Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Проектирование Silk-протеинов шелка и сплавы для биомедицинских применений

17.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50891

⸱

13 августа 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

В этой статье

Краткое содержание

Смешивание является эффективным подходом к генерации биоматериалы с широким диапазоном свойств и комбинированных функций. По прогнозирования молекулярных взаимодействий между различными естественно протеинами шелка, новые шелк-шелк сплава белок платформы с перестраиваемой механической упругостью, электрического ответа, оптической прозрачности, химической технологичности, способности к биологическому разложению, или термической стабильности могут быть разработаны.

Аннотация

Волокнистые белки отображения различных последовательностей и структур, которые были использованы для различных применений в биомедицинских областях, таких как биосенсоры, наномедицины, регенерации тканей и доставки лекарств. Проектирование материалов на основе молекулярного масштаба взаимодействий между этими белками поможет генерировать новые многофункциональные сплава белок биоматериалов с перестраиваемой свойств. Такие сплава системы также обеспечивают преимущества по сравнению с традиционными синтетическими полимерами в результате к биологическому разложению материалов, биосовместимости и tenability в организме. Эта статья используется белковые смеси дикого Tussah шелка (Antheraea pernyi) и внутреннего шелка шелковицы (Bombyx Mori) в качестве примера, чтобы обеспечить полезные протоколы по этим темам, в том числе, как предсказать белок-белковых взаимодействий расчетными методами, как производят сплав белка решения, как проверить сплава системы с помощью термического анализа, и как изготовить переменных материалы сплавав том числе оптических материалов с дифракционных решеток, электрических материалов с цепей покрытий и фармацевтических материалов для выпуска и распространения лекарственных средств. Эти методы могут дать важную информацию для разработки многофункциональных биоматериалов нового поколения на основе различных белковых сплавов.

Введение

Природа создала стратегии для генерации перестраиваемых и многофункциональные биологические матрицы, используя ограниченное количество структурных белков. Например, эластины и коллагены всегда используются вместе в естественных условиях, чтобы обеспечить регулируемые сильные и функции, необходимые для конкретных тканей 1,2. Ключ к этой стратегии является смешивание. Смешивание включает смешивание белков с определенных соотношениях и является технологический подход для создания простых систем материалов с перестраиваемой и разнообразных свойств 3-5. По сравнению с синтетическими инженерных стратегий 6,7, смешивание может также улучшить материальную однородность и способность обрабатывать материал благодаря легкости работы 8-16. Поэтому проектирование многофункциональных биосовместимых сплавов белок материалы является новой областью медицинских исследований. Эта технология также будет предоставлять систематические знания о влиянии природных белковых матриц на клеток и тканей функций как в витро и в естественных условиях 10,17. Оптимизируя молекулярные взаимодействия между различными белками, на основе белка сплавы могут охватывать широкий спектр физических функций, таких как термическая стабильность при разных температурах, эластичность, чтобы поддержать различные ткани, электрический чувствительность в переменных органов и оптических свойств для регенерации роговицы ткани 3, 18-27. В результате этих исследований даст новый белок-материалы платформу в области биомедицинской науки и имеет непосредственное отношение к перестраиваемых ремонта тканей и лечения заболеваний и привести к дальнейшему биоразлагаемых имплантатов устройств, где их новые терапевтические и диагностические признаки можно предусмотренных 3.

Многие природные структурные белки имеют критические физические и биоактивными свойствами, которые могут быть использованы в качестве кандидатов на биоматериала матриц. Шелка из разных видов червей, Кератины от волосков и шерсти, эластины и коллагенов разных тканей, иразличные растительные белки являются одними из наиболее распространенных структурных белков, используемых для проектирования переменных материалы на основе белков (Рисунок 1) 18-27. В общем, эти белки могут образовывать различные молекулярные вторичные структуры (например, бета-листы для шелка или спиральный катушки для кератинами) благодаря своим уникальным повторяющихся последовательностей первичной аминокислотной 3,28-35. Эти особенности способствуют формированию самоорганизующихся макроскопических структур с уникальными функциями в биологических интерфейсов, побудивших их полезность в качестве заветной ресурса биополимеров материалов. Здесь были использованы два типа структурных белков (белок от диких Tussah шелка и белка В от домашних шелка шелковицы в качестве примера), чтобы продемонстрировать общие протоколы производстве различных сплавов белок биоматериалов. Протоколы продемонстрировали включают часть 1: прогнозы взаимодействия белка и моделирования, часть 2: производство сплавов белок решений и участие 3: изготовление сплава белкасистемы и для оптических, электрических и фармацевтической промышленности.

