Методическая статья

Двухфотонное Кальций изображений на мышах навигации среда виртуальной реальности

DOI:

10.3791/50885

⸱

20 февраля 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, 2Max Planck Institute of Neurobiology, 3Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем экспериментальные процедуры, связанные с двухфотонного визуализации мыши коры во время поведения в виртуальной среде реальность.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы изображений двухфотонного стал бесценным инструментом в области неврологии, так как он позволяет хронической измерения активности генетически определенных клеток в процессе поведения 1-6. Здесь мы опишем методы для выполнения визуализации двухфотонного в мыши коры, пока животное переходит виртуальную среду реальность. Мы ориентируемся на аспектах экспериментальных процедур, которые являются ключевыми для визуализации в ведет себя животное в ярко освещенном виртуальной среде. Ключевые проблемы, которые возникают в этой экспериментальной установки, что мы здесь адрес являются: минимизация движения, связанные артефакты мозга, минимизируя проникновение света от системы виртуальной реальности проекции, и сведение к минимуму лазерный индуцированного повреждения тканей. Мы также предоставляем образец программного обеспечения для управления виртуальной средой реальность и сделать отслеживание зрачка. С помощью этих процедур и ресурсов должно быть возможно преобразовать обычный двухфотонного микроскопа для использования в себя мышей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двухфотонное визуализации показателей кальция (генетически закодированных как GCaMP5 7 или R-GECO 8 или синтетических красителей, как НГБ или Fluo4) стала мощным методом измерения нейронной активности в себя мышам 1-6. Это позволяет одновременное измерение активности сотен клеток в почти один потенциала действия разрешения, до примерно 800 мкм ниже поверхности мозга 9,10. Кроме того, использование генетически кодируемых показателей кальция (GECIs) нейронную активность может быть измерена хронически 5,11,12, и в генетически определенных типов клеток 13. Вместе эти методы обеспечивают степень временным и пространственным разрешением, что открыть множество новых возможностей в изучении нейронов вычислений в естественных условиях.

Хирургическое вмешательство необходимо разоблачить и маркировать мозг мыши для работы с изображениями. Клетки трансфицировали, как правило, с использованием рекомбинантного адено-ассоциированный Vir нам (AAV) система для Geci доставки и черепной окна имплантируется в течение месте инъекции, чтобы получить оптический доступ к мозгу. Глава бар затем прикрепляется к черепу для головы фиксации под двухфотонного микроскопа. На разработку и внедрение этих шагов имеет решающее значение, поскольку большинство проблем с активного воображения возникают из нестабильности в подготовке. В идеале процедура, описанная здесь должна позволять хронической визуализации до нескольких месяцев после операции.

Чтобы включить визуально руководствуясь поведение во время съемки двухфотонного, глава фиксированной мышь сидит на воздушной поддержке сферической беговой дорожке, которая может использоваться для перемещения виртуальной среды реальность. Передвижение мыши на беговой дорожке соединен с движением в виртуальной среде, которая отображается на тороидальной экране, окружающем 14,15 мыши. Поведенческие переменные, такие как передвижения, визуальный стимул, и положение зрачка могут быть записаны 6.

т "> Описаны процедуры, связанные с хронической двухфотонного изображений на мышах, исследуя виртуальную среду реалити Ключевые моменты рассмотрены следующие:. сокращение артефактов движения, сокращение светового утечки, максимизация количества одновременно записанных клеток, и минимизация повреждение фото. Мы также представить подробную информацию о настройке воздуха поддержке беговую дорожку, отслеживание зрачка, и виртуальную среду реальность. Процедуры, описанные здесь, могут использоваться для работы с изображениями флуоресцентно меченных клеточных популяций в голове фиксированных мышей в потенциально широкого спектра поведенческих парадигм .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные процедуры были утверждены и осуществляются в соответствии с руководящими принципами Департамента ветеринарии Кантона Базель-Штадт.

