Методическая статья

Электроактивные микробные биопленки, полученные из сточных вод: рост, поддержание и основные характеристики

16.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50800

⸱

29 декабря 2013 г.

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

В этой статье

Краткое содержание

Показано хроноамперометрическое выращивание анодных электроактивных микробных биопленок в реакторе периодического действия с использованием трехэлектродной установки, управляемой потенциостатом. Внеклеточный перенос электронов характеризуется с помощью циклической вольтамперометрии в присутствии донора электронов и в его отсутствии. Продемонстрирован фундаментальный анализ данных.

Аннотация

Рост анодных электроактивных микробных биопленок из инокуляции сточных вод в реакторе с подачей шихты демонстрируется с использованием трехэлектродной установки, управляемой потенциостатом. Таким образом, использование потенциостатов позволяет точно регулировать электродный потенциал и обеспечивает воспроизводимые условия культивирования микроорганизмов. Во время роста текущее производство контролируется с помощью хроноамперометрии (КА). На основе этих данных обсуждаются максимальная плотность тока (jmax) и кулоновская эффективность (CE) в качестве мер для определения характеристик биоэлектрокаталитических характеристик. Циклическая вольтамперометрия (КВ), неразрушающая, т.е. неинвазивный метод, используется для изучения внеклеточного переноса электронов (ЭЭТ) электроактивных бактерий. Измерения сердечно-сосудистых заболеваний проводятся на анодных биопленочных электродах в присутствии микробного субстрата, т.е. условиях оборота, а при отсутствии подложки, т.е. условиях отсутствия оборота, с использованием различных скоростей сканирования. Впоследствии приводится пример анализа данных, а также выводятся и объясняются фундаментальные термодинамические параметры микробной ЭЭТ: пиковый потенциал (Ep), пиковая плотность тока (jp), формальный потенциал (Ef) и пиковое разделение (ΔEp). Кроме того, рассматриваются ограничения метода и современный уровень анализа данных. Таким образом, данная видео-статья должна дать руководство по основным этапам эксперимента и фундаментальному анализу данных.

Введение

Выяснение основ микробного внеклеточного переноса электронов (ЭЭТ) и его использование в инженерных системах является жизненно важной и быстро развивающейся областью исследований и разработок1-3. Изучение этих электроактивных (или биоэлектрокаталитических или электрохимически активных) микроорганизмов, включая чистые штаммы, а также определенные совместные культуры и сложные консорциумы, требует сложного арсенала техник, методов ипротоколов. Эти методы основаны на различных научных дисциплинах, таких как электрохимия, материаловедение, микробиология, и дают представление о различных иерархических уровнях, т.е. от всей микробной биопленки до отдельных молекул. Таким образом, электрохимия и электрохимические методы представляют собой основу всей деятельности.

Традиционно, установки типа топливных элементов часто использовались для выращивания и поддержания электроактивных микробных культур в архетипе этих инженерных систем: микробных топливных элементах (MFC)5. К сожалению, эти типы MFC часто не позволяли контролировать или даже управлять потенциалом одного электрода, и, таким образом, было возможно лишь ограниченное понимание электродных процессов - сообщалось только о напряжении ячейки. В настоящее время все больше и больше признается, что индивидуальный мониторинг и управление потенциалами одиночных электродов в МФЦ представляет собой явное преимущество не только для фундаментальных исследований, но и для инженерии. Кроме того, с диверсификацией применений микробных электрохимических технологий, которые в настоящее время включают, например, опреснение, синтез и даже биокомпьютинг, в так называемых микробных биоэлектрохимических системах (BES)2,6,7 внешний контроль потенциалов отдельных электродов часто становится существенным. Такое управление обычно достигается с помощью внешних источников питания или потенциостатов. Таким образом, использование потенциостатов позволяет, в отличие от других типов установок, точно регулировать потенциал отдельного электрода. Это имеет большое значение, поскольку электрод представляет собой концевой микробный акцептор электронов (для анодов) или донор электронов (для катодов) внеклеточного переноса электронов. На рисунке 1 показано текущее состояние знаний о микробной ЭЭТ на анодах - см. подробнее, например, 2,4,6,8,9 ЭЭТ на катоде все еще в основном неиспользуется10.