figure-introduction-1
Рисунок 1 Сырье различных структурных белков, которые обычно используются в нашей лаборатории для разработки на основе белков материалы, в том числе шелка из разных видов червей, Кератины от волосков и шерсти, эластины из разных тканей и различных растительных белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 Прогнозирование белковых взаимодействий

  1. Bioinfomatics анализа белковых молекул
    1. Посетите Национальный центр биотехнологической информации сайта (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), и поиск названия белков, которые будут использоваться для изучения сплава. Примечание: В данном примере были использованы два белка: белок А, который является дикая Tussah фиброин шелка и белка В, который является внутренний шелковицы фиброин. Для белка А, аминокислотные последовательности можно найти в "фиброина [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi является китайцев (дуб) Tussah Moth). Для белка В, аминокислотные последовательности можно найти в "фиброин тяжелой цепи предшественника [Bombyx мори] NCBI эталонной последовательности: NP_001106733.1" и "фиброин легкой цепи предшественника [Bombyx мори] NCBI эталонной последовательности: NP_001037488.1" вместе (Bombyx Мори одомашненные шелкопряда из тутового дерева).
    2. Выберите и саВ.Е. аминокислотные последовательности белка А и белка В из базы данных.
    3. Посетите веб-сайт ExPASy (SIB Биоинформатика ресурсов Portal) (www.expasy.org) или использовать другое коммерческое программное обеспечение для расчета основных bioinfomatics данные белков на основе их последовательностей в том числе, но не ограничиваясь, полного заряда на молекулу, гидрофобность индекс молекула, кривая титрования молекул при различных значениях рН, и т.д. Эта информация будет использоваться в качестве базовых элементов для вычислительного моделирования белковых взаимодействий, и поможет понять, является ли эти два белка имеют сильные взаимодействия. [Примечание: Этот шаг не для точного предсказания каждую деталь взаимодействия белка, как те, которые используются в небольших пептидов или функциональных белков науки. Цель этого раздела только избежать получения белка смесь с очевидными макрофаза разделений, которые не могут быть названы "сплав" материал. Поэтому оценка может быть приблизительны но гое сплава белок система может быть проверена путем экспериментального метода, описанного в пункте 3.1 с помощью точного термического анализа].
  2. Компьютерное моделирование белка системы Alloy
    Ниже описана процедура для имитации сплава системы белок. Программа моделирования написана на языке программирования C, который может использоваться на одной или многопроцессорной компьютерной системы. Решетка-весна-масса (LSM) модель была использована для имитации сплава-белки 36-39. LSM модель дает простое описание результирующей силы на массу при подключении к источнику, и можно решить уравнение силы, чтобы понять движение для каждой массы. Простой алгоритм программы для моделирования этого сплава белок систему с использованием модели LSM задается следующим образом:
    1. Представляют собой единый белок как крупнозернистого частицы, которая имеет массу м.
    2. Используйте Hookean или нео-Hookean весну, чтобы обозначать связь 38,39. По взаимосвязанных конечное число частиц с пружинами, одна банка маке домен суб-сплава, который представляет стабильный строительный блок сплава-белков. Для представления различных типов связей в внутрисетевого связи, использовать различные жесткости пружины / жесткость.
    3. Модель системы сплава белок в качестве материала, состоящего из тускло-сшитых суб-сплавов. Опять здесь различные жесткости использовались для представления различных связей между взаимосвязей в суб-сплавов.
    4. Смоделируйте разрыв связи и процесс реформирования на Bell Model 40,41, через которые слабые связи позволено будет реформирована, но прочные связи не может реформировать, как только они разбиты. Когда система достаточно подчеркнул (как на внутри-suballoy и между suballoy облигаций), облигации могут быть разбиты и реформировать.
    5. С целью изучения эффектов деформации на сплава-белков, когда они подчеркнуто, применяются внешние силы к системе. Распределить эти силы в равной степени к каждой частицы при решении уравнения силы (законы Ньютона).
    6. Для моделирования взаимодействиймежду раствором (например, молекул воды) и белков, применять дополнительную силу сопротивления или силы трения в каждой частице.
    7. Решить уравнение силы для каждой частицы с действиями каждой силы (сила пружины от облигации, внешней силы, и силы трения).
    8. Рассчитать и извлечь позиции белковых частиц в виде функции времени.
    9. Рассчитать физические величины, характеризующие сплава-белки от положения частиц.
    10. Изменение жесткости облигаций в программе, чтобы понять взаимодействие между различными белками. (Средняя жесткость облигаций рассчитывается от модуля Юнга белковых материалов. Модуль Юнга различных волокнистых белковых материалов могут быть получены либо путем Всеобщей испытание на растяжение 18, или непосредственно из предыдущих литератур 2-4,18).

