Визуализация цитоплазматического кровотока во время заживления одноклеточной раны у Stentor coeruleus

Краткое содержание

Гигантская инфузория Stentor coeruleus является классической системой для изучения регенерации и заживления ран в отдельных клетках. Визуализируя клетки Stentor одновременно при малом и большом увеличении, можно измерить цитоплазматические потоки до, во время и после ранения.

Аннотация

Хотя заживление ран часто решается на уровне целых тканей, во многих случаях отдельные клетки способны заживлять раны внутри себя, восстанавливая поврежденную клеточную мембрану до того, как клеточное содержимое высочится наружу. Гигантский одноклеточный организм Stentor coeruleus, в котором клетки могут иметь размер более одного миллиметра, был классическим модельным организмом для изучения заживления ран в одиночных клетках. Клетки стентора могут быть разрезаны пополам без потери жизнеспособности, и даже могут быть разрезаны и привиты вместе. Но такая высокая толерантность к разрезанию поднимает вопрос о том, почему цитоплазма просто не вытекает из размера разреза. Здесь мы представляем метод разреза клеток Стентора с одновременной визуализацией движения цитоплазмы в окрестностях разреза с высоким пространственным и временным разрешением. Ключевым моментом нашего метода является использование конфигурации «двухэтажного» микроскопа, в которой операция выполняется под препарирующим микроскопом, сфокусированным на камере, которая одновременно просматривается снизу с высоким разрешением с помощью инвертированного микроскопа с высокой линзой NA. Такая установка обеспечивает высокий уровень контроля над хирургической процедурой, в то же время позволяя отслеживать цитоплазму с высоким разрешением.

Введение

Регенерация и заживление ран являются важными биологическими процессами, механизмы которых остаются областями активного исследования. Действительно, способность заживлять раны и регенерировать поврежденные части тела является одной из особенностей, которая отличает живые существа от неодушевленных предметов. Как правило, считается, что регенерация опосредована дифференцировкой стволовых клеток в различные типы клеток, необходимые для восстановления поврежденной или оторванной части животного, в то время как заживление раны рассматривается с точки зрения проникновения новых клеток в рану для восстановления неповрежденного эпителия. Таким образом, оба процесса, по-видимому, опосредованы коллективами отдельных клеток и, следовательно, представляются квинтэссенцией многоклеточных процессов. Поэтому потенциально удивительно, что отдельные клетки в некоторых случаях способны восстанавливать раны и регенерировать утраченные компоненты^. Заживление ран в отдельных клетках может включать в себя несколько путей, включая актин-миозиновое сокращение кошельковой нити вокруг раны и наложение мембранных повязок путем быстрого слияния экзоцитозных везикул^1-3. Хотя многие типы клеток способны к некоторой степени заживления ран^4-6, возможно, наиболее ярким примером является гигантская инфузория Stentor coeruelus⁷, показанная на рисунке 1. Отдельные клетки Стентора имеют длину 1 мм, и покрыты рядами ресничек. Клетки стентора имеют конусообразную форму с ротовым аппаратом, состоящим из тысяч ресничек на одном конце и узкой удерживающей структуры на другом конце. Стентор был классическим модельным организмом для изучения регенерации, потому что если какая-либо часть клетки была отрезана, она могла^{регенерировать}. Например, в классической серии экспериментов Томас Хант Морган^{показал}, что ячейку Стентора можно разрезать пополам, и каждая половина будет регенерировать ячейку с нормальными пропорциями в течение^{нескольких часов.} Молекулярные пути, ответственные за регенерацию в стенторе, остаются совершенно неизвестными.

