Методическая статья

Одновременное электрофизиологические записи и Кальций изображений супрахиазматического ядра нейронов

DOI:

10.3791/50794

⸱

8 декабря 2013 г.

 , 
1Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology, Oregon Health & Science University, 2Department of Behavioral Neuroscience, Oregon Health & Science University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описаны процедуры для одновременной регистрации мембранного потенциала или тока и изменения внутриклеточной концентрации кальция. Нейроны супрахиасматического ядра заполняются индикатором кальция bis-fura-2 с помощью электрода-патч-хомута во всей конфигурации клеточного патч-хомута.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одновременные методы электрофизиологической и флуоресцентной визуализации были использованы для изучения роли изменений мембранного потенциала или тока в регуляции внутриклеточной концентрации кальция. Изменяющиеся условия окружающей среды, такие как цикл света и темноты, могут модифицировать активность нейронов и нейронных сетей, а также экспрессию семейства генов циркадных часов в супрахиазматическом ядре (SCN), расположении главных циркадных часов в мозге млекопитающих. Возбуждающая синаптическая передача приводит к увеличению постсинаптической концентрации Ca2+, которая, как полагают, активирует сигнальные пути, изменяющие ритмическую экспрессию генов циркадных часов. Срезы гипоталамуса, содержащие СХЯ, зажимали с помощью микроэлектродов, заполненных внутренним раствором, содержащим индикатор кальция бис-фура-2. После того, как между микроэлектродом и мембраной нейрона SCN было образовано уплотнение, мембрана разрывалась с помощью мягкого отсасывания, и кальциевый зонд диффундировал в нейрон, заполняя как сому, так и дендриты. Количественные ратиометрические измерения внутриклеточной концентрации кальция регистрировались одновременно с мембранным потенциалом или током. С помощью этих методов можно изучить роль изменений внутриклеточной концентрации кальция, вызываемых синаптической активностью и потенциалом действия отдельных нейронов. В этой презентации мы демонстрируем методы одновременной регистрации электрофизиологической активности вместе с внутриклеточным кальцием от отдельных нейронов SCN, содержащихся в срезах мозга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Известно, что изменения в экспрессии генов происходят в нейронах как следствие синаптической сигнализации. Передача сигналов возбуждающим нейромедиатором глутаматом может деполяризовать потенциал нейронной мембраны, что в конечном итоге приводит к транскрипции и трансляции генов1,2. Активация ионотропных рецепторов глутаматом позволяет внеклеточным ионам кальция проникать в клетку, что, как полагают, играет важную роль в качестве второго посредника в активации транскрипции генов. Оценка взаимосвязи между электрической активностью мембраны, такой как частота возбуждения потенциала действия, и изменениями внутриклеточной концентрации кальция требует комбинации двух методов - зажима целого клеточного участка и количественной визуализации флуоресцентных зондовкальция 3-5, что позволяет изучить взаимосвязь в отдельных нейронах. Метод записи одиночных клеток позволяет регистрировать активность отдельных нейронов в идентифицируемых частях мозга. Метод записи всей клетки позволяет контролировать напряжение или ток мембраны, что позволяет экспериментально манипулировать определенными токами ионных каналов. Использование микропипеток, наполненных флуоресцентными зондами кальция, также гарантирует, что нейрон хорошо заполнен зондом кальция. Этот метод имеет явное преимущество при работе с препаратами срезов мозга из препаратов срезов взрослого человека, поскольку эти нейроны особенно трудно загрузить с помощью более распространенных зондов, пермированных клетками, и снижает потенциальные проблемы фоновой флуоресценции6-8.

Свет - это основной способ, которым млекопитающие настраивают свои циркадные часы, которые расположены в гипоталамическом супрахиазматическом ядре (SCN). Световая информация, передаваемая в сетчатке, передается 9-11 через ретиногипоталамический тракт (RHT), где глутамат высвобождается в SCN12,13. Глутамат открывает ионотропные рецепторы NMDA и AMPA, расположенные на нейронах SCN, вызывая приток кальция и натрия и инициируя внутриклеточный сигнальный каскад, который в конечном итоге приводит к изменению экспрессии семейства часовых генов14-17 и сдвигам в фазе циркадных часов18-20. Тем не менее, кальций может проникать в нейроны либо непосредственно через ионотропные глутаматные рецепторы, либо через деполяризацию мембраны и активацию потенциал-зависимых кальциевых каналов (VDCC)21. Поэтому мы разработали экспериментальный протокол для изучения взаимосвязи между внутриклеточной концентрацией кальция и мембранной электрической активностью в нейронах СХЯ, которая происходит при возбуждении потенциала действия и от синаптического входа22.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление срезов мозга гипоталамуса