2 Производство белковых сплава Solutions

Дикий шелк Tussah (белок А) и внутренний шелковицы (белок В) выбраны в качестве примера системы сплава белка. Этот протокол первого представляет, как получить дикий Tussah шелк (белок) решение.

  1. Вырезать сырые диких Tussah шелковые коконы или волокна при весе 3 г.
  2. Мера 3 г бутилдикарбоната натрия или карбонат натрия (Примечание: При использовании карбоната натрия, молекулярная масса белковых цепей приведет к снижению в процессе кипения 42).
  3. Заполните 2 л стеклянный стакан с дистиллированной водой (H 2 O). Тогда, стакан поместить на горячей стадии, покрыть ее с алюминиевой фольгой, и тепла до кипения.
  4. Снимите крышку из алюминиевой фольги и добавить измеренное дикарбонат натрия медленно в кипящую воду, что позволяет ему полностью раствориться. (Примечание: Роль дикарбоната натрия является "мыло" счистить растворимые белки серицин и других примесей, прикрепленные на поверхности диких волокон шелка При использовании противном.э природа белковые волокна, выберите соответствующие химические вещества в соответствии с литературой).
  5. Добавить сырые белковые волокна (дикие шелковые волокна) в кипящую воду и дать закипеть на 2-3 часа (Примечание:. Время кипения имеет решающее воздействие на молекулярной массы белковых цепей 26,43 Нужно выбрать подходящее время в соответствии в литературе, или путем выполнения контрольных экспериментах 26,43. температура кипения также может быть отрегулирована, чтобы воздействовать на молекулярную массу белковых цепей 26,43,44).
  6. После кипячения осторожно снимите белковые волокна с помощью шпателя из раствора и сжать их, чтобы удалить лишнюю воду. (ВНИМАНИЕ: Волокна очень горячие!)
  7. После этого, опустите волокна в 2 л стакан с холодной дистиллированной воды, и мыть волокон в два раза в течение 30 мин каждый, чтобы полностью удалить нечистые остатки с поверхности волокна. Высушите волокна в вытяжном шкафу в течение не менее 12 часов.
  8. Растопить 45,784 г нит кальцияСкорость (Са (NO 3) 2) в стеклянном стакане с образованием жидкости при 65 ° С для растворения дикого шелка белковых волокон. (Примечание: При использовании других природных белковых волокон, выберите соответствующий растворитель для растворения белков Здесь вы также можете использовать 9,3 М LiSCN или LiBr решение, или 85% раствор фосфата для растворения различных шелковых волокон..)
  9. Объединение волокон и растворитель в соотношении 1 г волокна в 10 мл растворителя. Разрешить волокна, чтобы растворить при 95 ° С в течение от 5 до 12 часов. (Примечание: Время растворения зависит от молекулярной массы белков 26,43-45)
  10. Использование шприцы, инъекционные дикого шелка раствора в 12 мл диализа кассеты (не более 1000 МВт как размер среза) или запечатанные диализа шланги (максимум 1000 МВт, как размер среза) и диализ против 2 л дистиллированной воды. (Примечание: впрыска является более эффективным, если поддерживать раствор при 35 ° С, в противном случае вязкость раствора белка резко возрастет при комнатной температуре). Измените дистиллированную воду часто, чтобы удалить Ca (NO 3) 2 растворители в растворе (через 30 мин, 2 ч, 6 ч, а затем каждые 12 ч в течение 3 дней. В общей сложности, будет примерно 8 подмены воды).
