Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая пропускная Микроинъекции из морского ежа зиготы

14.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50841

⸱

21 января 2014 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

В этой статье

Краткое содержание

Микроинъекция является общим методом, используемым для доставки конструкций ДНК, мРНК, морфолино антисмысловых олигонуклеотидов или другие процедуры в яиц, эмбрионов и клеток различных видов.

Аннотация

Микроинъекции в клетки и эмбрионы в является общим методом, который используется для изучения широкий спектр биологических процессов. В этом методе небольшое количество обрабатывающего раствора загружают в микроинъекции иглы, используемой для физически вводить индивидуальные иммобилизованных клеток или эмбрионов. Несмотря на необходимость первоначального обучения для выполнения этой процедуры для доставки высокой пропускной, микроинъекции обеспечивает максимальную эффективность и воспроизводимую доставку широкого спектра лечебных решений (в том числе сложных смесей образцов) в клетки, яйца или эмбрионы. Приложения к микроинъекций включают доставку конструкций ДНК, мРНК, рекомбинантных белков, усиления функции и потери функциональных реагентов. Флуоресцентный краситель или колориметрический добавляется введенного раствора, чтобы позволить мгновенную визуализацию эффективной доставки, а также средство для надежного нормализации количества подаваемого раствора. Описанный способ позволяет микроинъекции 100-400 морского ежа гygotes пределах 10-15 мин.

Введение

Эффективное и воспроизводимое доставка лечение является одним из основных методологических проблем для исследователей. Некоторые методы были созданы для временно поставлять решения по лечению в яйца, эмбрионов и клеток. Эти методы включают электропорации (на основе генерирующих переходных пор в мембране с помощью коротких электрических импульсов) 1,2, липофекция (доставка путем слияния лечения, содержащих липосомы с мембраной) 1, бомбардировки микрочастицами 1 (ДНК осаждают на микрон размеров металлических частиц, которые затем используются для проникновения в клетки с высокой скоростью), и трансдукции (вирус используют в качестве средства доставки трансгенов). На данный момент, микроинъекции единственный подход, который держит преимущество доставки любого решения с 100%-ной эффективности с минимальными реагентов. Кроме того, один инъекционный раствор может состоять из сложного коктейль из обработок. Этот метод был использован для успешнойлы microinject яйца и эмбрионы из многочисленных видов, таких как морские ежи 3,4, зебры рыбы 5, мыши 6, лягушки 7, и крупного рогатого скота 8, а также отдельных клеток в культуре ткани 9. Холост бластомеров инъекции в более поздних стадиях развития также были проведены 10-12.

Современные методы микроинъекции основаны на методе давления впрыска, который был первоначально описываемой Hiramoto 10, однако, большой прогресс был достигнут в направлении оптимизации этого процесса. Отличные методы микроинъекции были описаны в других 11, и здесь мы описали один из специфических методов, которые в настоящее время используются для microinject морского ежа (Strongylocentrotus purpuratus) недавно оплодотворенных яйцеклеток. Более века, морские ежи были ценным экспериментальная модель 15,16. Морские ежи эволюционно тесно связаны с хордовых (включая нас) и анализаих геном показал, что они содержат все основные семейств генов, как человека 17. Они производят большое количество синхронно разработки прозрачных эмбрионов, которые можно легко манипулировать. Использование морского ежа в качестве модельного организма, морской еж сообщество внесло свой ​​вклад в наше понимание процесса оплодотворения 18-21, биологических процессов клеточных 22-24 и генных регуляторных сетей (GRNs) 25-28.

Микроинъекция в морских ежей зиготы требует нескольких шагов. Во-первых, яйца должны быть иммобилизованы до инъекции (см. ниже). Микроинъекция блюда покрыты сульфат протамина (PS), который создает положительно заряженную поверхность, к которой отрицательно заряженные яйца могут прилипать 3. Яйца dejellied путем инкубации в кислой морской воды (рН 5,15) в течение 10 мин, с последующими двумя промывками в натуральной морской воде или искусственной морской воды (рН 8,0). В dejellied яйца тщательно гребли по прямойв середине покрытого PS-Петри в присутствии 1 мМ 3-аминотриазола (3-AT), который необходим, чтобы ингибировать активность ovoperoxidase, который секретируется из корковых гранул яйца в результате оплодотворения 29. Этот шаг важен, чтобы предотвратить затвердевание оболочки оплодотворения и для облегчения ввода микроинъекции иглы. В качестве альтернативы 1 мМ 3-АТ, 10 мМ paraminobenzoic кислоты (PABA) могут быть использованы. Инъекционный раствор загружают в микроинъекции иглы с использованием специализированного наконечник пипетки microloading и установлен на держателе, прикрепленной к микроманипулятором и блок давления (рис. 1). Каждая игла может быть использован для microinject отдельные зиготы в нескольких экспериментах на отдельные дни. Микроинъекция может быть выполнена в течение 10-15 мин, пока не затвердеет зиготы. В зиготы затем промывают с морской водой и культивировали при 15 ° С Когда эмбрионы достигают вылупления бластулы этап, они выпускают штриховки фермент, который расщепляет компоненты ферtilization конверт 30 и позволить им естественно оторваться от тарелки ПС-покрытием. Если необходимо, эмбрионы могут быть осторожно отделена от тарелки с помощью рот пипеткой или пипетки Пастера, осторожно дует морской воды на эмбрионов. Описанный способ позволяет эффективную и надежную микроинъекции 100-400 недавно оплодотворенных яиц на одном блюде, предоставляя метод высокой пропускной ниже по течению анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка протаминсульфат (PS) с покрытием Посуда