Таким образом, управление электродным потенциалом позволяет не только использовать воспроизводимые условия микробного культивирования, но и адаптировать его с точки зрения термодинамики ЭЭТ11. В данной статье показано, как можно извлечь характерные параметры электроактивных микробных биопленок из экспериментов с реактором периодического действия с использованием хроноамперометрии (КА) и циклической вольтамперометрии (ХВ). Это включает в себя рабочие параметры, максимальную плотность тока (j,max) и кулоновскую эффективность (CE), а также характеристики EET. При этом основное внимание будет уделяться идентификации формальных потенциалов (Ef) возможных и фактических сайтов переноса электронов. Экстракция этих параметров показана на примере биопленок смешанных культур, полученных из сточных вод, в которых преобладает спецификация Geobacter. 12 Эти биопленки, полученные из сточных вод, получают с помощью простой процедуры электрохимического отбора, как это продемонстрировали многочисленные исследовательские группы по всему миру13-16.

Динамические электрохимические методы для изучения микробного внеклеточного переноса электронов

Для термодинамической характеристики ЭЭТ электроактивных микробных культур необходимы динамические электрохимические методы. В общем случае эти методы включают в себя потенциально-управляемые, т.е. вольтамперометрические, и управляемые током, т.е. гальванодинамика, техника17. Таким образом, методы с контролируемым потенциалом более распространены и включают, например, вольтамперометрию с прямоугольным диапазоном и вольтамперометрию18 с линейной разверткой. Однако наибольшей популярностью пользуется циклическая вольтамперометрия (ХВ)19,20. CV хорошо известен и широко распространен в различных областях электрохимии, начиная от исследований аккумуляторов и материаловедения и заканчивая биоэлектрохимией ферментов. Его применение к живым микробным клеткам может быть датировано более чемодним десятилетием назад и значительно возросло в последние годы23,24. В частности, сочетание CV и спектроскопических методов дало беспрецедентное понимание механизмов ЭЭТ и ее молекулярной природы, например.25,26 Параллельно теоретическая основа для извлечения термодинамических и теоретических характеристик микробной ЭЭТ была расширена и углублена27-30. Однако, с другой стороны, неправильная работа с экспериментами или неадекватный анализ данных часто препятствуют надлежащему применению CV в области микробной биоэлектрохимии. Таким образом, в дополнение к семинарам (например, на EU-ISMET 2012) и семинарам19, эта видеостатья предоставит базовое руководство по проведению циклических вольтамперометрических экспериментов на электроактивных бактериях. Таким образом, он фокусируется на основных экспериментальных шагах и фундаментальном анализе данных и не предназначен для предоставления новейших протоколов кинетического анализа. Наиболее важные термины для последующего обсуждения кратко изложены во Вставке 1 (адаптировано из Harnisch and Freguia19 и изменено).

Протокол

Поскольку процедура отбора в биоэлектрохимическом реакторе периодического действия очень специфична из-за выбора субстрата и бескислородных условий, работа в стерильных условиях не является необходимой для продемонстрированного примера.