  11. После 3-х дней, собирают белковые растворы из диализной кассеты или трубки и поместить в 13000 оборотов в минуту рейтингу труб.
  12. Центрифуга решения течение 1 ч при 3500 оборотах в минуту при температуре 4 ° С в 3 раза для удаления отложений. После каждого центрифуге, быстро вытащить супернатант в новые пробирки. Храните окончательные решения в 4 ° C холодильнике.
  13. Налейте 5 мл раствора белка на полидиметилсилоксана (PDMS) подложки или другой плоской гидрофобной подложке и позволяют ему полностью высохнуть (это, как правило, занимает более 12 ч). Взвесить оставшееся твердое вещество пленки белка и рассчитать конечную концентрацию раствора посредством массовых процентах (% вес / об) = измеренный вес (в мг) ÷ 5 (в мл) ÷ 10.
  14. Соберите другой выбранный природного белка волокна (в этом CASе, домашние шелковицы был использован в качестве белка В), и повторить процедуру с соответствующим "мыла" и растворением растворителем, пока конечный раствор белка воды с измеренной концентрацией не будет получено. [Примечание: Если белковые материалы в виде порошка, используют соответствующие пористые трубки или мембраны для хранения образцов в течение процесса "намыливал". Если белок уже был очищен, непосредственно перейти к шагу 2,8 до растворения порошка. Если белок уже очищены и растворяется в воде, сделать его водного раствора с нужной концентрации, а затем перейдите к шагу 2,15 ниже, чтобы сделать смесь белковых растворов.]
  15. Медленно разбавленной белка решение (здесь дикого шелка раствор) в дистиллированной воде при 4 ° С с образованием 1,0 мас% белка водного раствора. Сделайте то же процесс Protein B (здесь одомашнены шелка).
  16. Медленно смешать 1 мас% белка решение с Белки B растворе при 4 ° С с помощью пипетки, чтобы избежать рrotein агрегации во время смешивания. (Примечание 1: Не используйте вихревую инструмент смешивать белки, так как некоторые белки (например, шелка) образует гидрогели при вибрации 46,47 Примечание 2:. Если возможно, используйте дополнительные устройства для контроля скорости перемешивания и смешивания размер решений Обязательно смешивать их как можно медленнее, чтобы избежать агрегации. Не быстро пипетки решение во время смешивания).
  17. Конечные растворы смешивания должен иметь указанную соотношение массы или молярное отношение белка А: Белки B. Как правило, смешивают их с массовым соотношением 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90, чтобы получить Широкий спектр сплава решений. Использование чистого белка А и белка В решения в качестве контроля. Для смешивания раствора с молярным соотношением белка А: Белок B = R: (100-R). Рассчитать отношение объема смешивания (на основе одной и той же 1 мас% раствора) на: Том А: Volume B = R · (MW а): (100-R) · (МВт B).
  18. Сразу бросил окончательные решения на PDMS субстратов с образованием пленок или другой ДезиGNED материалы. (Примечание: Не храните высокой концентрации сплава белок решения в течение длительного времени Другие агрегаты могут образовывать позже в связи с белок-белковых взаимодействий в воде.). При необходимости, разбавить смесь решения с свободными ионами дистиллированной водой и держать их в 4 ° C холодильник, чтобы избежать дополнительной агрегации белков в растворах.