  1. Подготовка 1%-ный раствор сульфата протамина (PS), добавляя 0,5 г PS в 50 мл деионизованной дистиллированной воде (DDH 2 O) в 50 мл коническую пробирку. Хорошо взболтать на высокой скорости на скамейке шейкере при комнатной температуре в течение 1-2 часов, чтобы обеспечить полное растворение PS. Это решение может храниться при температуре 4 ° С в течение не менее 3 месяцев (убедитесь, что для полного растворения гелеобразную осадка перед каждым использованием) 3.
  2. Возьмите рукав 60 мм х 15 мм полистирола чашки Петри и выложить обе крышки и основания на скамейке.
  3. Залить 1%-ный раствор PS в каждом блюде (оба днища и крышки можно использовать) только достаточно, чтобы покрыть поверхность, оставить на 2 мин. Раствор PS остаток может быть повторно использован много раз в течение 3 месяцев при хранении при 4 ° С.
  4. Место PS обработанные блюда в химический стакан, наполненный дистиллированной воде (дН 2 O). Оставьте стакан под струей дН 2 O, по крайней мере10 мин.
  5. Блюда ПС-покрытием можно использовать сразу или воздух сухой для хранения. Покройте их, чтобы предотвратить накопление пыли. Они могут храниться при комнатной температуре в течение 1 месяца 3.

2. Получить морской еж гамет и Остановите яйца на блюдо ПС-покрытием для микроинъекции

  1. Spawn морские ежи при встряхивании или внутрицеломических инъекция до 1 мл 0,5% хлорида калия, чтобы вызвать сокращение гладких мышц, чтобы освободить гаметы 3 (рис. 2).
  2. Если животное мужского пола, как указано в белый цвет спермы, собирать спермы в сухом от поверхности животного в 1,5 мл трубки. Сухой сперма может храниться при 4 ° С в течение недели без существенной потери биологической функции.
  3. Если животное является женщина, на что указывает желтый цвет из-за содержания яичного желтка, собирать его гаметы путем погружения gonopores в химический стакан, полный морской воды. Яйца будут освобождены от gonopores и поселиться под действием силы тяжести.
  4. Фильтр яйца от мусора, например шипами на животных с использованием 80 нейлоновый фильтр сетку мкм. Лучшие результаты достигаются, если яйца используются в пределах 5-7 часов после нереста.
  5. Dejelly яйца:
    1. Подготовка 100 мл кислой морской воде в течение приблизительно 1 мл яйца. Используйте 0,5 М лимонной кислоты, чтобы довести рН морской воды от рН 8,0 до 5,1-5,2. Слишком низкое рН снизится оплодотворение и слишком высокой рН не позволит яйца приложить к пластинам на PS покрытием.
    2. Добавить яйца (не более 1 мл), кислой морской воды и позволяют яйца, чтобы успокоиться на льду в течение 10 мин. Кроме того, удаление студенистой оболочки может быть облегчено путем осторожного закрученной яиц во время лечения. Можно эффективно dejelly S. purpuratus яйца в 3-4 мин этот путь.
    3. Тщательно слейте кислой морской воды, добавить свежий морской воды и пусть яйца поселиться на льду снова. Dejellied яйца можно хранить на льду в течение до 6 часов без проблем оплодотворения

