их нейриты. Эти отверстия являются очевидными в низких дозах крио-ЭМ изображения, принятым на увеличения 4k, который показывает тело нейрона как относительно большой, темный, электронно-плотного объекта (рис. 3C), из которого нейриты проект наружу.

Часть аксонов отдыха над отверстием в углерода выбран в цветном поле в фиг.3С, и в масштабе в с большим увеличением (20k) в фиг.3Г. В это увеличение, четкие внутренние клеточные структуры, включая микротрубочек, везикулы и митохондрии должны быть очевидными (рис. 3D), особенно в оптимально тонкого льда, сгенерированный после этого протокола. Темные черные структуры в центре изображения (рис. 3D) являются шестиугольные ледяные частицы, которые считаются загрязнения и должны, как правило, следует избегать, однако, учитывая, что они очень редкие и за пределами самих невриты, они не мешают реконструкция и цвет-аннотации внутренних структур для анализа и интерпретации (рис. 4). Еще в низких дозах, низкий увеличенное изображение показано на рисунке 5, из которого аксонов могут быть расположены, после чего несколько 2-D изображения могут быть приняты и цифровой сшитые вместе, используя программное обеспечение для обработки изображений для создания монтаж (рис. 6).

Первоначальныйнизкая концентрация покрытие (50000 клеток / мл на чашку) нейронов на сетках ЭМ позволяет нейронов, которые расположены достаточно далеко друг от друга, чтобы обеспечить четкую визуализацию их невриты (рис. 3C); концентрации выше, чем рекомендуется (> 50,000 клеток / мл на чашку ) может привести к неоптимальных изображений густонаселенных нейритов, которые трудно проследить или атрибута клеточные компоненты (фиг. 7В и 7С).

Рисунок 1. Схема для выращивания нейронов на развивающихся сетей внутри стеклянным дном блюда. (А) стеклянным дном блюда показаны, частично заполнена ячейка СМИ (розовый). (В) Каждое блюдо содержит один золотой EM сетки, как ближе вид показывает. (C) Нанесение на EM сетки с поли-лизина показан в виде мультфильмов боковой разрезе. Стеклянным дном тарелки состоит из квадратной покровным стеклом, который прикреплен к нижней части пластиковой чашки для культивирования, охватывающих круглое отверстие, который был первоначально вырезать из нижней части. Эти стеклянным дном блюда гамма-стерилизации и коммерчески купил как Premade. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2. Схема для ручного блоттинга EM сетки с нейронами придерживались. (А) Крупным планом скольжения щель ввода стеклованию машины (черная стрелка) к влажности / промокательной камере, в которой пинцет будет вставлен, чтобы уничтожить образца вручную. (B)Мультфильм схема, показывающая, как кальций без фильтровальной бумаги (0,5 см х 0,5 см лицо) должны быть обработаны с использованием плоским точкой пинцет с и вставляется через щель ввода в влажности камеры стеклования машины для декантации ЭМ сетку, на которой нейроны привязаны (капелька розового клеточных сред показаны). Е.М. сетки проводится путем тонкой точечных специализированных пинцетом внутри камеры влажности. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3. Визуализация замороженные, гидратированных нейроны на золотом электронной микроскопии (ЭМ) сетках. (А) Свет микроскопическое изображение на 10-кратным увеличением центральной области ЭМ сетки, на которой крыса первичные нейроны были Грукрыло в течение 2 недель. (B) увеличенный вид части коробки, показанной на аква (а), в которых нейроны и их нейритов проекции видно (розовые стрелки). (C) Электронная микрофотография в 4K увеличением в нейрита выступающей наружу от тела нейрона (красная стрелка). Схематически соответствует области (то есть красной коробке) в одном из квадратов сетки, показанных на (B). Синяя коробка рассматривается крупным планом в (D), где внутренние особенности нейритов хорошо видны на 20k увеличении (зеленая стрелка митохондрии; оранжевые микротрубочки стрелками; пузырек синяя стрелка). Щелкните здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 4. 3-D реконструкция и аннотации крысы DRG аксона томограммы. (А) Томографическая ломтик от реконструированном стопку снимков, сделанных под разными углами наклона одного DRG аксона. (В)-корреспондент 3-D аннотации того же аксона. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 5. 2-D крио-ЭМ образ крысы DRG нейрона (левоцентристской) с аксонов проекций (Red Box) на увеличения 4k. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 6. Монтаж четырех 2-D крио-ЭМ изображений одной крысы DRG аксона. Каждое изображение было принято на 20k увеличения. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 7. 2-D крио-ЭМ образы невриты. (А) Крыса DRG аксонов в образ ближе в непосредственной близости от клеток сомы. (В, С) Примеры перенаселенность нейритов из-за высокой концентрации покрытия нейронов на развивающихся сетей. Все нейриты были флеш заморозки две недели после посева на золото на развивающихся сетей. Все снимки были сделаны в 20k;. Увеличение Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Рисунок 8. 3-D реконструкция и аннотации из гиппокампа крысы невритного томограммы. (А) Томографическая ломтик от реконструированном стопку снимков, сделанных под разными углами наклона одного гиппокампа нейрита. (В)-корреспондент 3-D аннотацию же нейрита. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.