Способность клеток Стентора служить моделью регенерации зависит от удивительной способности этих клеток к самовосстановлению после разреза. Почему цитоплазма клетки Стентора не вытекает при разрезании клетки? Заживление раны происходит не за счет немедленного сокращения клеточной коры, ведь можно взять две клетки Стентора, разрезать их, а затем соединить две разрезанные клетки вместе в различных^{конфигурациях.} Во время таких экспериментов по пересадке цитоплазма двух клеток должна оставаться открытой, поскольку она сливается, когда клетки сталкиваются. Каким-то образом цитоплазма подвергается воздействию окружающей среды в достаточной степени, чтобы обеспечить возможность трансплантации, но при этом она не вытекает из клетки. Является ли цитоплазма стентора достаточно эластичной, чтобы она просто не могла вытекать даже при проделывании большого отверстия в плазматической мембране? Увеличивают ли клетки вязкость цитоплазмы локально вокруг раны, чтобы предотвратить вытекание цитоплазмы? Цитоплазма является очень сложным активным материалом^9-11, и реакция Стентора на заживление ран представляет собой уникальную возможность изучить цитоплазматические потоки и механику во время заживления одиночных клеток. Тем не менее, использование хирургических методов для индуцирования ран в стенторе представляет собой техническую проблему. Для того, чтобы разрезать клетку длиной 1 мм с помощью стеклянных игл, традиционной хирургической парадигмы, необходимо оперировать при малом увеличении и большом рабочем расстоянии. В таких условиях визуализации невозможно отследить поток цитоплазмы, и все, что можно определить, это то, остается ли цитоплазма внутри клетки или нет. Реальный вопрос, который мы хотели бы задать, заключается в том, как движение и вязкость цитоплазмы могут изменяться во время разрезания и заживления. Для этого требуется визуализация с высоким разрешением. В данной работе мы представляем адаптацию протокола Tartar для резки Stentor⁷, которая позволяет проводить резку под оптикой с меньшим увеличением, чтобы видеть всю клетку целиком, одновременно наблюдая за потоком цитоплазмы с высоким разрешением, что позволяет использовать эту систему в качестве платформы для изучения механизмов заживления одиночных клеток ран.

Протокол

1. Клеточная культура и сбор

1. Приобретайте клетки Stentor coeruleus либо из естественных водоемов, как описано в Tartar⁷, либо у коммерческого поставщика (см. Реагенты).
2. Поддерживайте культуры путем выращивания в темноте при 20 ºC в модифицированной среде Stentor Medium (MSM), которая адаптирована из рецептов, описанных в Tartar⁷ и De Terra¹², содержащих 0,75 мМ Na₂CO₃, 0,15 мМ KHCO₃, 0,15 мМ NaNO₃, 0,15 мМ KH₂PO₄, 0,15 мМ MgSO₄, 0,5 мМ CaCl₂, и 1,47 мМ NaCl.
3. Дополните среду МСМ источником углерода, добавив в нее живую добычу. Выращивание культур Chlamydomonas reinhardtii средой TAP стандартными методами культивирования¹³. Перед кормлением промойте клетки Chlamydomonas в МСМ. Скармливайте 300 мл культур Стентора ~3 x 10⁷ клеток Chlamydomonas 2-3 раза в неделю.
4. Соберите клетки Стентора для операции с помощью пипетки. Стенторы, как правило, крепятся ко дну и стенкам чашки для культивирования, и поэтому, чтобы собрать клетки, перемешивают культуру, пропуская воздух через наконечник пипетки до тех пор, пока клетки не начнут отделяться и свободно плавать.
5. Захватывайте плавающие клетки с помощью пипетки с широким наконечником, чтобы избежать сдвига клеток.
6. Собранные клетки промыть в свежих МСМ.

2. Подготовка инструментов для микрохирургии

1. Держите два стеклянных стержня для перемешивания над горелкой Бунзена или другим пламенем, пока концы не начнут плавиться.
2. Прикоснитесь концами двух стержней друг к другу, чтобы расплавленное стекло сработало.
3. Создав небольшую каплю расплавленного стекла между двумя стержнями, снимите их с пламени, дайте остыть в течение 1-2 секунд, а затем раздвиньте их, чтобы сделать чистый разрыв. В идеале стекло должно растягиваться на тонкие нити и плавно разбиваться по мере охлаждения стекла, в результате чего образуется игла длиной примерно 1-2 см с тонким концом на конце (Рисунок 2).
4. Если полученная игла не является оптимальной, кончики могут быть разбиты на стеклянные отходы, а стержни могут быть использованы повторно.

