Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Краткое содержание

Вируса болезни Ньюкасла (NDV) была тщательно изучена в последние несколько лет, чтобы развить новые векторы для вакцинации и терапии, среди других. Эти исследования стало возможным благодаря методов по спасению рекомбинантный вирус из кДНК, таких, как мы описываем здесь.

Аннотация

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), член прототип Avulavirus рода семьи Paramyxoviridae ^1, является несегментированная, отрицательной смысл, одноцепочечной, окутан РНК вируса (рис. 1) с потенциальными приложений в качестве вектора для вакцинации и лечение заболеваний человека. В глубокое исследование этих приложений стало возможным только после установления обратных методов генетики, чтобы спасти рекомбинантных вирусов из плазмид, кодирующих их полных геномов как кДНК ^2-5. Вирусный кДНК может быть удобно модифицировать в пробирке с помощью стандартных процедур клонирования, чтобы изменить генотип вируса и / или включить новые транскрипционные единицы. Спасение таких генетически модифицированных вирусов представляет собой ценный инструмент, чтобы понять факторы, влияющие несколько этапов инфекции, а также позволяет для развития и совершенствования векторов для экспрессии и доставки антигеновдля вакцинации и терапии. Здесь мы опишем протокол для спасения рекомбинантных NDVs.

Введение

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), птичий парамиксовирус, принадлежащая к роду Avulavirus ^1, является экономически актуальны и таким образом широко исследованы и прослушивала зоонозных агент, который может серьезно повлиять на птицеводство по всему миру. Хотя это и не человеческий патоген, НДВ также хорошо изучены за пределы поля ветеринара и как модели парамиксовируса и из-за его высокой интересных, природных онколитических свойств ^6. Исследование NDV большую пользу от развития обратных методов генетики для одноцепочечными, несегментированная отрицательной смысловой РНК вирусов, впервые описанных для вируса бешенства по Конзельманн и Вашии....

Протокол

1. Подготовка клетках млекопитающих (фиг. 4А, день 1)

Сплит Нер-2 или А549 за день до трансфекции в 6-луночных планшетах. Плотность клеток должна достичь 80-90% слияния на следующий день. Как правило, сливающийся 100 мм блюдо можно разделить на 8 скважин (около 1 × 10 ⁶ клеток на лунку). Для каждого вирус быть спасены, 2-4 различных скважин должны быть включены, а также две дополнительные скважины для управления pCAGGs-GFP и GFP ^pCITE-18, направленные контролировать эффективность трансфекции и инфекции MVA-T7, соответственно.

2. Заражение клетках млекопитающих с рекомбинантно....

Результаты

Спасение NDV является хорошо установленный порядок, регулярно проводится в лабораториях, которые имеют доступ к полному кДНК вируса. Тем не менее, внутренний стохастический характер метода делает его трудно достичь 100% эффективность помощь. Мониторинг ранние этапы процесса, специально эффективность трансфекции и инфекции с MVA-T7, помогает выявить возможные проблемы. Рисунке 5а стандартного трансфекции и эффективность трансфекции / инфекции, которые являются достаточно для успешного НДВ помощь. После р.......