1. Подготовка питательной среды

  1. Приготовьте подходящее количество питательной среды, используя фосфатный буфер в соответствии с Kim et al.13 (см. таблицу 1). Здесь в качестве субстрата служит ацетат натрия (10 мМ). Используемая в данной статье питательная среда является лишь одним из примеров, и в зависимости от цели эксперимента может различаться по своим компонентам.
  2. Добавьте 1 мл первичных сточных вод на 20 мл питательной среды в качестве посевного материала. Проба сточных вод отбирается с муниципальной станции очистки сточных вод после механической фильтрации (см., например, рис. 2) и может храниться до трех месяцев до использования в закрытом контейнере при температуре 4 °C.
    (Примечание: В зависимости от цели эксперимента точное начальное количество клеток может быть важным, а затем должно быть определено. В показанном примере начальное количество клеток не имеет значения, так как биопленка достигает стационарного состояния.)
  3. Промойте среду, включая посевной материал, азотом в течение не менее 30 минут, чтобы деаэрировать ее, вставив иглу в среду, и включите струю азота. Струя должна быть достаточно сильной, чтобы можно было наблюдать полное перемешивание среды.
    (Примечание: В зависимости от объема среды следует даже подумать о продлении времени деаэрации. Во время деаэрации настройка реактора периодического действия (этапы 2.1-2.2))

2. Настройка реактора Fed-batch

  1. Возьмите подходящий корпус реактора - здесь используется модифицированная колба с круглым дном объемом 250 мл с 4 горлышками><. (Примечание: Как правило, судно должно иметь не менее четырех входных отверстий. Они необходимы для трех электродов и для отбора проб/замены среды. При регулярном открытии реактора из-за отбора проб или смены среды можно пренебречь объемами добываемого газа, в качестве альтернативы следует установить счетчик пузырьков. Во избежание нежелательного фототропического роста реакторы должны быть защищены от прямого воздействия света.)
  2. Для трехэлектродной конфигурации (подробнее см. Рисунок 3 и раздел 3) поместите электрод сравнения (RE) (здесь Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 В против SHE), рабочий электрод (WE) и противоэлектрод (CE) в колбе через отдельные входы через силиконовые пробки – герметичное уплотнение.
    (Примечание: В качестве WE и CE используются графитовые стержни. Провод электродов протягивается через силиконовую пробку и фиксируется снаружи. Электрод сравнения вводится через силиконовую пробку через просверленное отверстие. Во избежание короткого замыкания убедитесь, что электродов нет физического контакта даже при перемешивании или рециркуляции среды. Размещайте электроды так, чтобы они были полностью покрыты раствором среды. Для герметизации оберните силиконовую пробку каждого входного отверстия парапленкой.)
  3. Залейте питательную среду вместе с инокулятом (в данном случае 250 мл) через отверстие для отбора проб в реактор при промывке азотом.
  4. Закройте последнее входное отверстие силиконовой пробкой и герметично закройте его. Примечание: Следы кислорода не повредят биопленкам смешанных видов. Они способны выдерживать и даже потреблять низкий уровень кислорода, что, в свою очередь, может снизить КЭ.

3. Хроноамперометрический рост биопленки

  1. Подключите электроды к соответствующим кабелям потенциостата. Поместите сосуд в камеру с регулируемой температурой, здесь используется 35 °C31, для того, чтобы обеспечить постоянные условия окружающей среды.
  2. Откройте программу для управления потенциостатом и выберите методику: Хроноамперометрия. Установите параметры, например, следующим образом: постоянный потенциал EWE 0,2 В (по сравнению с Ag/AgCl) в течение t 500 часов (≈ 20 дней). Ток записывается с шагом во времени dti каждую минуту.
    Примечание: Выбор приложенного потенциала зависит от изучаемой системы/микроорганизма. В основном изучаются анодные процессы при положительном потенциале и катодные процессы при отрицательных потенциалах. Можно также вывести подходящий потенциал из стандартных потенциалов донора/акцептора электронов и формального потенциала ожидаемого микробного сайта переноса электронов, здесь в качестве отправной точки обратитесь к новейшей литературе.
  3. Запустите хроноамперометрию. Программное обеспечение строит график измеренного тока во времени, наблюдаемый максимальный ток (imax) является важным параметром в режиме онлайн, как обсуждалось в разделах 4 и 5.