3. Ряд яйца

  1. Подготовка 1 М исходного раствора 3-аминотриазол (3-AT, ММ = 84,08) путем растворения 0,84 г 3-АТ в 10 мл DDH 2 O. Этот раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
  2. Подготовка 1 мм Рабочий раствор 3-AT добавлением 50 мкл 1 М раствора в 50 мл prechilled морской воды. Держите решение на льду.
  3. Подготовка рот пипеткой (рис. 3) для бережной обработки яиц:
    1. Пипетки вручную вытащил из стеклянных микропипеток (100 х OD 1,09 мм). Держите микропипетки обеими руками над открытым пламенем. Как стекло начинает плавиться, осторожно потяните концы пипетки в противоположных направлениях.
    2. Подключите один вытащил пипетки к пластиковой трубки (ID 1,14 мм), печать туго с парафильмом. Длина трубки должна быть примерно 50-70 см.
    3. Вставка стерильно фильтруют P20 или P200 наконечник на конце, противоположном патрубка к стеклянной трубки киспользоваться как мундштук.
    4. Клип конец стеклянной микропипетки с ножницами, чтобы регулировать диаметр наконечника. Оптимальный диаметр слегка превышает диаметр яйца (80 мкм).
  4. Налейте 4 мл 1 мМ 3-АТ морской воды в каждую PS покрытием блюдо (внизу или крышки).
  5. Возьмите рот пипеткой, введите наконечник P20/P200 в рот и закрепите его с помощью зубов. Для аспирации яйца, первый аспирации небольшого количества морской воды. Имея столба жидкости перед загрузкой яйца, то придется максимальный контроль над техникой пипетки ртом.
  6. Разместите наконечник микропипетки возле яиц и аккуратно аспирации в несколько сотен яиц в пипетку. Ограничьте яйца в стеклянной микропипетки.
  7. Ряд dejellied яйца в прямой линии на блюдо, осторожно дует их из рта пипетки при перемещении наконечника по прямой. Ряд яйца прямо перед инъекциями, потому что проблемы оплодотворения может произойти из-за рrolonged воздействия 3-АТ морской воды 3. Кроме того, катионные клеи, как ПС могут быть токсичными для яиц, и это не рекомендуется подвергать эмбрионов этих реагентов в течение длительного времени, особенно если оплодотворение конверты были удалены.
  8. Сделать царапину на блюдо вблизи линии гребли яиц с помощью стеклянной пипетки. Это царапина будет важно сломать инъекционной иглы для регулировки потока раствора по мере необходимости. С другой стороны, царапина может быть сделано перед заливкой морской воды 3-AT к блюду.

4. Микроинъекции морского ежа зиготы

  1. Включите микроинъекции станции. Здесь мы опишем использование системы впрыска FemtoJet.
  2. Потяните впрыска капилляры помощью иглы съемник. Пример хорошего иглы показан на рисунке 4. Примечание: Для РНК инъекций, инъекций капилляры должны быть предварительно обработаны, чтобы избежать РНКазы загрязнения 31:
    1. Месте инъекции капилляры в 50 мл коническуютрубы и добавить 50 мл отфильтрованной смеси метанол / HCl (9:1). Хорошо встряхните и оставьте на ночь в течение не более 10 часов.
    2. Слейте метанол / HCl и промыть капилляры 2x с фильтрованной метанола в той же трубе.
    3. Слить метанол, насколько это возможно и лиофилизуют в течение ночи капилляры, чтобы обеспечить полное удаление метанола.
  3. Осторожно установите иглы капилляр на иглы загрузки держателя и загрузить его с <0,5 мкл раствора образца с использованием microloader советы. Растворы образцов обычно содержат 20% глицерина, в зависимости от впрыскиваемого материала 3.
  4. Место блюдо с гребли яиц на столик микроскопа (яйца должны быть выровнены по вертикали, если смотреть через окуляры) и сосредоточиться на яйцах.
  5. Осторожно установите загруженный иглу на держатель иглы microinjecting и отрегулировать положение иглы, чтобы иметь полностью сфокусированное наконечник в середине поля.
  6. Нажмите на кнопку, чтобы применить максимальное давление FOг очистки иглы. Решение должно прийти из иглы. Регулировка давления в случае необходимости: давление впрыска должна быть в диапазоне 90-360 кПа, при давлении компенсации приблизительно 1/3 от давления впрыска.
  7. Отрегулируйте поток раствора путем введения в неоплодотворенных яиц. Использование джойстика микроманипулятор, направить кончик инъекционной иглы в неоплодотворенных яиц. Для облегчения ввода иглы, создать легкую дрожь, осторожно разговоров сцены с твердым предметом, таких как отвертки. Болюсной инъекции формирования внутри яйца следует рассматривать (рис. 5).
  8. Если болюсной инъекции не видно, слегка приподнимите кончик иглы выше яиц, найдите царапину на блюдо и настроить его должен быть расположен в середине поля. Слегка постучите кончик иглы к царапиной сломать кончик инъекционной иглы. Отрегулируйте впрыска и компенсации давления для того, чтобы болюсной инъекции не превышает 1/5 тон диаметр яйца (1-2 мкм).
  9. После болюсной инъекции откалиброван, оплодотворить яйца, добавив разбавленный сперму (1:1000) или 1-2 мкл спермы. Хорошо перемешать тщательно, чтобы предотвратить смещение строку яиц.
  10. Начните инъекции сразу после оплодотворения конверт становится видимым (рис. 5). Перемещение по линии гребли яиц с использованием контроллера этап и ввести столько зиготы, насколько это возможно, тыкая их с иглой под контролем джойстика микроманипулятора.
  11. После 10-15 мин, вновь оплодотворенных яиц станет закаленного и не может быть введен больше. Снимите блюдо со сцены и тщательно аспирата из спермы в морской воде 3-АТ с помощью пластиковой пипетки Пастера.
  12. Не позволяйте зиготы сухой. Быстро добавить свежий prechilled морскую воду, чтобы покрыть блюдо. Инкубируйте эмбрионов при 15 ° С