3. Монтирование клеток для микрохирургии и наблюдения (обычная хирургия)

1. Приготовьте квадратную камеру с вазелиновыми стенками с помощью квадратного резинового штампа, покрытого вазелином и надавленного на стеклянную покровную крышку.
2. Добавьте МСМ, содержащий 2% метилцеллюлозы, в квадрат вазелина.
3. Поместите покровное стекло в пластиковый адаптер, который позволяет поместить покровное стекло на микроскоп с помощью стандартного держателя предметного стекла (рис. 3).
4. Добавьте промытые клетки из шага 1.6 в МСМ плюс метилцеллюлозу, чтобы препятствовать подвижности клеток Стентора, чтобы они оставались на месте во время операции.
5. Расположите клетки в метилцеллюлозе так, чтобы они были равномерно расположены и прижаты достаточно близко к поверхности покровного стекла, чтобы быть в фокусе во время визуализации.

4. Визуализация заживления ран с высоким разрешением в живом стенторе

Чтобы одновременно получить изображение ячейки Стентора с высоким разрешением, одновременно разрезая ее хирургическим путем при малом увеличении, постройте "двухэтажный" микроскоп с препарирующим эндоскопом, прикрепленным к головке окуляра инвертированного эндоскопа так, чтобы он был сфокусирован на верхней части предметного стекла, в то время как инвертированный эндоскоп сфокусирован из-под предметного стекла.

1. Наденьте предметное стекло на перевернутый прицел (используйте либо Zeiss Axiovert 200M, либо Olympus IX80).
2. Снимите корпус препарирующего микроскопа с подставки и определите приблизительное положение над окуляром инвертированного микроскопа для размещения препарирующего прицела, чтобы можно было визуализировать предметное стекло при малом увеличении.
3. Модифицируйте картонную коробку так, чтобы она имела ту же толщину, что и желаемое расстояние между головкой окуляра инвертированного прицела и препарирующим эндоскопом, затем прикрепите инвертированный эндоскоп с помощью лабораторной ленты, которую можно легко снять после завершения эксперимента. Отрегулируйте толщину коробки в соответствии с точной конфигурацией головки окуляра инвертированного микроскопа и размером препарирующего микроскопа таким образом, чтобы образец находился в поле зрения без необходимости перемещать препарирующий эндоскоп после его прикрепления.
4. Прижав препарирующий эндоскоп к коробке, переместите его до тех пор, пока предметное стекло не окажется в фокусе, затем снова прикрепите к коробке с помощью лабораторного скотча. Окончательная конфигурация показана на рисунке 4.
5. Изображение ячеек через инвертированный прицел с помощью оптики DIC и 20-кратного объектива с воздушным объективом. Используйте конденсатор DIC с большим рабочим расстоянием, чтобы обеспечить достаточно места для выполнения микрохирургии сверху.
6. Получайте изображения с частотой кадров 2 изображения в секунду с помощью ПЗС-камеры с разрешением 512 x 512
.
7. Начните сбор данных до начала разрезания клеток, чтобы зафиксировать начальную картину цитоплазматического кровотока и наблюдать за всеми стадиями процесса заживления ран.
8. Прекращайте сбор данных, когда клетка возвращается к нормальному внешнему виду и/или активной подвижности, чтобы визуализировать и измерять движения цитоплазмы на протяжении всего процесса регенерации.

5. Анализ цитоплазматического кровотока во время заживления ран

Измерьте цитоплазматический поток с помощью скорости изображения частиц (PIV). Этот метод является рутинным при изучении гидродинамики и может генерировать поля потока в отсутствие индивидуально отслеживаемых частиц в жидкости. PIV использовался для измерения потоков цитоплазмы на основе визуализации субклеточных везикул и других особенностей, видимых в цитоплазме с помощью микроскопии проходящего света¹⁴.