3 Изготовление Переменная белковых сплавы

  1. Подтвердите Alloy предсказание термического анализа 3,9,31-35
    1. Подготовьте PDMS субстраты и очистить их путем замачивания в дистиллированной воде.
    2. В ролях белка наложения решения с разных пропорциях на PDMS субстратов.
    3. Высушите решения, по крайней мере 12 часов в химической капот с потоком воздуха до пленки не образуются (Примечание: Используйте тот же объем для различных решений таким образом, чтобы толщина пленки может быть исправлено).
    4. Снимите сплава белок фильмы из PDMS субстратов и разместить их на чистой посуды.
    5. Взвесьте много Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) алюминиевые кастрюли и крышки для изучения DSC. Подходим кастрюли и крышки пар иметь равные общий вес (вес кастрюле плюс вес крышки составляет постоянный вес). Например, был использован здесь, общий вес крышкой и панорамирование 22,50 мг, и восемь наборов крышки и поддона комбинации с этой общей массы были подготовлены.
    6. Инкапсулируйте 6 мг каждый тип высушенного белка вписывается в алюминиевых ДСК кастрюли и запечатать их с их соответствующих крышек в процессе 3.1.5. Печать пустой поддон и крышка пару, которые будут использоваться с образцом в качестве эталона, так что только теплоемкость образцов сами будут записаны во время термического анализа (Примечание: DSC будет сравнить теплоемкость эталонного кастрюлю с крышкой против, что образца + кастрюлю с крышкой. Благодаря равными весами, емкость фон тепло от кастрюль и крышек, будут учитываться оставив только теплоемкость образца в кастрюле).
    7. Положите запечатанные ссылки и примеры кастрюли в ДСК, спродувают сухим азотом газового потока 50 мл / мин, и снабжен холодильной системы охлаждения. Перед началом измерений образцов, DSC инструмент первый должен быть откалиброван с сапфиром и индия для теплового потока и температуры, соответственно.
    8. Предварительно запустить ДСК при скорости нагрева 2 К / мин до 150 ° С, а затем выдержка при этой температуре в течение 15 мин для удаления оставшихся молекул воды в образцах (обычно около 3-10% от общего веса). Быстро охладить (10 К / мин) до 25 ° С.
    9. Запуск DSC снова при скорости нагрева 2 К / мин до 300 ° C, или до тех пор, пик деградации белковых смесей не появятся 34. Запишите теплоемкости образца белка при различных температурах во время этого процесса. Охладите DSC и изменить старый образец нового образца с различным соотношением смешивания.
    10. Рассчитать и построить зависимости теплоемкости температура для каждого белка смеси образца с использованием программного обеспечения DSC 31-35.
    11. Судить о мiscibility белковых смесей следующим способом (смотри рисунок 4 Термическая и фиг.5), и если эти два белка являются полностью смешивается, они могут быть названы "белок" сплавов. В противном случае термин "белок композит" будет подходящее название соответствии с полимерными описательных теорий 48,49):
      1. Отдельные белки А и В должны иметь индивидуальную одного температуру стеклования, Т г (А) и T г (В) (см зеленого и синего кривые на рисунке 5) 3,48;
      2. Это одна температура стеклования обычно промежуточными между двумя отдельными компонентами белка, T G (A) и T г (В) (рисунок 5) 3,48;
      3. Разделение смешивается фаза смесей получается, если оба Т г (А) и Т г (B) появился на исходные позиции (рисунок 5), и с каждым Т г шагомВысота в пропорции к композиции, две белки полностью не смешивается 3,48.
      4. Полу-смешивается составного типа смесь будет иметь один очень широкий стеклянный переход, или, возможно, еще два стеклянных переходов, но каждый мигрировала ближе друг к другу относительно чистых белковых компонентов, T G (A) и T G (B) ( рисунок 5). В этом случае, может быть микро-гетерогенной фазе структуры, образованные между двумя белковых компонентов, и состав может изменяться от места к месту.
    12. Если (3.1.11.1) в случае показано в ДСК, и это может быть подтверждено, что белок АВ системы сплава, а затем перейти к изготовить белковые сплавы.
  2. Изготовление оптических материалов на белковых сплавов
    1. Продукция (в изготовления лаборатории) или приобрести разработанный топографическую поверхность для литья. В этом конкретном примере, был использован стакан с четырьмя дифракционных картин (фиг.4Оптический).
    2. Поместите стакан с дифракционных в блюдо, и убедитесь, что с рисунком поверхности сталкивается вверх.
    3. Спрэд решение PDMS равномерно на поверхности стекла, и полностью покрыть образцы поверхности (Решение PDMS производится заливки и раствора катализатора в соотношении 9: 1 соотношении в соответствии с инструкцией пользователя 23,44).
    4. Поместите литейной блюдо в 65 ° C сушильном шкафу в течение по крайней мере 2 ч, а на плоской поверхности. Решение ПДМС следует высушить в твердую подложку во время этого процесса.
    5. Удалить PDMS подложку из стекла. Дифракционные теперь должны быть переданы на поверхность PDMS.