  1. Заранее получите одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) для любой процедуры, связанной с животными. Описанные здесь процедуры на животных соответствуют Рекомендациям AVMA по эвтаназии животных 2013 года и были заранее одобрены IACUC Орегонского университета здоровья и науки.
  2. Приготовьте 500 мл буфера для нарезки без MgCl2 и CaCl2 (Таблица 1). Взбейте раствор с 95%O2 и 5% CO2 при комнатной температуре, затем добавьте MgCl2 и CaCl2, продолжая аэрировать. Отрегулируйте осмолярность до 300 мОсм с помощью сахарозы. Осмолярность измеряют с помощью осмометра давления пара.
  3. Приготовьте 1 л носителя для записи без MgCl2 и CaCl2 (Таблица 2). Взбейте раствор с 95%O2 и 5%CO2, затем добавьте MgCl2 и CaCl2, продолжая аэрировать. Отрегулируйте pH до 7,2-7,4 с помощью NaOH (10 N) и осмолярность до 300 мOsm с помощью сахарозы. Добавление буфера HEPES является необязательным и используется для дальнейшей стабилизации pH.
  4. Решения для нарезки и записи можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней перед использованием.
  5. Приготовьте 3% агарозу и вылейте в стерильную чашку Петри (глубиной 6 мм) и поставьте в холодильник.
  6. Нарежьте три кубика агарозы примерно 6 мм х 6 мм х 6 мм.
  7. Глубоко обезболите четырех-восьминедельную крысу Sprague-Dawley изофлураном. Тест на глубину анестезии. Глубина анестезии считается целесообразной, когда отсутствует рефлекс отмены задней конечности после защемления подушечки стопы. После соответствующей анестезии крысу усыпляют путем быстрой обезглавливания.
  8. Быстро удалите мозг, осторожно перерезав сначала зрительные нервы, и поместите в ледяной раствор для нарезки, насыщенный 5%CO2 и 95%O2, и дайте остыть в течение 2-3 минут.
  9. Обрежьте мозг. Поместите мозг с помощью щипцов на смоченную (с нарезкой раствором) круглую фильтровальную бумагу, набор на стеклянную чашку Петри, лежащую на льду.
  10. Разрежьте корональный мозг, чтобы удалить оставшийся мозжечок и ствол мозга, затем ростральную кору и боковые стороны, чтобы оставить блок мозга, содержащий гипоталамус, тщательно сохраняя сторону, содержащую СХЯ, зрительные нервы и зрительный нерв
    11. .
  11. Нанесите тонкий слой цианоакрилового клея, достаточно большой, чтобы прикрепить мозг и агарозные блоки, в ледяную, но сухую камеру для нарезки микротомов.
  12. Перенесите ледяную мозговую блоку каудальной стороной вниз на клей стороной, содержащей SCN, расположенной для резки, сначала так, чтобы зрительные нервы образовали букву «V», направленную вверх.
  13. Поместите агарозные блоки с остальных 3 сторон. Заполните камеру ледяным буфером для нарезки, непрерывно пузырчатым 5%CO2 и 95%O2. Цианоакриловый клей затвердеет под воздействием влаги, удерживающей мозг и агарозные блоки на месте.
  14. Разрезать срезы коронального гипоталамуса (толщиной 220-250 мкм), содержащие SCN, с помощью микротома с вибрирующим лезвием. Как правило, срез выбирается там, где зрительный хиазма составляет около 2-4 мм в поперечнике, проявляясь как белая полоса с СХЯ только дорсально, проявляющаяся в виде двух небольших «углублений» в зрительном хиазме по обе стороны от3-го желудочка (рис. 1А).
  15. Поместите срезы в записывающую камеру (36 °C), установленную на предметном столике микроскопа Leica DMLFS. Камера заполняется непрерывно текущим раствором для записи (2 мл/мин), аэрируется 95%O2 и 5%CO2 и предварительно нагревается с помощью встроенного нагревателя.
  16. Выполните запись клеточного зажима и визуализации кальция в нейронах СХЯ через 0,5-8 ч после подготовки среза.

