Методическая статья

Лазерная сканирующая фотостимуляция оптогенетически нацеленных контуров переднего мозга

9.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50915

⸱

27 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, 2Department of Neurobiology, University of Chicago

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод характеристики функциональной топографии и синаптических свойств цепей переднего мозга с использованием оптогенетического подхода для фотостимуляции нейронных популяций in vitro.

Аннотация

Сенсорный передний мозг состоит из сложно связанных типов клеток, функциональные свойства которых еще предстоит полностью выяснить. Понимание взаимодействий этих цепей переднего мозга в последнее время было облегчено развитием оптогенетических методов для светоопосредованной модуляции нейронной активности. В данной статье мы описываем протокол исследования функциональной организации цепей переднего мозга in vitro с использованием лазерной сканирующей фотостимуляции каналродопсина, экспрессируемого оптогенетически посредством вирусно-опосредованной трансфекции. Этот подход также использует полезность рекомбинации кре-локсов у трансгенных мышей для нацеливания экспрессии в определенных типах нейрональных клеток. После трансфекции нейроны физиологически регистрируются в препаратах среза с использованием целоклеточного зажима для измерения их вызванных реакций на фотостимуляцию канала с помощью сканирования волокон, экспрессирующих родопсин. Такой подход позволяет оценить функциональную топографию и синаптические свойства. Морфологические корреляты могут быть получены путем визуализации нейроанатомической экспрессии каналродопсина, экспрессирующих волокна, с помощью конфокальной микроскопии живого среза или постфиксированной ткани. Эти методы позволяют проводить функциональные исследования цепей переднего мозга, которые расширяют более традиционные подходы.

Введение

Сложная схема переднего мозга млекопитающих представляет собой экспериментальную задачу для анализа функциональных ролей его взаимосвязанных компонентов. Распутывание этих отношений было недавно облегчено разработкой оптогенетических методов для специфического возбуждения и ингибирования нейронных популяций и их проекций1-3. Эти подходы используют генетически контролируемую экспрессию мембранных каналов, реагирующих на свет4-6. В частности, следует отметить, что каналродопсин, светозависимый ионный канал, деполяризует мембраны нейронов после оптической стимуляции, что приводит к возбуждению экспрессирующего нейрона и его проекций4,7. И наоборот, галородопин, светозависимый хлоридный насос, гиперполяризует мембрану, тем самым ингибируя целевую проекцию6,8,9. Было сконструировано несколько вариантов этих опсинов, получены множественные векторы для трансфекции и экспрессии в популяциях нейронов, представляющих интерес, и сконструированы трансгенные линии мышей, которые конститутивно экспрессируют эти опсины или обеспечивают опосредованный крелоксом контроль их экспрессии1,2,10,11.

Полезность этих оптогенетических методов и материалов произвела революцию в современной экспериментальной нейронауке, позволив проанализировать роль специфических нейронных цепей в физиологии и поведении организма12-15. В частности, эти методы могут быть мощно применены для функционального рассечения цепей мозга с использованием препаратов среза in vitro 16-20. В этом контексте одним из основных преимуществ данного метода является возможность охарактеризовать физиологию проекций дальнего действия, которые трудно, если не невозможно, сохранить в толстом срезе, таких как спаечные связи между полушариями коры головногомозга. Кроме того, эта технология позволяет проводить манипуляции, невозможные с помощью других методов, таких как селективное ингибирование проекций с высокой временной точностью с использованием галородопсина6,8,9. Более того, специфическая для типа клеток экспрессия этих опсинов позволяет избирательно стимулировать или ингибировать изолированные компоненты в нейронной цепи1,2,11,15,21. Таким образом, эти новые оптогенетические инструменты позволяют проводить беспрецедентный анализ вклада нейронов в физиологию и поведение.