Обсуждение

Несколько факторов должны быть рассмотрены для достижения хороших результатов во время спасения NDV. Во-первых, кДНК полной длины конструкция для использования должна быть разработана, чтобы позволить функциональное включение новых модификаций / трансгенов в геном NDV. Это означает, как указано выше, что (I) соответствующий конец гена (GE), Межгенный (IG) и включите ген (GS) последовательности должны быть добавлены, если это необходимо; (II) нет предполагаемые последовательности GE или GS в иностранной Ген, и (III) полн.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Любой поставщик
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Липофектамин 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Бычий альбумин (BA)	Sigma	232-936-2	Любой поставщик
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Любой поставщик
Пенициллин/стрептомицин (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Любой поставщик
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Любой поставщик
Cell lines A549 клеток (каталожный номер CRL-185), клеток HEp-2 (каталожный номер CRL-185), фибробластов куриных эмбрионов (каталожный номер CRL-12203) и фибробластов утиных эмбрионов (каталожный номер CCL-141) можно приобрести в American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 США). Все клеточные линии поддерживаются в 37 °°; Инкубатор C с 5% CO2 в DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Эмбриональные куриные яйца можно получить в Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, США) и поддерживаются на уровне 37 °C. Жизнеспособность эмбрионов оценивается с помощью подсвечника для яиц. Яйца заражаются, когда им исполняется 8-10 дней. Как инфицирование, так и забор аллантоисной жидкости происходит в стерильных условиях. Все яйца автоклавируются и выбрасываются в соответствии со стандартными лабораторными протоколами биобезопасности. Эритроциты индейки (RBC) Эритроциты индейки можно приобрести в компании Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, США) и хранить при температуре 4 °C. Для приготовления эритроцитов для анализа на ГК необходимо промыть 5 мл товарного запаса 45 мл PBS 1x в конической пробирке объемом 50 мл. Центрифугируйте в течение 5 минут при 1 000 об/мин и осторожно выбросьте надосадочную жидкость. Разбавьте гранулированный эритроцит 1:1,000 в PBS 1x до конечной концентрации 0,5-1,0%. Промытые эритроциты можно хранить при температуре 4°С; C в течение нескольких дней. Plasmids Препараты плазмид получают с любым коммерчески доступным набором maxiprep следующего производителя' , разбавленные в ddH20 до конечной концентрации 1 μ g/μ Концентрацию и чистоту ДНК оценивают с помощью спектрофотометрии при длине волны 260 и 280 нм. Препараты с соотношением 260/280 выше 1,8 считаются приемлемым качеством для спасения. Качество плазмидной ДНК также регулярно перепроверяется с помощью хроматографии в агарозном геле. Viruses Описанный протокол спасения лентогенного штамма NDV Hitchner B1 может быть выполнен в условиях уровня биобезопасности (BSL) 2. Модифицированная вакцина Vaccinia Ankara, экспрессирующая Т7-РНК-полимеразу (MVA-T7), была описана 34 и получена от д-ра Бернарда Мосса. Этот вирус произрастает в сливающихся монослоях фибробластов куриного эмбриона и титруется в клетках млекопитающих (A549 или HEp-2). Запасы NDV выращивают в эмбрионированных куриных яйцах и титруют с помощью IFA с использованием поликлональной сыворотки, выращенной против очищенных вирионов. Весь загрязненный материал должен быть безопасно стерилизован и утилизирован в соответствии со стандартными процедурами биобезопасности. Среды и растворы для культур тканей: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco' s модифицированный Eagle' s Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллина/стрептомицина (P/S): 445 мл DMEM, 50 мл термоинактивированного FBS, 5 мл 100x коммерческого раствора P/S. Хранить при 4 °C. 10x Фосфатный буферный раствор (PBS): 80 г NaCl, 2 г KCl, 11,5 г Na2HPO47H2O, 2 г KH2PO4. Добавьте ddH2O до 1 л. Отрегулируйте pH до 7,3. Стерилизовать автоклавом. Хранить при комнатной температуре. 1x PBS: Разбавить 10x PBS 1:10 ddH2O. Стерилизовать в автоклаве и хранить при комнатной температуре. 100x Ca/Mg: 1,327 г CaCl2.2H2O, 2,133 г MgCl2.6H2O и добавить ddH2O до 100 мл. Автоклав и хранить при комнатной температуре. 1x PBS/BA/PS: 50 мл 10x фосфатно-солевого буфера (PBS) в 437 мл ddH2O. Автоклав и при охлаждении до комнатной температуры добавить 5 мл 100x пенициллина/стрептомицина, 3 мл 35% бычьего и 5 мл 100x Ca/мг. Хранить при 4 °C.