2. Запись патч-зажима

  1. Приготовьте раствор электрода (внутриклеточный) раствор в половину общего конечного объема воды.
  2. Отрегулируйте раствор до pH 7,3 с помощью KOH (1 N).
  3. Добавьте оставшуюся воду. Конечная осмолярность раствора должна находиться в пределах 280-290 мОсм.
  4. Пропустите раствор электрода через фильтр 0,2 мкм, аликвоту (0,5 мл) в микрофуговые пробирки и храните при температуре -20 °C.
  5. Приготовьте раствор массы гексакалийной соли кальциевого зонда bis-fura-2 (10 мМ), смешав 1 мг гексакалийной соли bis-fura-2 с 99,29 мкл 0,2 мкм фильтрованной воды.
  6. Разложить по отдельным пробиркам (по 2-5 мкл каждая) и заморозить (-20 °С).
  7. Разморозьте аликвоту внутреннего раствора и щуп Ca2+ незадолго до использования. Добавьте 2 мкл стокового раствора бис-фура-2 в 400 мкл внутреннего раствора для получения конечной концентрации кальциевого зонда 50 мкМ. Коротко растирайте растворы. Концентрация кальциевого зонда (10-250 мкМ) варьируется в зависимости от дизайна эксперимента и системы визуализации. Обратите внимание, что бис-фура-2 состоит из двух связанных молекул фура-2.
  8. Протягивайте целоэлементные патч-электроды в два этапа на внешний диаметр наконечника примерно 1 мкм и сопротивление 7-10 МОм при заполнении внутриклеточным раствором.
  9. Заполните электрод несколькими мкл внутреннего раствора, содержащего кальциевый зонд, отфильтрованный с помощью шприцевого фильтра 4 мм (0,2 мкм) для образцов небольшого объема через пробирку Microfil.
  10. Приложите небольшое положительное давление к электроду, когда он направляется в записывающую камеру под красным светом при просмотре на видеомониторе.
  11. Поместите микроэлектрод на SCN с помощью объектива с низким энергопотреблением (4X). СХЯ идентифицируется как две полупрозрачные области по обе стороны от третьего желудочка и дорсально по отношению к хиазме зрительного нерва (рис. 1А).
  12. Переключите микроскоп в режим увеличения большой мощности (40X или 63X). Субрегионы СХЯ и отдельные нейроны СХЯ могут быть нацелены на регистрацию при более высоком увеличении.
  13. Слегка надавливайте на микроэлектрод по мере его продвижения по поверхности нейрона.
  14. Слегка надавите на микроэлектрод, чтобы сформировать уплотнение с сопротивлением 3-10 ГОм.
  15. Отрегулируйте напряжение мембраны до -60 мВ с помощью усилителя, управляемого с помощью программного обеспечения для сбора данных.
  16. Приложите дополнительное отрицательное давление к электроду, чтобы разорвать клеточную мембрану до целого клеточного режима.
  17. При переходе в режим всей клетки сома и дендриты SCN нейроны и дендриты заполняются флуоресцентным зондом.
  18. Напряжение мембраны измеряется в режиме тока-зажима или тока в режиме тока-клещи, в то время как данные изображения кальциевого зонда контролируются и сохраняются (описано ниже). Просмотрите полученные изображения вместе с графиком соотношения 340 нм/380 нм флуоресценции во время эксперимента.

3. Измерение внутриклеточного Ca2+

  1. Количественные измерения Ca2+ получены путем записи пары изображений путем быстрого возбуждения ткани ультрафиолетовым светом на длинах волн 340 нм и 380 нм с помощью монохронометра с полосой пропускания 10 нм и пропускания через оптический фильтр UG11 для ограничения гармонических длин волн выше 400 нм, дихроичного света DCLP длиной волны 400 нм и излучаемого света через эмиссионный фильтр 510±40 нм.
  2. Изображения получаются с помощью охлаждаемой ПЗС-камеры с отрегулированным временем сбора данных и группированием, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание и увеличить скорость записи.
  3. Программное обеспечение для количественной визуализации используется для получения и отображения изображений.
  4. Выберите интересующие области исходного изображения, которые будут преобразованы в данные единиц измерения относительной интенсивности флуоресценции (например, сома, дендрит и т. д.). Также выберите область для измерения фоновой флуоресценции (рис. 1B).
  5. Необработанные изображения и количественные оптические данные постоянно сохраняются во время эксперимента. После эксперимента сохраненные изображения, как правило, повторно анализируются, когда может потребоваться больше времени для более точного выбора областей, представляющих интерес для количественной оценки.
  6. Данные могут быть представлены в виде расчетной внутриклеточной концентрации кальция (Est[Ca2+]i). Длярасчета концентрации кальция используется отношение (R) испускаемого света после возбуждения и фонового вычитания на длине волны 340 нм, деленное на 380 нм, а также максимальную и минимальную флуоресценцию на длинах волн 340 нм и 380 нм4. Фоновое вычитание и другие расчеты выполняются с помощью программного обеспечения для анализа данных.
  7. Определение in vitro максимальной и минимальной флуоресценции бис-фура-2 может быть выполнено с использованием 10 мМ CaCl2 для связанного Ca2+ и 10 мМ EGTA для Ca2+ свободных условий. Константа диссоциации Ca2+, Kd зонда, принимается равной 370 нМ для bis-fura-2 (Invitrogen).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя срезы мозга гипоталамуса, мы одновременно регистрировали изменения внутриклеточного кальция в режиме всей клетки как в условиях напряжения, так и в условиях тока. Микроэлектрод, показанный на рисунке 1A, опускают в положение при большом увеличении (40-кратное или 63-кратное УФ-объективы) с небольшим количеством приложенного положительного давления. После прикосновения к нейрону при мягком отсасывании образуется гигаомное уплотнение. В режиме потенциал-зажим после установки потенциала мембраны я...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанные выше методы являются мощным инструментом для одновременной регистрации связи между электрической активностью мембраны нейронов и внутриклеточной концентрацией кальция. Метод имеет ряд преимуществ в том, что он сочетает в себе два очень хорошо охарактеризованных метода - запись клеточного патча и измерение внутриклеточного кальция с помощью флуоресцентных красителей. Наш подход аналогичен описанным другими исследователями6,23.