1. Загрузите PIVLab, пакет MATLAB для PIV, с веб-сайта http://pivlab.blogspot.com/.
2. Загрузите стек изображений tiff для каждого видеоряда в программу PIV в MATLAB.
3. Вручную сгенерируйте маску для каждого стека изображений, чтобы замаскировать области исходных данных за пределами тела Stentor.
4. Установите PIVLab для использования параметра быстрого преобразования Фурье и размера ячейки 64 x 64 пикселя, которая будет объединять пиксели в каждом кадре в более крупные квадратные пиксели.
5. Запустите PIVLab для вычисления взаимных корреляций между пикселями в каждом кадре и соседними пикселями в следующем кадре, чтобы получить зависящий от времени вектор потока с центром в каждом биннинге пикселя, который имеет такое же временное разрешение, как и наши исходные данные.
6. Вычисление средних временных значений результирующего векторного поля для построения линий тока для сравнения данных, полученных с помощью стентора до резки и во время заживления ран, а также вычисление гистограмм скоростей потока (для изучения силы потока) и изменения скорости в заданном пикселе с течением времени (для изучения колебаний потока).
7. Для последовательностей изображений со стентором, расщепленным пополам, и заметной утечкой цитоплазмы в окружающий буфер, рассчитайте общий поток цитоплазмы обратно в тело клетки, умножив среднюю скорость потока на площадь поперечного сечения основания внеклеточного пузыря цитоплазмы.

Результаты

Используя описанные выше протоколы, было обнаружено, что цитоплазма Stentor удивительно динамична, как до, так и после разреза. На видео 1 показан обширный поток цитоплазмы, присутствующий в неразрезанных клетках. Несмотря на то, что мы изначально предполагали, что способность Stentor выжить при резке будет включать в себя затвердевание или гелеобразование цитоплазмы, на самом деле, когда клетки Stentor разрезаются с достаточной силой, чтобы вытянуть цитоплазму из клетки, цитоплазма остается высокодинамичной и умудряется возвращаться обратно в клетку направленным образом (видео 2).

В дополнение к демонстрации ранее неизвестной степени цитоплазматического движения во время заживления ран, высокое разрешение визуализации в анализе может быть использовано для количественной оценки скоростей потока с помощью скорости изображения частиц. Возможность проведения таких измерений позволит тщательно проверить действие химических ингибиторов.

Рисунок 1. Морфология живой клетки Стентора. Темнопольное изображение живой клетки Стентора, которую кормили хламидомонами, как описано в процедуре 1.3, видно как зеленый материал внутри пищевых вакуолей. Ротовой аппарат, через который клетка питается, виден в виде ободка ресничек в верхней части изображения. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Рисунок 2. Подготовка стеклянной иглы к операции. (А) Игла вытягивается из конца цельного стеклянного стержня. (B) Большое увеличение кончика иглы, указывающее на длину и остроту, необходимые для операции. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Рисунок 3. Специальный держатель покровного стекла для микрохирургии. Чтобы обеспечить открытый доступ для хирургии и обеспечить оптимальные условия визуализации, клетки устанавливаются на покровное стекло, а не на толстое предметное стекло. Для того, чтобы покровная крышка поместилась на предметном столике микроскопа, с помощью 3D-принтера можно изготовить пластиковый держатель. Держатель имеет те же размеры, что и стандартное предметное стекло микроскопа, при этом углубление посередине совпадает с размерами покровного стекла. Отверстие в одном углу позволяет вытащить покровное стекло из держателя. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Рисунок 4. Конфигурация двухэтажного микроскопа. Головка препарирующего микроскопа устанавливается поверх головки окуляра инвертированного микроскопа. Лабораторная лента позволяет быстро собирать и разбирать аппарат после завершения эксперимента. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение.

Видео 1. Пример цитоплазматического потока, наблюдаемого в живой клетке Стентора. Изображение ячейки получено с помощью 10-кратного объектива с темнопольной оптикой со скоростью 2 кадра/сек.

Видео 2. Яизучаю ячейку Стентора во время ее разрезания и разрушения стеклянной иглой. После разрезания значительное количество цитоплазмы вытягивается из основного тела клетки, но она быстро течет обратно в клетку.