    6. Выбивать формы PDMS с дифракционных использованием подходящего дырокол.
    7. Бросьте сплава белок решения на PDMS поверхностей с дифракционных и высушить их, по крайней мере 12 часов, чтобы получить пленки с дифракционных.
    8. Для получения нерастворимых сплава белок материалы, разместить весь набор дру пленки, в том числе форм PDMS в 60 ° C в вакуумной печи (25 кПа) с водой блюдо на дне камеры. Откачать воздух в духовке, и пусть водяных паров образцы отжига в течение не менее 2 часов. (Этот процесс называется регулируемой температурой отжига паров воды 45. По сравнению с широко используемым методом метанола, он может генерировать подобное содержание бета-листа в шелковых материалов 45). Отпустите вакуум и шелушиться нерастворимый в воде пленку с PDMS подложки с помощью щипцов. Для этого примера, используются дикие шелковые-ый шелковые сплавы.
    9. Проверьте качество дифракционных о фильмах, сравнивая их с оригинальными узорами на стекле (например, собирать SEM изображения для микромасштабных деталей; собирать образцы лазерной дифракции для общего качества картины).
  3. Изготовление электрических цепей на белковых сплавах материалов
    1. Для изготовления электрического шаблон цепи на стеклянной подложке, первый КлиоNA предметное стекло с помощью некоторых обезжиривание растворителе, таком как Alconox в ультразвуковом очистителе в течение 5 мин, затем 5 мин в ацетоне, а затем 5 мин в метаноле. Метанол используется в прошлом, так как он испаряется медленнее, чем ацетон таким образом, может быть сдувается подложки, а не сушки и оставляя остатков.
    2. Удар стекло насухо сухой газообразный азот, который образуется на отпарного от 180 л жидкого азота Дьюара.
    3. Введение материалов подложки в камеру осаждения. (Эти руководящие принципы предназначены для распыления системы, но другие методы осаждения могут быть использованы.) Если камера разработана с loadlock, вакуум в камере осаждения не оказали существенного влияния. Эвакуировать из loadlock до давления 30 мторр.
    4. Откройте задвижку между loadlock и основной камере осаждения и ввести подложку в камеру.
    5. Включите газ Ar и регулятором давления и регулировать давление до желаемого depositioн давление. Более высокие давления дают более низкие энергетические распыленных атомов металла и более однородные пленки, а более низкое давление доходность лучше придерживаться быстрее пленках. Диапазон давлений составляет обычно от 3 до 60 мТорр мТорр, с 20 мТорр работает хорошо.
    6. Металлы затем проецируется на затвором, который защищает основание от покрытия с использованием радиочастотной мощности 100 Вт тюнинг схема требуется направить ВЧ мощности на металлической мишени. Питания постоянного тока может быть использован вместо РФ на металлических мишеней. Для того чтобы удалить слои оксида и загрязнений из мишени, предварительно распыления в течение нескольких минут.
    7. Открыть затвор и распыления металла на подложку. Скорость осаждения для конфигурации, описанной около 10 нм в минуту. Эта ставка будет зависеть от рабочего расстояния, давления, силы магнита в магнетронного катода, толщины мишени и металла распыленных. Отрегулируйте время осаждения для достижения нужной толщины.
    8. Снимите с покрытием предметное стекло отКамера.
    9. Использование счетчик, спина фоторезиста покрытие на поверхности пленки. Многие фоторезисты можно использовать. В этом случае, был использован позитивного фоторезиста.
    10. После резиста вращается на пленку, мягкая выпекать при 90 ° С в течение 5 мин, чтобы высушить резиста.
    11. Опубликуйте маску с изображением устройства прочно против сопротивляться. Источник ультрафиолетового света используется, чтобы выставить фоторезиста. Экспозиция 10 сек, но варьируется в зависимости от силы источника света и сопротивляются используется.
    12. Поместите пленку в разработчика фоторезиста, пока не появится проецируемое изображение. Смыв разработчиков от сопротивляться, что был выставлен для УФ-света, которые вызывают преломление полимерных облигаций. Сразу же после появления изображения, окуните фильм в дистиллированной водой, чтобы остановить разработчика от работы на необогреваемой фоторезиста.
    13. Blow фильмы сухие с сухим азотом.
    14. Поместите фильмы в печь при 120 ° С в течение 15 мин до "жесткого выпекать" фотосопротивляться.
    15. После фильмы остыть, поместите их в качестве травильного раствора, пока металл не защищен фоторезиста не взлетает. Dip в воде, чтобы остановить травление.
    16. Промывают ацетоном, чтобы удалить затвердевший фоторезиста.
    17. Промыть метанола и сушить сухим азотом.
    18. После того, как очки с покрытием готовы, падение различных решений сплава белок на поверхности стекла, и высушите их, по крайней мере 12 часов, чтобы получить литые белок фильмы на стеклах. (Предлагается первый сконцентрировать сплава решения 5 мас%, чтобы получить толстые литые белок фильмы.)