Здесь мы описываем протокол экспрессии каналродопсина в мозге мыши с использованием аденоассоциированных вирусных (AAV) векторов1,2. Специфическая трансфекция целевых популяций нейронов может быть выполнена с использованием этого протокола с соответствующим выбором промоторных конструкций или трансгенных мышей, экспрессирующих Cre-рекомбиназу в целевых нейронах, представляющих интерес, и «флоксированной» вирусной конструкции1,11,15,21 (рис. 1). В качестве примера здесь мы исследуем кортикокортикальные проекции между первичной зрительной корой (V1) и вторичной зрительной корой (V2), а также исследуем проекцию кортикоталамуса слоя 6 от первичной соматорной сенсорной коры (S1) к вентрозаднему медиальному ядру (VPm). Мы сочетаем эту специфическую экспрессию с лазерной сканирующей фотостимуляцией in vitro для оценки синаптической физиологии и функциональной топографии. Представленная здесь установка позволяет точно позиционировать себя и контролировать локусы фотостимуляции. Наконец, мы опишем визуализацию паттернов экспрессии с помощью конфокальной микроскопии.

Протокол

1. Хирургия и инъекции

  1. Обезболивайте мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции (рекомендуется игла 22-25 G) кетамина (100-120 мг/кг) и ксилазина (7,5-16 мг/кг).
    1. Оценивайте седативный эффект с помощью сильных щипков на пальцах ног до тех пор, пока не исчезнет ответ. Для всех описанных процедур на животных при необходимости измените в соответствии с местными рекомендациями IACUC.
  2. Поместите мышей под действием седативных препаратов в стереотаксическое устройство, закрепив голову и уши в соответствующих держателях.
    1. Смажьте глаза перед помещением животного в стереотаксический аппарат стерильной офтальмологической мазью.
  3. Выбрейте кожу головы бритвой и простерилизуйте область с помощью тампонов с бетадином.
  4. С помощью скальпеля разрежьте разрез по средней линии и отразите кожу и нижележащие мышцы над областью, в которую будет сделана инъекция.
  5. Вращайте лезвие скальпеля как трепан, чтобы выполнить трепанацию черепа над областью, которую нужно обнажить. В качестве альтернативы можно использовать небольшое сверло, прикрепленное к Dremel, для выполнения трепанации черепа.
    1. Чтобы выполнить трепанацию черепа, поместите лезвие скальпеля или сверло на поверхность черепа и медленно вращайте его, пока не будет извлечено достаточно кости, чтобы обнажить мягкую мозговую оболочку под ней.
    2. После того, как первоначальный объем будет выполнен, увеличьте краниотомию с помощью тонких щипцов, чтобы аккуратно удалить кость с краев.
  6. Наполните шприц объемом 1 мкл вводимым вирусным раствором (UNC Vector Core).
    1. Для повышения эффективности трансфекции приготовьте вирусный раствор с полибреном 4 мкг/мл.
  7. Опустите иглу в область введения и под давлением введите 200 мл раствора, содержащего вирус, с помощью шприцевого насоса.
    1. Дайте шприцу постоять 10 минут, прежде чем извлечь иглу.
  8. Зашить кожу нерассасывающейся мононитью нейлоном и покрыть разрез мазью с антибиотиком.
    1. Швы следует снять через 7-10 дней.
  9. Вводите бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) для послеоперационной анальгезии.
  10. Дайте животным восстановиться после операции в течение 14-21 дня, чтобы обеспечить адекватную экспрессию канала родопсина.

2. Приготовление ломтиков

  1. После восстановительного периода провести глубокую анестезию животного с помощью изофлурановой анестезии, что подтверждается отсутствием рефлекса отмены при сильном защемлении задней лапы и/или пальцев ног.
  2. Рассеките мозг путем обезглавливания с последующим разрезом по средней линии и лобной линии черепа.
  3. Отделите череп от средней линии, чтобы обнажить мозг.
  4. Осторожно удалите мозг с помощью мелкого совка-шпателя, чтобы отделить черепные нервы от основания мозга.
  5. Быстро поместите вскрытый мозг в маленькую 100 мл мензурку, содержащую охлажденную, ледяную искусственную спинномозговую жидкость (ACSF; в мМ: 125 NaCl, 3 KCl, 1,252PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 глюкозы).
  6. Извлеките мозг из ACSF и поместите на предметное стекло микроскопа, накрытое фильтровальной бумагой, предварительно смоченной ACSF.
  7. Сделайте блокирующий надрез мозга в нужной ориентации с помощью чистого лезвия бритвы.
  8. Приложите заблокированную поверхность мозга к режущему столу с помощью мгновенного клея с помощью мгновенного клея.
  9. Перенесите этап в вибратомную камеру для резки (храните в морозильной камере до готовности к резке).
  10. Залейте ледяной ACSF в камеру резки.
  11. Срезы мозга с температурой 400-500 мкм с помощью вибрационного тканевого слайсера.
  12. Перенесите срезы мозга в камеру хранения, содержащую насыщенный кислородом ACSF, и инкубируйте при 30 °C в течение не менее 1 часа перед экспериментом.