4. Поддержание биопленки

  1. В зависимости от условий окружающей среды, например, температуры, окислительный ток начинает протекать и достигает плато (см. рис. 4). После повторного достижения нулевого тока сделайте паузу в хроноамперометрическом измерении и пополните раствор среды. Для более быстрого роста биопленки замените среду сразу после достижения плато максимального тока. Откройте отверстие для отбора проб и аккуратно, не разрушая тонкую биопленку, выгрузите среду. Во время заправки среду снова промойте азотом. Закройте отверстие для отбора проб и герметично запечатайте.
  2. Повторяйте процедуру шага 4.1 до тех пор, пока максимальный окислительный ток не достигнет установившегося состояния (см. рисунок 4).
    (Примечание: Считается, что константа imax указывает на стабильное образование биопленки в стационарном состоянии.)
  3. Возьмите 1 мл образцов свежих растворов и растворов обменной среды для анализа субстрата, например, с помощью ВЭЖХ. Исходная концентрация субстрата (ацетата) (c 0), а также концентрация оставшегося раствора субстрата (c1) впоследствии необходимы для расчета эффективности (см. раздел Анализ данных).
    Примечание: Для получения неизменных результатов, например, из-за дальнейшего расхода субстрата, немедленно проанализируйте образцы субстрата. Если это невозможно, храните образцы в морозильной камере при температуре не менее -18 °C не дольше месяца.

5. Применение циклической вольтамперометрии для изучения ЭЭТ

  1. Выполните циклическую вольтамперометрию на максимальных и минимальных значениях протекания тока, как показано на рисунке 4. В зависимости от интересующего вопроса, CV обычно выполняется, когда система достигла устойчивого состояния для получения сопоставимых результатов. (Примечание: Генерация тока называется условиями оборота и связана с микробным окислением субстрата и последующим переносом электронов: микробным биоэлектрокатализом; в то время как невращающиеся CV выполняются при (почти) нулевом протекании тока в КА.)
  2. Выберите в управляющем программном обеспечении потенциостат методику: Циклическая вольтамперометрия, и установите соответствующие параметры, например: Начальный потенциал EWE к Ei от -0,5 В от RE со скоростью сканирования v=dE/dt 1 мВ/сек до вершинного потенциала E1 0,3 В от RE и обратно к начальному потенциалу E2 = Ei от -0,5 В.
    Примечание: При использовании циклической вольтамперометрии приложенное напряжение на ВЭ изменяется линейно со временем под действием потенциостата (см. рис. 5) - Во врезке 2 приведены основные правила выбора параметров эксперимента и устранения неисправностей).
  3. Запустите циклическую вольтамперометрию и запишите столько циклов, сколько необходимо для выполнения воспроизводимой CV. Обычно требуется не менее 3 циклов. Полученный график называется циклической вольтамперограммой (см. также рис. 7). Примечание: В зависимости от условий измерения можно получить различную информацию, как показано в следующем разделе.

6. Построение графиков данных

Здесь обсуждается только построение графиков данных. Более подробный трактат приводится в следующем разделе.

  1. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа данных, здесь все данные экспортируются в виде текста и импортируются в виде файла ASCII.
  2. Рассчитывайте и используйте преимущественно плотности тока (j), а не абсолютные токи (i).
    (Примечание: Однако, поскольку существуют различные протоколы для вычисления j, поясните, какой из них использовался. Здесь плотность тока на геометрическую, т.е. Используется проекция, площадь поверхности электрода.)
  3. Хроноамперометрия: построение графика измеренной плотности тока в зависимости от времени.
  4. Циклическая вольтамперометрия: Построение графика измеренной плотности тока в зависимости от потенциала WE Ewe.