При использовании метода необходимо ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа финансировалась за счет гранта Национального института общих медицинских наук (GM096972).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NaClFisher Scientific Co.S271-3
KClFisher Scientific Co.P217-500
2PO4• H2OSigma Chemical Co.S-9638
MgCl2• 6H2OFisher Scientific Co.M33-500
CaCl2• 2H2OFisher Scientific Co.C79-500
D-глюкозаFisher Scientific Co.D16-500
NaHCO3Fisher Scientific Co.S233-500
СахарозаФишер Сайентиал Ко.S5-500
D-глюконат калияSigma-AldrichG4500
HEPESSigma-AldrichH4034
Аденозин 5′-трифосфат дикалия соль дигидратSigma-AldrichA8937
Гуанозин 5′-трифосфат трис сольSigma-AldrichG9002
Агароза (ультрачистая)Life Технологии15510-027Гель пористый в стерильную чашку Петри толщиной 6 мм
слой KOHSigma-AldrichP-6310
NaOHSigma-AldrichS-5881
Bis-fura-2, гексакалийная сольInvitrogenB6810Cell impermeans
Наименование оборудованияКомпанияНомер в каталогеКомментарии
MicrotomeLeicaVT1000SСрезка тканей
Цианоакриловый клей (Roti-Coll1)Carl Roth GmbH+CoArt-Nr. 0258.1
Съемник микроэлектродовNarshige International СШАPP-83
Микроэлектродные капиллярные трубкиWorld Precision Instruments1B150F-4
Microfil 34 гWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Шприц-фильтрCorning#431212
МикроскопLeicaDM LFSс объективами 4X, 40X UV и 63X UV объективами, а также эпифлуоресцентной
CCD камеройHamamatsuORCA ER12 бит CCD
Fura-2 Filter CubeChroma71500AНабор с фильтром UG11
Polychrome IVTill Photonics GmBHMonochronometer
Защитные очки, блокирующие ультрафиолетУльтрафиолетовые продукты
Усилитель EPC-9HEKA Eletronik
MetafluorMolecular DevicesПрограммное обеспечение для визуализации
PatchmasterHEKA EletronikПрограммное обеспечение для сбора данных
Игорь версия 6WavemetricsЭлектрофизиология и Ca2+ Анализ данных
VAPRO 5520WestcorОсмометр давления паров

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. Science. 260, 181-186 (1993).
  2. Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. Calcium regulation of gene expression in neuronal cells. J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).
  3. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  4. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  5. Higley, M. J., Sabatini, B. L. Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations. Neuron. 59, 902-913 (2008).
  6. Colwell, C. S. Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).
  7. Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).
  8. Irwin, R. P., Allen, C. N. GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network. Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).
  9. Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock. Science. 295, 1070-1073 (2002).
  10. Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 295, 1065-1070 (2002).
  11. Hartwick, A. T., et al. Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells. J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).
  12. Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).
  13. Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).
  14. Shigeyoshi, Y., et al. Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript. Cell. 91, 1043-1053 (1997).
  15. Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light. Cell. 91, 1055-1064 (1997).
  16. Yan, L., Silver, R. Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts. Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).
  17. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation. Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).
  18. Ding, J. M., et al. Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 266, 1713-1717 (1994).
  19. Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide. J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).
  20. Ding, J. M., et al. A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock. Nature. 394, 381-384 (1998).
  21. Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse. J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).
  22. Irwin, R. P., Allen, C. N. Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons. J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).
  23. Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging. Methods. 18, 215-221 (1999).
  24. Spruston, N., Johnston, D. Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons. J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).
  25. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).
  26. Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).
  27. Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons. J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).
  28. Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations. Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).
  29. Poenie, M. Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction. Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Bis fura 2

Похожие статьи