3. Физиологическая регистрация

  1. По истечении инкубационного периода перенесите срез в записывающую камеру на модифицированном предметном столике микроскопа.
  2. Закрепите ломтик в ванне во время эксперимента с помощью нескольких нитей нейлоновых нитей, прикрепленных к держателю для ломтиков из платиновой проволоки.
  3. Постоянно прокалывайте ломтик с помощью ACSF.
  4. Протягивайте записывающие пипетки до сопротивления наконечника 3-6 МОм при заполнении внутриклеточным раствором, содержащим (в мМ): 127 K-глюконат, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na 2-АТФ, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. Внутриклеточный раствор должен иметь pH 7,3, скорректированный с помощью KOH или глюконовой кислоты, и осмоляльность 280-290 мОсм.
  5. Используя стандартную визуализированную установку для записи всей клетки, поместите записывающую пипетку рядом с регистрируемым нейроном при приложении положительного давления22,23.
  6. Сбросьте положительное давление во время всасывания, чтобы сформировать гигаомное уплотнение.
  7. Примените кратковременное отсасывание, чтобы разорвать мембрану и сформировать запись конфигурации всей клетки.
  8. Запишите отклики нейронов в зажиме напряжения или тока.

4. Лазерная сканирующая фотостимуляция

  1. Запуск программного и аппаратного обеспечения для сбора данных, описанных в предыдущих отчетах23-29.
    Примечание: Мы использовали программы сбора данных Tidelwave25 и, совсем недавно, Ephus26, написанные в Matlab и разработанные лабораторией Карела Свбоды в Janelia Farms30. Полное описание лазерной сканирующей фотостимуляции в Ephus см. Suter et al.26 и пошаговое руководство30.
    Примечание: Схема, описанная в этой статье, является производной от схемы, описанной Shepherd (2012)23. Лазерный луч направляется через систему зеркал с открытым пучком к верхнему порту микроскопа через линзу объектива на срез (рис. 2).
  2. Отведите небольшую часть лазера на фотодиод с помощью покровного стекла микроскопа, помещенного в траекторию лазера, и используйте ток, выходящий из этого фотодиода, для контроля интенсивности лазера во время экспериментов.
    1. Калибровка записанного в программном обеспечении тока фотодиода на измеренную мощность лазера в задней фокальной плоскости объектива с помощью измерителя мощности во время настройки аппаратуры23.
  3. Управляйте мощностью лазера с помощью вращения колеса переменной нейтральной плотности. Мощность используемого лазера варьировалась от 25 до 70 мВт (в задней фокальной плоскости) в наших экспериментах.
  4. Установите длину и время лазерной стимуляции путем изменения параметров импульса для лазера и затвора. Продолжительность лазерной стимуляции обычно составляет 2 мс.
  5. Захват изображения области, которую нужно стимулировать, с помощью функции «Захват видео».
  6. Выберите сетку стимуляции в соответствии с желаемыми размерами. Обычно мы используем массив стимуляции 16 x 16 с расстоянием 80 мкм между соседними строками и столбцами.
  7. Наложите на картографическую сетку полученное изображение и отрегулируйте смещение по осям x, y и градусам в нужном месте и ориентации.
  8. Активируйте функцию «Карта», чтобы начать стимуляцию и сбор данных.
  9. После получения данных о вызванных реакциях фотостимуляции проведите анализ картографических данных с помощью автономной программы анализа карт в Tidelwave25 или программы «MapAnalysis» в Ephus26.