Результаты

1. Хроноамперометрия

На основе хроноамперометрических измерений можно рассчитать две рабочие характеристики: максимальную плотность тока (jmax), т. е. максимальный поток электронов в секунду, и кулоновскую эффективность (CE), т. е. общий поток тока по отношению к потребленному субстрату. На Рисунке 4 показана типичная хроноамперометрическая кривая роста биопленки в течение нескольких циклов роста с использованием реактора с периодическим питанием. После начальной лаг-фазы начинается первый максимум плотности тока. Затем ток снова снижается из-за истощения субстрата. При (почти) нулевом токе производится замена среды, как указано на графике. После этого пополнения субстрата плотность тока снова возрастает, и последующий максимум плотности тока оказывается выше первого. После нескольких циклов роста jmax становится постоянной величиной, что указывает на формирование биопленки в стационарном состоянии14. Поскольку значение jmax в стационарном состоянии зависит от нескольких параметров, например, материала электрода, температуры реактора и состава биопленки, его часто рассматривают как характеристику определенной системы «электроактивная микробная биопленка / электрод». (В случае проточных реакторов используется не jmax, а постоянная плотность тока в стационарном состоянии). Второй рабочей характеристикой является кулоновская эффективность (CE) (Уравнение 1). Она представляет собой количество электронов, зарегистрированных в виде электрического тока, Qp, за один цикл подачи субстрата по отношению к теоретическому максимальному количеству электронов Qth, которое рассчитывается исходя из потребления субстрата за этот цикл.

Формула статического равновесия CE=QP/Qth×100; расчет эффективности на технологической схеме.

(Уравнение 1)

Общий перенесенный заряд можно получить путем интегрирования кривой ХА (см. также Рисунок 6):

Расчет электрического заряда, уравнение \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), метод интегрирования.

(Уравнение 2)

Теоретически возможный электрический заряд рассчитывается по закону Фарадея:

Уравнение термодинамики Qth=ΔcVzF, анализ химического потенциала, образовательные цели.

(Уравнение 3)

Где V — объем питательной среды, F — постоянная Фарадея (F = 96,485.34 C/mol), z — число электронов, высвобождаемых при окислении субстрата (в случае ацетата при окислении до CO2 высвобождается 8 электронов), и Δc = c0-c1, что представляет собой расход субстрата (определяется методами химического анализа, напр. с помощью ВЭЖХ).

2. Циклическая вольтамперометрия:

Циклические вольтамперограммы регистрируют для условий отсутствия оборота и для условий оборота (как показано на Рисунке 4). В обоих случаях можно получить различные типы информации. Далее обсуждается, как можно идентифицировать потенциальные и реальные центры EET.

2.1 Условия без оборота — определение возможных сайтов EET:

На рисунке 7 представлены типичные циклические вольтамперограммы (ЦВА) для условий без оборота, т.е. в отсутствие субстрата. На рисунке 7A показана ЦВА биопленки при высоких скоростях развертки (в данном случае 50 mV/sec), при которых можно идентифицировать только одну пару пиков и, следовательно, один формальный потенциал Ef. В общем случае формальный потенциал редокс-пары может быть рассчитан как среднее арифметическое потенциала пика окисления EpA и потенциала пика восстановления соответствующего вещества EpC (см. также рисунок 7C):

Уравнение электрохимии: Ej = (EpA + Epc)/2, анализ окислительно-восстановительного потенциала в вольтамперометрических исследованиях.

(Уравнение 4)

При применении достаточно низкой скорости сканирования к той же биопленке (в данном случае 1 mV/sec) можно идентифицировать до четырех редокс-пар (соответствующие формальные потенциалы указаны на Рисунке 7B). Это объясняется тем, что при использовании более низких скоростей сканирования уменьшается емкостный фоновый ток, см. также Вставку 1 и например17,21 для подробностей. Однако необоротная циклическая вольтамперометрия (ЦВА) показывает только все редокс-активные соединения на электроде и, следовательно, Ef возможных центров EET. Только анализ оборотной ЦВА позволяет определить Ef фактических центров переноса EET (см. шаг 2.2.).