1. Аппаратное и программное обеспечение установки

  1. Двухфотонное установки сканирующий микроскоп:
    1. Используйте импульсный инфракрасный лазер в качестве источника освещения (широтно-импульсной <120 фс).
    2. Используйте сканирование головы, состоящую из 8 или 12 кГц резонансного сканера и стандартным гальванометра. Примечание: Это позволяет частотой кадров 40 или 60 Гц в 750 х 400 пикселей. Высокой частотой кадров имеет решающее значение для минимизации движения мозга индуцированных искажений изображения. Кроме того, быстро резонансные результаты сканирования с более высоким выходом сигнала и уменьшает фотообесцвечивания 16 и фототоксичность.
    3. Используйте пьезоэлектрическим высокоскоростной Z-степпер, чтобы последовательно времени приобретают чередующиеся изображения на нескольких глубинах Примечание:. Это необязательно и используется для повышения урожайности данных за счет частоты смены кадров.
    4. Используйте утраМеханические характеристики подавитель сократить лазерного воздействия на ткани. Регулировка ширины в зависимости от гашения амплитуды резонансного сканера. Примечание: В связи с синусоидальным характером пути сканирования резонансного сканера, лазерный луч движется сравнительно медленно сканирования точек оборотных. Для предотвращения повреждения ткани в этих оборотных точках, где лазерное облучение является величайшим, механический подавитель вводится в фокальной плоскости между сканирования и трубных линз, который останавливается лазерный луч.
    5. Для получения данных использовать высокоскоростную дигитайзер (800 МГц) в сочетании с массивом поля-программируемой вентильной (FPGA). Примечание: FPGA высокочастотные фильтры и баки сигнал ФЭУ в пикселях. Сочетание фильтр высоких частот на FPGA и эффективного фильтра нижних частот на результат усилителя ФЭУ в полосовой фильтр по центру примерно вокруг частотой повторения лазера (80 МГц). Образец FPGA код предоставляется в качестве дополнения.
  2. Воздушный поддержке установки беговой дорожке на основе дизайна Dombeck и коллег 2
    1. Подключите держатель мяч к линии подачи воздуха с помощью подачи воздуха трубу не менее 10 мм с внутренним диаметром. Максимально сечение держателя мяч входе подачи воздуха и поместите достаточное количество труб между основной подачи воздуха и держателя шарика. Примечание: Увеличение сечения и увеличение длины трубопроводов подачи воздуха снижает образование шума.
    2. Поставьте пенополистирола мяч (20 см в диаметре) в специально разработанная и 3D-печатных держателя шара.
    3. Если поведенческая парадигма требует только вперед (или назад) передвижения, ограничить движение мяча в горизонтальное (шаг) оси, вставив палец (например, 19 G иглы для подкожных инъекций) на стороне шара. Примечание: Обычно животные приспосабливаются к установка гораздо быстрее в этом пониженном парадигмы вращения.
    4. Движение трек шара, используя один или два оптических компьютерных мышейдля обнаружения движения вокруг двух или всех трех осей, соответственно. Примечание: В компьютерных мышей в идеале должны работать с инфракрасным диодом для наименьшего вмешательства в визуализации.
  3. Настройка виртуальной среды реальность
    1. Подготовьте виртуальную среду реальность Примечание:. A образец среды на основе Panda3D, свободно распространяемой игрового движка, предоставляется в качестве дополнения. Объектами виртуальной среде генерируются с использованием wings3d, с открытым исходным кодом 3D-моделирование. Типовая программа читает информацию о местоположении на карте сбора данных и переводит это в движение в виртуальной среде. Код также выполняет нелинейное преобразование, необходимое для окружающей среды, которые будут проецируется на тороидальной экране. Подробная конструкция тороидального экрана было описано в другом месте 14,17.
    2. Используйте светодиодные проекторы или светодиодной подсветкой компьютерные экраны для отображения виртуальной среды. Интегрировать стробирования CIRЗПИФ для быстрого мерцания светодиодов во время съемки. Примечание: врожденная проблема в двухфотонного визуализации во время визуальной стимуляции является свет утечка, происходящих из зрительной системы стимуляции, который может быть уменьшен путем экранирования цели. Тем не менее, свет утечка от зрительной системы стимуляции может быть полностью отменена путем синхронизации светоотдачи проектора к оборотных точек резонансной сканера (когда данные не собираются), как это делается со светодиодными аренах, используемых для визуальной стимуляции во время съемки в Drosophila 18. Это приводит к эффективной высокоскоростной чередованием визуальной стимуляции и сбора данных (см. Рисунок 2). Частота мерцания (24 кГц) на несколько порядков выше порога мерцания слияния, выше которой мерцание больше не воспринимается животного. Электрическая схема этой модификации с коммерческой светодиодный проектор показан на рисунке 3.
  4. ЩенокОтслеживание Ир
    1. Используйте видеокамеру на основе CMOS (30 кадров в секунду) для отслеживания положения ученик. Убедитесь в том, что камера не содержит инфракрасный фильтр блокировки Примечание:. Ученик виден высокой контрастностью во время записи из-за постороннего света от лазера возбуждения двухфотонного выходящего через глаз. Положение зрачка и диаметр добывается в реальном времени, используя пользовательский запрограммированные программного обеспечения на основе конструкции Sakatani и Иса 19.