5. Фиксированная визуализация срезов

  1. После записи перенесите срез мозга в 4% параформальдегид (PFA) в дозе 0,01 M PBS (pH7,4) на ночь при температуре 4 ºC.
  2. Перенесите ломтик в 30% сахарозе в 4% PFA/0,01 M PBS на ночь при температуре 4 ºC.
  3. Разрежьте срезы 50 мкм с помощью криостата и соберите в 0,01 м PBS.
  4. Промыть секции в 0,01 М PBS дважды при комнатной температуре.
  5. Монтажные секции и покровное стекло должны быть изготовлены в соответствующей среде с защитой от выцветания.
  6. Перенесите срезы в конфокальный микроскоп.
  7. Сфокусируйтесь на ROI с помощью белого света.
  8. Выберите длину волны, размер изображения и частоту повторения для получения изображения. Для YFP мы используем 514 нм (Ex)/527 нм (Em).

Результаты

Лазерно-сканирующая фотостимуляция проекций между первичной зрительной областью (V1) и вторичной зрительной областью (V2) у мыши была осуществлена после инъекций pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP в область V1 мыши линии Balb/C (Рисунок 3). Промотор CaMKIIa в данной вирусной конструкции обеспечивает специфическую экспрессию ченнелродопсина-EYFP в возбуждающих глутаматергических нейронах1,15После подготовки срезов для физиологической регистрации экспрессия волокон ченнельродопсина-EYFP, т. е. эпифлуоресценция конъюгированного EYFP, перемещающаяся из V1 в V2 (Рисунок 3A). Кроме того, были также обнаружены кортикоталамические волокна в латеральном коленчатом теле (LGN) (Рисунок 3A). Регистрация методом пэч-клампа в конфигурации «целая клетка» (whole-cell) от нейрона в V2 выявила ВПСП, вызванные лазерно-сканирующей фотостимуляцией волокон, экспрессирующих каналородопсин-EYFP, в нижних слоях V2 (Рисунок 3B).

В другом примере с помощью данного протокола была осуществлена лазерно-сканируемая фотостимуляция кортикоталамусных проекций из 6-го слоя первичной соматосенсорной коры (S1) в вентропостериорное ядро (VP). В данном случае мы использовали подход Cre-Lox для специфического таргетирования экспрессии ченнелродопсина в нейронах 6-го слоя и интересующих нас кортикоталамусных проекциях. В частности, мы вводили pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA в S1 мышей B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (Рисунки 1 и 4). Эта трансгенная линия мышей экспрессирует Cre-рекомбиназу специфически в кортикоталамусных нейронах 6-го слоя21, и, следовательно, приводит к экспрессии ChR-YFP только в этих нейронах после трансфекции «флоксированным» конструктом AAV. После подготовки срезов волокна ченнелродопсин-EYFP наблюдались в нейронах 6-го слоя и волокнах, проецирующихся в 4-й слой и VP (Рисунки 4A и 4B). Физиологическая запись с нейрона VPm с использованием метода patch-clamp при фиксации всего объема клетки показала, что EPSC могут быть индуцированы после лазерно-сканируемой фотостимуляции рядом с регистрируемым нейроном (Рисунки 4C и 4D).

Морфологию меченых волокон было проще оценить после проведения физиологических записей. Здесь мы повторно разрезали (50 μm) препараты срезов с экспрессией channelrhodopsin-EYFP в кортикоталамических нейронах слоя 6 (Рисунок 5). Это выявило четкую структуру меченых волокон, идущих из слоя 6 в слой 4, где они заканчивались и разветвлялись (Рисунок 5A). Кроме того, наблюдались кортикоталамические волокна, входящие в белое вещество и направляющиеся к таламусу (Рисунки 5A и 5B).