При дальнейшем анализе необоротных циклических вольтамперограмм можно проанализировать другие характерные параметры, такие как разность потенциалов пиков ΔEp (Уравнение 5), или максимальный ток пика ipA и минимальный ток пика ipC (см. Рисунок 7C).

Уравнение статического равновесия ΔEP=EpA-EpC; схема формулы для образовательных целей.

(Уравнение 5)

Эти параметры, особенно при записи при различных скоростях сканирования, могут быть использованы для механистического и кинетического анализа процессов переноса электронов на электродах. Однако такой кинетический анализ, который хорошо изучен для химических систем, не является прямолинейным для электроактивных микробных биопленок, см. например19,30

  1. Условия оборота — идентификация фактических сайтов EET:

При проведении измерений ЦВ в присутствии субстрата получается ЦВ с оборотом (см. Рисунок 8A). После построения графика можно увидеть типичную S-образную, так называемую биоэлектрокаталитическую кривую17-19. При дальнейшем анализе данных максимум первой производной, т. е. точка перегиба ЦВ-кривой, позволяет определить формальный потенциал Ef фактических центров EET (см. Рисунок 8B). В случае молодой, т. е. тонкой биопленки с преобладанием Geobacteraceae (в данном случае через 168 ч после начала CA) можно наблюдать две точки перегиба. Соответственно, производная демонстрирует два максимума, соответствующих формальному потенциалу биоэлектрокаталитически активных центров EET: -0.376 V и -0.295 V относительно Ag/AgCl (насыщ. KCl, 0.197 V относительно SHE). На Рисунке 7B эти центры обозначены как Ef,2 и Ef,3 соответственно. Этот результат также показывает, что окислительно-восстановительные процессы, связанные с формальными потенциалами Ef,1 и Ef,4 (на ЦВ без оборота), не связаны с биоэлектрокатализом. По мере роста и утолщения биопленки ЦВ показывает только одну точку перегиба, т. е. один максимум на кривой производной. Этот формальный потенциал Ef, который в данном случае составляет -0.32 V относительно Ag/AgCl (насыщ. KCl), (приблизительно) равен среднему арифметическому двух формальных потенциалов, приписанных EET тонкой биопленки (например, здесь Ef,2 и Ef,3) — см. Рисунок 9. Это показывает, что такой базовый анализ ЦВ действительно позволяет быстро и неинвазивно получить представление о термодинамике EET, но, что важно, не позволяет делать дальнейшие механистические или кинетические выводы.

Примечательно, что биопленки, полученные при соблюдении условий данного протокола, в значительной степени состоят из видов Geobacter (здесь не показано)12,15. Изменение отдельных параметров, например, субстрата, температуры и т. д., также повлияет на микробный состав и, следовательно, на электрохимические свойства.

Таблица 1. Среда для роста согласно Kim et al.32

Компонент(мг/л) / (мл/л)   
NaH2ПО4•H2О2,690.00
Na2Оптимизация гиперпараметров44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
ацетат натрия820.00
раствор металла12.50
раствор витамина12.50
Таблица 2. Компоненты раствора металлов и витаминов33.
Раствор микроэлементовион:Раствор витаминов:
Компонентмг/л   Компонентмг/л   
Нитрилоуксусная кислота1,500.0Биотин2.0
MgSO₄4•7ч2О         3,000.0Фолиевая кислота2.0
MnSO₄4•2 ч2О         500.0Пиридоксина гидрохлорид10.0
NaCl  1,000.0Тиамина гидрохлорид5.0
FeSO44•7ч2О          100.0Рибофлавин5.0
CoSO4 или CoCl₂2     100.0Никотиновая кислота5.0
CaCl₂2•2 ч2О            100.0DL-пантотенат кальция5.0
ZnSO₄4   130.0Витамин B120.1
CuSO₄4•H2О10.0п-Аминобензойная кислота5.0
AlK(SO₄)4)2               10.0Липоевая кислота5.0
H3БО3 10.0
Na2MoO4•2 ч2О     10.0
Примечание: Растворите нитрилоуксусную кислоту с помощью KOH до значения pH 6,5, после чего приступайте к добавлению минералов.