    19. Благодаря гидрофобных-гидрофильных взаимодействий, тонкие металлические пленки будут переведены из стеклянных поверхностей с прилагаемым сплава белка поверхности пленки 51. Шелушиться сплава белок фильмов с тонкими металлическими узорами из стеклянных подложек с использованием щипцов.
    20. Для получения нерастворимых сплава белок материалы, разместить сухие фильмы в 60 ° C в вакуумной печи (25 кПа) с AWВодный блюдо в нижней части камеры. Откачать воздух в духовке, и пусть водяных паров образцы отжига в течение не менее 2 часов. Отпустите вакуум и шелушиться нерастворимый в воде пленку от подложки с помощью щипцов.
    21. Проверьте электрические свойства металлических узоров на легкосплавных белок фильмах, таких как электрическое сопротивление и сравнить их с оригинальными узорами на стекле.
  4. Изготовление фармацевтических материалов на белковых сплавов
    1. Для изготовления сплава белок пленки с фармацевтических соединений, сначала подготовить PDMS подложку, как описано в шаге 3.2. Очистите образованный PDMS субстрат дистиллированной водой.
    2. Растворения или диспергирования фармацевтических соединений в водном растворе. С помощью ультразвука или вихрь, чтобы гомогенно смешивают фармацевтических соединений с водой. Если соединения не растворимы в воде, дисперсных порошков с однородным распределением в свободными ионами дистиллированной воды.
    3. Рассчитать требуемый массовое соотношениесоединений с белком сплавов: объем раствора соединения х весовых процентах раствора соединения: объема сплава раствор белка х весовых процентах раствора соединения (здесь 1 мас% раствора сплава был использован). Выбор коэффициента, чтобы получить пленку с желаемой плотности вещества в сплаве белок пленки.
    4. Медленно смешать раствора соединения с сплава раствора белкового следующей той же инструкции в разделе 2 процесса 2.16. (Примечание: Чтобы избежать образования геля, не ultrasonicate или вихрь решение во время смешивания).
    5. Налейте расчетный объем смеси на PDMS подложки и высушить его, по крайней мере 12 ч в химической капотом к получения сплава белка пленки, содержащей предназначенный соотношение количества фармацевтических соединений.
    6. Физически сшитый фильм следующий же инструкции в разделе 3.2 процессе 3.2.8. Примером сплава фильмов с нерастворимых модельных препаратов с низкой плотностью (LD) или высокой (HD) плотности можно было увидеть на рисунке 4 Химическая.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Типичный белок-белковых взаимодействий (например, между белком А и белка В) может содержать заряда-заряд (электростатические) достопримечательности, образование водородных связей, гидрофобных-гидрофильных взаимодействий, а также диполь, растворитель, противоион и энтропии эффектов между удельная домены двух белков (Рисунок 2) 3. Поэтому, в сущности, мы можем предсказать последствия этих взаимодействий по вычислительной моделирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Один из наиболее важных процедур в производстве системы белка "сплава" является проверка смешиваемость смешанных белков. В противном случае, это только не смешивается смесь белок или белковый сложная система без стабильных и перестраиваемых свойств. Экспериментальный метод термического анализа могут быть использованы для этой цели, и подтверждают их свойства сплава. Белок-белковые взаимодействия можно рассматривать в соответствии с Флори Хаггинс в решетчатой ​​модели 48, как взаимодействия между &qu...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы благодарят Rowan University за поддержку этого исследования. XH также благодаря д-р Дэвид Л. Каплан в Университете Тафтса и NIH P41 тканей Центр Инжиниринг ресурсов (TERC) для предыдущих технических тренингов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Q100 Дифференциальные сканирующие калориметры (DSC)TA Instruments, New Castle, DE, США
N/AВы можете использовать любой тип DSC с программным обеспечением для расчета теплоемкости.
SS30T Система вакуумного напыления T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, СШАN/AБлагодаря изготовленным на заказ деталям вы можете использовать любой тип системы распыления для нанесения покрытия.
Вакуумная печь VWR 1415MVWR International, Бриджпорт, Нью-Джерси, СШАН/ДВы можете использовать любой тип вакуумной печи для физического сшивания образцов.

Ссылки

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003(2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130(2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101(2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901(2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. , Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Смеси белков шелкапокрытие электронных схемрегенерация белкового раствораизготовление тонких пленоктермический анализоптические материалыэлектроматериалыфармацевтические материалыбелок-белковые взаимодействия
Проектирование Silk-протеинов шелка и сплавы для биомедицинских применений
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.