Схема редактирования генов с использованием системы Cre-loxP для таргетной экспрессии ChR-YFP в модели мыши.
Рисунок 1. Схематическое изображение таргетной экспрессии ченнелродопсина с помощью подхода Cre-Lox.Трансгенным мышам, экспрессирующим Cre-рекомбиназу в интересующих популяциях нейронов, вводят «флоксированный» вирус, кодирующий ченнелродопсин, слитый с флуоресцентным белком, таким как YFP. После трансфекции только нейроны, содержащие Cre-рекомбиназу, будут экспрессировать channelrhodopsin-EYFP. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Схема лазерной микроскопии с лазерной оптикой, дихроичным зеркалом, ПЗС-камерой и системой сканирования.
Рисунок 2. Схематическое изображение установки для фотостимуляции. (A) Диаграмма установки для лазерного сканирующего фотостимулирования. Лазерный луч последовательно проходит через систему открытого луча к затвору и фильтру нейтральной плотности (N.D.). Покрывное стекло отражает часть луча на фотодиод, подключенный к усилителю для измерения мощности лазера. Зеркальные гальванометры используются для позиционирования лазерного луча через сканирующую линзу, которая направляет луч через боковой порт в верхней части микроскопа. Затем луч отражается вниз через объектив на препарат среза с помощью дихроичного зеркала. Дополнительную информацию см. в работах Lam and Sherman23 и Shepherd29. (B) Пример сетки фотостимуляции для репрезентативного эксперимента, показанного на рисунке 3. Сетка стимуляции 16 x 16 наложена на микрофотографию препарата среза. Красная звезда указывает на расположение нейрона, запись с которого проводилась методом patch-clamp в конфигурации «целый отдел» (whole-cell). Положение лазерного луча направляется в каждую из 256 позиций сетки стимуляции с помощью компьютеризированного позиционирования зеркальных гальванометров. На рисунке показаны позиции лазера для первых 5 участков стимуляции. Ответы зарегистрированного нейрона на фотостимуляцию в каждой из точек показаны на рисунке 3. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенное изображение.

Схема нейровизуализационной карты; анализ LGN, V1, V2 зрительной коры; исследование нейронных связей.
Рисунок 3. Лазерно-сканирующая фотостимуляция кортико-кортикальных проекций из первичной зрительной коры (V1) во вторичную зрительную кору (V2) у мыши. (A) Эпифлуоресцентное изображение среза, демонстрирующее волокна channelrhodopsin-EYFP, идущие от V1 к V2 и находящиеся в латеральном коленчатом ядре (LGN). Специфическая экспрессия channelrhodopsin-EYFP в возбуждающих глутаматергических нейронах обеспечивается вирусным конструктом, содержащим промотор CaMKIIa. (B) Возбуждающие постсинаптические токи (EPSCs), вызванные в нейроне V2 после лазерно-сканирующей фотостимуляции. Красная звездочка указывает место регистрации. Масштабные отрезки: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Схема слоев коры с анализом области VP; картирование микроэлектрической активности; электрофизиологические данные.
Рисунок 4. Лазерно-сканирующая фотостимуляция кортикоталамулярных проекций из первичной соматосенсорной коры (S1) в вентропостериорное ядро (VP) мыши. (A) Эпифлуоресцентное изображение препарата среза, демонстрирующее волокна channelrhodopsin-EYFP в S1. (B) Эпифлуоресцентное изображение меченых волокон в VP. (C) Возбуждающие постсинаптические токи (EPSCs), вызванные в нейроне VP после лазерно-сканирующей фотостимуляции. (D) График средних значений EPSCs. Красная звезда указывает место регистрации. Обведенные кривые на панели (C) соответствуют обведенным значениям на панели (D). Масштабные отрезки: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Флуоресцентная микроскопия, демонстрирующая нейронные структуры, помеченные зелеными маркерами; сравнительная схема.
Рисунок 5. Визуализация нейронов 6-го слоя, экспрессирующих channelrhodopsin-EYFP, в первичной соматосенсорной коре (S1) мыши. (A-B) Помеченные нейроны 6-го слоя и волокна, проецирующиеся в 4-й слой и белое вещество. Масштабные отрезки: (A) 250 µm, (B) 250 µm. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Обсуждение