Диаграмма биоэлектрохимической терминологии; включает уравнения и формулы электрохимии.
Руководство по настройке параметров и поиску неисправностей при циклической вольтамперометрии, с акцентом на регулировку окна потенциалов и скорости развертки для оптимизации экспериментов по ЦВА.

Схема микробного переноса электронов; пути MET, DET, MIET, DIET; анализ транспорта электронов.
Рисунок 1. Схема возможных механизмов микробного внеклеточного переноса электронов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Процесс отбора проб воды; пробоотборник-ковш собирает пробы из потока сточных вод на очистных сооружениях.
Рисунок 2. Отбор проб на очистных сооружениях после решетчатого уловителя (очистные сооружения, Германия). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Схема и фотография электрохимической ячейки с потенциостатом, установка электродов; обозначены CE, RE, WE.
Рисунок 3. Трехэлектродная установка. (A) Схема, (B) реальный реактор; CE = вспомогательный электрод, RE = электрод сравнения, WE = рабочий электрод с электроактивной микробной биопленкой, SP = порт для отбора проб. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в более крупном размере.

Электрохимический график; анализ ЦВ; ток в зависимости от времени; выход на стационарный режим; данные в микроамперах и часах.
Рисунок 4. График хроноамперометрического роста биопленки на основе инокулята сточных вод в режиме подпиточной культуры (fed-batch). Окислительный ток достигает стационарного состояния после трех циклов замены среды. Указаны лаг-фаза, моменты времени замены среды, а также проведение циклической вольтамперометрии (ЦВ) в условиях оборота и без оборота для стационарного состояния биопленки (исходные данные из работы Liu14). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в более крупном размере.

Электрохимический анализ, диаграмма E-t, циклическая вольтамперометрия, потенциал по отношению ко времени, аналитическая химия.
Рисунок 5. Принцип изменения потенциала во времени в течение одного цикла циклической вольтамперометрии. ЦВА начинается с начального потенциала Ei. Затем приложенное напряжение изменяется линейно во времени со скоростью сканирования v. При достижении выбранного вершинного потенциала E1 напряжение возвращается к конечному потенциалу E2, в данном случае E2 = Ei. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

График электрохимического анализа зависимости плотности тока j от времени t, иллюстрирующий пик jmax.
Рисунок 6. Типичная хроноамперограмма одного цикла роста биопленки, полученной из сточных вод; здесь указаны максимальная плотность тока jmax, прошедший (практический) электрический заряд Qp, отбор пробы начальной концентрации субстрата c0 и концентрация субстрата после одного цикла роста c1 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

График электрохимического анализа; диаграммы циклической вольтамперометрии, показывающие результаты зависимости тока от напряжения.
Рисунок 7. Необоротные циклические вольтамперограммы биопленки G. sulfurreducens. Скорость сканирования: (A) 50 mV/sec, (B) 1 mV/sec 23; (C) фрагмент B, демонстрирующий пиковую плотность тока (jpA) и соответствующий пиковый потенциал (EpA) анода в максимумах. Соответственно, в минимумах показаны пиковая плотность тока (jpC) и соответствующий пиковый потенциал (EpC) катода. Формальный потенциал Ef и разность пиковых потенциалов ΔEp рассчитаны по формуле 4 и формуле 5 соответственно (подробности см. в тексте ниже). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Электрохимический анализ; график вольтамперометрии; ток в зависимости от потенциала; определение пиков; анализ данных.
Рисунок 8. (A) Циклическая вольтамперограмма оборота метаболизирующей биопленки G. sulfurreducens. Скорость развертки составила 5 mV/sec. (B) Первые производные вольтамперометрической кривой23. Указаны формальные потенциалы фактических участков EET: Ef,2 и Ef,3. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Cyclic voltammetry graph; current vs. potential; electrochemical analysis; data results.
Рисунок 9. (A) Циклическая вольтамперограмма оборота и (B) первые производные более толстого метаболизирующего G. sulfurreducens биопленка. Скорость сканирования составляла 5 мВ/с (сравните Рисунок 8). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Обсуждение