Обсуждение

Наиболее важным применением этого метода будет использование его для определения молекулярных путей, которые регулируют цитоплазматический кровоток во время заживления ран в Stentor. Существует широкий спектр химических ингибиторов, которые нацелены на моторные белки, а также на компоненты цитоскелета. Ингибиторы кальциевой сигнализации также могут быть вероятными кандидатами. Также было бы интересно удалить или уменьшить количество пигментных гранул (экструсом), содержащих синий пигмент Стенторин, высвобождение которого из клетки запускается под действием стресса, и выяснить, как экзоцитотическое высвобождение Стенторина может повлиять на поток близлежащей цитоплазмы. Пигмент может быть истощен с помощью простого отбеливающего средства¹⁵ , которое может быть выполнено непосредственно перед резкой. По-видимому, не существует простого способа параллельного проведения анализа заживления ран, поскольку клетки необходимо разрезать и визуализировать по одной. Таким образом, используя один микроскоп, можно было бы оперировать и измерять клетки со скоростью примерно 1 раз в 0,5 часа, так что в течение одного рабочего дня должно быть возможно получить достаточно точек данных для одного соединения, чтобы определить, оказывает ли оно статистически значимое влияние на процесс. Несмотря на то, что метод ни в коем случае не отличается высокой пропускной способностью, будет абсолютно осуществимо провести скрининг на выбранном наборе соединений-кандидатов, специфичных для нескольких тщательно выбранных целевых путей.

Основным ограничением современного подхода является относительно грубый метод сборки двухэтажного микроскопа. Если предположить, что инвертированный микроскоп, используемый для визуализации, является инструментом общего пользования, который другие работники должны использовать для других целей, важным соображением является легкость, с которой аппарат может быть разобран и собран заново. Несмотря на то, что данный метод с использованием лабораторной ленты действительно быстр и легко разбирается, он требует тщательного выравнивания со стороны пользователя во время сборки каждый раз. Поэтому важной модификацией будет создание индивидуального съемного держателя с прорезями для головки окуляра инвертированного эндоскопа и корпуса препарирующего прицела. Это должно быть легко изготовлено с использованием современных технологий 3D-принтера.

Вторым ограничением подхода является зависимость от ДВС-визуализации внутриклеточных органелл в качестве маркеров потока. Поскольку идентичность этих органелл, наблюдаемых в микроскопе, в настоящее время неизвестна, невозможно узнать их размер или потенциальное взаимодействие с другими клеточными компонентами. Поэтому может быть целесообразно вводить внешние индикаторы, такие как флуоресцентные шарики, и использовать их для отслеживания потока. Однако для этого потребовался бы дополнительный шаг - микроинъекция - перед проведением эксперимента, что еще больше замедлило бы анализ.

Последним ключевым ограничением является зависимость от одной плоскости изображения для сбора данных. Первостепенное значение этого анализа заключается в том, что он выходит за рамки простого вопроса о том, заживает рана или нет, и позволяет провести детальный анализ структуры течения. В связи с этим будет крайне важно расширить визуализацию до трехмерной визуализации. Текущий метод визуализирует одну фокальную плоскость, и, таким образом, когда выполняется анализ PIV, результатом является срез всего трехмерного поля потока. Это информативно, но неполно. Получая 3D-изображения на каждом временном этапе, можно получить полностью трехмерное поле потока. Это будет особенно важно для наблюдения за тем, как именно цитоплазма движется в непосредственной близости от места раны.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Stentor coeruleus живая культура	Carolina Biological	131598
Метилцеллюлоза, 1,500 cP	Sigma	M0387
ОБОРУДОВАНИЕ:
Название материала	Номер в каталоге		компании
Стержень для перемешивания из мягкого стекла 5 в длинном	Fisher Scientific	11-380A
Тарелка для культуры 4,5 в 250 мл  стекло	Carolina Biological	741004
IX81 инвертированный микроскоп	Olympus
Axiovert 200M инвертированный микроскоп	Zeiss
Stemi 2000 Стереомикроскоп	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD камера	Фотометрический
план Apo 20X объектив	Olympus	UPLSAPO