2. Инъекция Индикатор Генетическая кальция и Window Implant

Инъекция индикатора кальция 20 и имплантации черепной окна 21 выполнены, как описано выше со следующими добавками:

  1. Введите вирус в интересующей области с использованием впрыска стеклянной пипетки, засыпанной вирусом решения и подключенный к системе впрыска давление. Отрегулируйте давление в зависимости от пипетки внутрипартийнойдиаметр, как правило, ок. 70-140 мбар, чтобы придать около 100 нл раствора вируса в течение 1-2 мин. Импульсы низкого объема впрыска, поставляемые на низкой частоте (0,05 сек импульсов с частотой 2 Гц) должны быть использованы в целях предотвращения переполнения вируса на пипетки во время инъекции. Примечание: В целях контроля за объемом впрыска, пипетка может быть отмечено в небольшой , равномерно распределенных длины (например, 0,5 мм) под стереомикроскопом. Смещение мениска между отметками могут быть использованы для оценки Вводимый объем.
  2. Несколько недель после инъекции это должно привести к болюса плотно меченых клеток с диаметром приблизительно 500 мкм. Эффективность Geci экспрессии в области, представляющей интерес, зависит от выбора Geci и комбинации промотора, а также инфекционного титра и серотипа рекомбинантного AAV используемого Примечание:. В качестве представительного примера, инъекция AAV2/1-EF1α-GCaMP5 с вирусная синицаэ из 8 х 10 12 GC / мл в первичной зрительной коры головного результатов мыши в удовлетворительном выражения в приблизительно две недели после инъекции (рис. 1).
  3. Бар голова не должна препятствовать поле зрения мыши, но должны быть достаточно жесткими, чтобы обеспечить стабильное изображение во время поведения. Обычно для этого требуется две точки присоединения по обе стороны от главного меню (см. Рисунок 1). Чтобы прочно прикрепить голову бар к черепу, убедитесь, чтобы максимизировать и высушите область подвергается черепа, где глава бар будет прикреплен. Кроме того, использование скальпель или шприц, поцарапать череп, чтобы создать поверхностные канавки таким образом, увеличивая площадь поверхности для приклеивания. Накройте кости клеем цианакрилат ткани перед установкой головки бар с зубным цементом.