Представленный протокол показывает простой и понятный способ выращивания электроактивных микробных биопленок из инокулята сточных вод с использованием трехэлектродной установки в реакторе периодического действия. Хроноамперометрия позволяет выращивать и отбирать электроактивные микробные биопленки из различных инокулятов, а также фундаментально характеризовать биопленки с точки зрения максимальной плотности тока и кулоновской эффективности. Циклическая вольтамперометрия, являясь неинвазивным методом, позволяет проводить фундаментальные исследования термодинамики ЭЭТ микробной биопленки и таким образом выявлять возможные и фактические сайты переноса ЭЭТ. В совокупности эти параметры позволяют i) характеризовать и сравнивать различные микробные биопленки для идентичных условий, а также ii) изучать влияние различных условий эксплуатации на идентичные электроактивные микробные биопленки. Однако эти эксперименты могут быть только отправной точкой. С одной стороны, многогранная область микробной биоэлектрохимии требует дальнейшего и углубленного освоения электрохимических методов и протоколов. Это включает, например, модели для извлечения кинетических и механистических данных, а также другие методы, такие как электрохимическая импедансная спектроскопия34,35. С другой стороны, электрохимические методы не могут дать никакой информации о молекулярной природе, микробном составе, пространственной микробной организации и т.д. Здесь необходимы дополнительные методы, которые должны быть либо неинвазивными и сочетаться с электрохимией, либо инвазивными4. Во вставке 2 приводится краткое обсуждение критических шагов при проведении экспериментов, а также о первоначальном устранении неполадок.

С инженерной точки зрения необходимо принять во внимание, что электроактивный биопленочный анод является лишь одним из компонентов современных микробных биоэлектрохимических систем, и множество других факторов должно быть проанализировано для полноценных систем36. Тем не менее, мы надеемся, что эта видео-статья поможет понять и адаптировать основные элементы БЭС, т.е. микробные электроды, в будущем.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

F.H. выражает признательность за поддержку со стороны BMBF (Исследовательская премия "Биотехнологические процессы нового поколения - Биотехнология 2020+") и Ассоциации Гельмгольца (Группа молодых исследователей).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Первичные сточные водыОчистныеЗабор после механической фильтрации
250 мл Круглодонные колбы с тремя дополнительными входамиTh.Geyer Berlin GmbH, Германия9.011 845Дополнительные входы были прикреплены нашим электродом
сравнения Ag/AgCl (sat. KCl, 0,195 В против SHE) с керамической мембранойSensortechnik Meinsberg, ГерманияSE 11
Графитовые стержни (Ø=1 см, l=3 и 5 см)CP-Handels-GmbH, Вахтберг, ГерманияИспользуемые в качестве материала электродов
Нержавеющая сталь, No 1.4301, проволока Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Бад Наухайм, Германия155-923-05
Силиконовые вилкиTh.Geyer Berlin GmbH, Германия9.230 512 и
ParafilmneoLab, Гейдельберг, Германия3-1011Для герметизации для поддержания анаэробных условий
Potentiostat/Galvanostat Model MPG2BioLogic Science Instruments, Франция
EC-LabBioLogic Science Instruments, Францияпрограммное обеспечение для выполнения электрохимических измерений
Origin 8.6обеспечение для анализа данныхOriginLab
сооружения Программное

Ссылки

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

Перепечатки и разрешения

Теги

Электроактивные микробные биопленки, полученные из сточных вод: рост, поддержание и основные характеристики
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.