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

GFP и mCherry репортер конструкции были в пробирке транскрипции и микроинъецировали во вновь оплодотворенных яиц. Эмбрионы инкубировали при 15 ° С в течение 24 ч (до стадии бластулы) и отображаемого использованием Zeiss наблюдатель Z1 микроскопа. Инъекция репортер конструкций не приводит ни к каким дефектами развития (рис. 6). Для количественного определения флуоресцентных сигналов, получения изображения была выполнена при малом увеличении (100X) максимально захватить люминесцентные пикселей

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микроинъекция является мощным средством для доставки различных процедур, таких как ДНК, РНК, рекомбинантных белков, потеря функции и увеличение функциональных реагентов, красителей и их комбинаций в яйца, эмбрионов и клеток различных организмов 1-7. Тем не менее, несколько соображений следует иметь в виду при разработке эксперимент микроинъекции.

Крайне важно учитывать растворимость поставляемого лечения и объемом впрыска. Если микроинъецировали решение имеет тенденцию к образован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов.

Благодарности

Мы благодарим Сантьяго Суарес за критическое прочтение рукописи и Бетти Cowgill для помощи в фотографии. Мы также благодарим анонимных рецензентов за их критической обратной связи. Эта работа проводится при поддержке Университета штата Делавэр исследовательского фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стеклянные пастеровские пипеткиVWR14673-043 
Инвертированный микроскоп  Axiovert 40 ° CZeiss4109431007990000Инъекционный микроскоп
Наконечники микрозагрузчикаEppendorf5242 956.003Раствор для инъекций
Нейлоновая фильтрующая сетка 80  μ mAmazon.com03-80-37Фильтруйте яйца для избавления от мусора
P20 или P200 Наконечники для аэрозольной барьерной пипеткиFisher Scientific02707432 или 02707430Часть ротовой пипетки
Парапленка FisherScientific13 374 12Часть ротовой пипетки
Полиэтиленовая трубкаIntramedicPE-160Часть ротовой пипетки
ПротаминсульфатMP Biomedicals, LLC194729Прикрепляем желеобразные яйца к инъекционным посуде
Морские ежи S. purpuratusPt. Loma Marine Invertebrate LabN/A 
Морская водав любом зоомагазинеInstant Ocean 
Стерильный 60 мм x 15 мм Полистирол Чашка ПетриFisher Scientific0875713AПосуда для инъекций
Трехосевой микроманипулятор грубого позиционирования MMN-1Narishige9124Манипулирующая игла для инъекций
Трехосевой джойстик Тип масляного гидравлического тонкого микроманипулятора MMO-202NDNarishige9212Манипулирующая игла для инъекций
Переносные пипеткиFisher Scientific13-711-9AM 
Вертикальный  съемник игл Инъекционные иглыNarishigePC-10
Pull

Ссылки

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  2. Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
  3. Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
  4. Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
  5. Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
  6. Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
  7. Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
  8. O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
  9. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).
  10. Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
  11. Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
  12. Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
  13. Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
  14. Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
  15. Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
  16. McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
  17. Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
  19. Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
  20. Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
  21. Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
  22. Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
  23. Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
  24. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
  25. Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
  26. Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
  27. Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
  28. Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
  29. Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
  30. Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
  31. Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод микроинъекцийвысокопроизводительная доставкаиммобилизация эмбрионовпокрытие сульфатом протаминасистема вытягивания иглинъекции с помощью FemtoJetотслеживание с помощью флуоресцентного красителярегулировка потока растворапроцесс инъекции в зиготу
Высокая пропускная Микроинъекции из морского ежа зиготы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.