3. Методика эксперимента

  1. От двух до трех недель после вирусной инъекции, проверить черепной окна имплантат для ясности и выражения под эпифлуоресценции освещение. Хорошо видны и резко определенные границы поверхностных кровеносных сосудов являются хорошим показателем, что окно имплантат подходит для работы с изображениями (см. рисунок 1).
  2. Измерение и регулировать мощность лазера до величины ниже 50 мВт на образце.
  3. Включите воздушного потока к сферической беговой дорожке.
  4. Для головы фиксации под микроскопом, кратко обезболить животное изофлураном, чтобы уменьшить напряжение. Место животное в изофлурана анестезии контейнер и не ждать, пока остановки животных перемещения (около 10 сек). Снимите животное и сразу голова исправить под микроскопом.
  5. Расположите систему визуального отображения как можно ближе к животному, чтобы по-прежнему позволяют для доступа к животному. Чем меньше визуальный контакт животное имеет с экспериментатором, меньше подвержены стрессу, животное будет на начальном этапе эксперимента.
  6. Убедитесь, что черепная окно имплантат от пыли и грязи. Чистый водойесли это необходимо.
  7. Применить четкое ультразвуковое гель как иммерсионной среды между черепной окна и водно-иммерсионного объектива. Это решает проблемы медленного ухудшения качества изображения за счет испарения воды или утечки и избавляет от необходимости монтировать конус на голове бар, чтобы удерживать воду. Примечание: Центрифуга гель перед использованием, чтобы удалить все пузырьки воздуха, и заботиться, чтобы не создавать никаких воздух пузыри во время нанесения геля. Воздушные пузырьки могут серьезно ухудшить качество изображения.
  8. Оберните часть черной лентой вокруг объективной и головной бар для защиты от света.
  9. Перемещение на арену виртуальной среде в конечное положение и настроить видео камеру для отслеживания зрачка.
  10. Установите лазерный подавитель, чтобы соответствовать амплитуду сканирования используется во время эксперимента.
  11. Начало записи данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Качество изображения в двухфотонного визуализации кальция клеточных популяций меченых с Geci во многом зависит от качества черепной окна имплантата. Две недели следующие Вирус инъекцию черепной окно должно проверяться для ясности. Там не должно быть грануляционной ткани или костного отрастание видно (рис. 1А). Кроме того, картина поверхностных кровеносных сосудов должны оставаться неизменными и границы сосудистой следует четкий. В то же время, выражение Geci также могут быть проверены. Боли меченых клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ключ к успеху поведенческой изображений двухфотонного является стабильность препарата в двух направлениях:

  1. В течение суток после окна имплантации, воспалительные реакции из ткани может привести к усилению формирования грануляционной ткани и хряща, которые будут затруднять или даже предотвратить изображений.
  2. В ходе эксперимента мозг должен быть достаточно стабильным, чтобы предотвратить артефакты движения от развращает нейронной активности связано сигнала флуоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Фондом Фридриха Miescher Института медико-биологических исследований, Общества Макса Планка, и науки программы по правам границ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Покровные стекла (диаметр = 3-5 мм)Мензельокно имплантат
InSight DeepSee лазерныйSpectra-Physicsмикроскоп
12 кГц Резонансный сканерCambridge TechnologyG1-003-30026микроскоп
GalvometerCambridge TechnologyG6215Hмикроскоп
ДигитайзерNational InstrumentsNI 5772микроскоп
FPGANational InstrumentsPXIe 7965R
микроскоп Карта сбора данныхNationalInstruments Микроскоп PCIe 6363
Фильтр излучения 525/50SemrockFF03-525/50-25
Микроскоп Пьезоэлектрический z-приводPhysikinstrumenteP-726.1CD
микроскоп Контроллер для пьезоэлектрика приводPhysikinstrumenteE665 LVPZTмикроскоп
Объектив 16X, 0.8NAМикроскоп NikonCFI75
Усилитель токаМикроскоп FemtoDHPCA-100
ФотоумножительМикроскопHamamatsu
USB Камера без ИК фильтраImagingSourceDMK22BUC03слежение
за зрачкомОбъектив 50 ммImagingSourceM5018-MPдля отслеживания зрачков
Макроадаптерные кольцаImagingSourceLAexSetдля отслеживания зрачков
Оптическая компьютерная мышьLogitechG500для отслеживания движений
Пенопластовый шарик 20 см, например, idee-shop.de08797.00.15виртуальная среда
Светодиодный проекторSamsungSP-F10Mвиртуальный среда
Карта приобретенияNational InstrumentsNI 6009виртуальная среда
Panda3D игровой движокwww.panda3d.orgvirtual environment
Numpy библиотека для Pythonwww.scipy.orgvirtual environment
Scipy библиотека для Pythonwww.scipy.orgvirtual environment
NI-DAQmx driverNational Instrumentswww.ni.comvirtual environment
Ультразвуковой гельDahlhausen5701.0342.10imaging

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
  2. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
  3. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  4. Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
  5. Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
  6. Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
  7. Akerboom, J., Chen, T. -W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  8. Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  9. Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
  10. Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
  11. Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  12. Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
  13. Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  14. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
  15. Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
  16. Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
  17. Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
  18. Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
  19. Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
  20. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  21. Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LED

Похожие статьи