Три анализы, в том числе цитопатического эффекта (CPE) на основе анализа, доза-реакция для анализа и Время-дополнение (ToA) анализа были разработаны, оптимизированы, проверены и использованы для идентификации новых противовирусных препаратов против вируса синего языка (BTV), а также как определить возможный механизм-о-Action (MOA) для вновь выявленных противовирусных препаратов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Для выявления потенциальных противовирусных препаратов против BTV, мы разработали, оптимизированы и проверены три анализов, представленные здесь. CPE на основе анализа был первый анализ, разработанный для оценки соединение показало ли какие-либо противовирусную эффективность и были использованы для скрининга большой библиотеки соединений. Между тем, цитотоксичность противовирусных препаратов могут быть также оценивали с помощью CPE на основе анализа. Анализ доза-реакция была разработана, чтобы определить диапазон эффективности для выбранного антивирусного, т.е. 50% ингибирующей концентрации (IC 50) или эффективную концентрацию (ЕС 50), а также свой ассортимент цитотоксичности (CC 50). Тоа анализ был использован для первоначального исследования МСХ, чтобы определить основной механизм романа противовирусных препаратов во время BTV вирусной жизненного цикла или возможного влияния на хозяина сотового оборудования. Эти анализы являются жизненно важными для оценки противовирусной эффективности в системе культуры клеток, и были использованы для наших недавних исследований, проведенныхING к идентификации ряда новых противовирусных препаратов против BTV.
Введение
BTV является прототипом двухцепочечной РНК вируса в род Orbivirus, семейного Reoviridae. BTV является одним из наиболее важных заболеваний домашнего скота, в том числе овец, коз, крупного рогатого скота и других домашних животных, с потерей $ 3 млрд / год по всему миру 1,2. Экзотический BTV серотип является важным патогеном животных перечислены в "Министерство сельского хозяйства США повышенной животноводства патогенов." В последнее время вновь возникающие из BTV вызвало серьезную вспышку болезни у крупного рогатого скота и овец в ряде стран по всему Северной Европы 3,4. В результате его экономической значимости и в качестве мо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Клетки, Вирус и противовирусных соединений
- Поддержание BSR клеток, производное почки детеныша хомячка (ВНК) ячеек 10, в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 5% эмбриональной сыворотки теленка (FCS), 100U/ml пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
- Для всех трех анализов, пластины клеток в DMEM с 1% FCS, 100U/ml пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, как ранее оптимизированный 5. Эту среду называют как среды для анализа всех трех анализов.
- Инкубируйте все клетки в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности.
- Налет-очистить и распространяться тип 10 BTV (BTV-10), ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
1. Противовирусный механизм действия соединения
На основе клеток CPE был разработан анализ, оптимизированы и проверены в лабораторных помощью люминесцентного основе CTG комплект для идентификации новых противовирусных препаратов против BTV, как описано выше 2,5. Реакция анализ десять дозы был использован, чтобы отразить противовирусную эффективность и цитотоксичность идентифицированного соединения свинца путем измерения количества метаболически жизнеспособных клеток в культу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для первоначальной идентификации противовирусных хитов, одним из ключевых шагов для противовирусной открытия и разработки лекарственных является разработка надежных анализов, которые включает в себя выбор количественные маркер, разработки простой протокол, получения достаточных сигналы и менее 10% резюме. Большинство биохимических или на основе ячеек экраны предназначены для обеспечения химической отправную точку, основанную на самой надежной, простой и недорогой анализа, в связи с необходимой воспроизводимости в процес.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Этот проект был поддержан грантом 1R03MH08127-01 и 7R03MH08127-02 от NIH к Q. Ли, и в результате воздействия средств из Отдела Медицины на UAB, чтобы Q. Ли. Поддержка со стороны Molette фонда и Auburn University ценится. Мы также благодарим технические помощь за г-жой Пулин Че и г-н Владимир Musiienko в ходе работы.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | Для клеточных культур |
| FBS | Gibco | 16000044 | Для клеточной культуры |
| 0,05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | Для клеточных культур |
| DPBS | Gbico | 1049769 | Для клеточных культур |
| набор CellTiter-Glo (CTG) Promega | TB288 | Для измерения жизнеспособности клеток | |
| 70% этанол | Fisher | S25309B | Разбавлен из 95% |
| Противовирусных гуашильсоединений | NIH MLSMR и de novo синтеза | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR Разработан | на собственном производстве | ||
| Многорежимный микропланшетный ридер | BioTek | Synergy-II Для считывания люминесцентного сигнала | |
| Диспенсер | MicroFlo selectBioTek | Добавление клеток, вирусов и реагентов | |
| 384-луночный микропланшет с плоским дном | CORNING | 28908031 | Для клеточных культур |
| Программное обеспечение Gen. 5 | BioTek | Для анализа выходных данных многорежимного считывателя микропланшетов Synergy-II | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | Для биостатического анализа и построения графиков |
Ссылки
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
- Meiswinkel, R., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