В описанном протоколе подробно описан подход к оценке in vitro функциональной топографии и физиологии нейронных цепей, который не ограничивается исследованием цепей переднего мозга, т.е. таламуса и коры головного мозга. Несколько вирусных конструкций для оптогенетической трансфекции были доступны научному сообществу и легко доступны в UNC Vector Core. Описание легко доступных вирусных конструкций см. в UNC Vector Core31, на странице ресурсов по оптогенетике в Лаборатории Дейссерота в Стэнфордском университете32 и в лаборатории синтетической нейробиологии Бойдена в Массачусетском технологическом институте33. Варианты этих опсинов были разработаны в этих лабораториях и позволяют использовать широкий спектр режимов для управления возбудимостью нейронов1,2. Для получения этих векторов из UNC Vector Core требуется соглашение о передаче материала от исходных лабораторий. В этом протоколе мы отмечаем, что добавление полибрена повышает эффективность трансфекции. Кроме того, еще одной переменной, влияющей на экспрессию, является послеоперационный восстановительный период, при котором, как мы отмечаем, период не менее 14 дней достаточен для получения устойчивой экспрессии в путях переднего мозга мышей.

Для таргетной трансфекции специфических групп нейронов было разработано несколько Cre-трансгенных линий мышей, которые могут быть использованы в сочетаниис разработанными вирусными конструкциями с «флоксированными» перевернутыми открытыми рамками считывания. Несколько штаммов, имеющих отношение к исследованиям в области нейробиологии, доступны через Региональные ресурсные центры по мутантным мышам34. Атласы паттернов экспрессии Cre-рекомбиназы в этих трансгенных линиях предлагаются в базе данных GENSAT35. Кроме того, Jackson Labs предлагает несколько Cre-трансгенных штаммов, а также другие, которые конститутивно экспрессируют опсины в определенных нейронных группах. Важным шагом в использовании этих линий мышей является учет времени, необходимого для получения и создания гнездовой колонии, которое может варьироваться в зависимости от конкретного штамма, представляющего интерес.

Для фотостимуляции мы использовали и адаптировали установку, разработанную лабораторией Шеперда в Северо-Западном университете, описанную в недавнем протоколе29. Несмотря на то, что эта установка оптимизирована для снятия глутамата, она также подходит для фотостимуляции каналродопсина без модификации. Такая установка обеспечивает точный пространственный контроль и позиционирование локусов фотостимуляции, что позволяет оценить функциональную топографию иннервации записанных нейронов с помощью родопсина. Несмотря на то, что пространственный контроль улучшается с помощью этого метода фотостимуляции, он является более дорогостоящим, чем методы, использующие светодиодное освещение поля20. Кроме того, неоднородность мозговой ткани является ограничением оптогенетики или любых методов, связанных с манипулированием светом. На практике, однако, это редко является фактором, поскольку результаты интерпретируются в основном качественным образом. В случае, если требуется более количественное сравнение между областями мозга, всегда можно использовать максимальную интенсивность света для достижения «насыщенных» реакций.

Кроме того, мы использовали программы Tidelwave и Ephus, написанные в Matlab, для управления лазерной сканирующей фотостимуляцией и сбора данных25,26. Тем не менее, тем, кто настраивает аналогичную систему, рекомендуется использовать более новое программное обеспечениеEphus 26, поддержку которого можно получить на сайтеразработки Janelia Farms 30. Ключевым шагом является выбор того, какой из этих программных пакетов использовать, поскольку их требования к оборудованию немного отличаются. Кроме того, программы анализа карт адаптированы к соответствующим программам сбора данных.

Некоторые из этих шагов могут быть изменены в соответствии с конкретной установкой практикующего врача. Инъекции вирусных растворов могут выполняться не только со шприца, но и с помощью механизмов доставки, например , хорошо работают и капиллярные стеклянные пипетки, подтянутые к кончикам диаметром ~40 мкм. При операциях может быть заменен нестереотаксический держатель головки, если такие координаты не требуются для направления инъекций. Кроме того, композиции ACSF и внутриклеточные растворы могут быть изменены в зависимости от конкретных экспериментальных требований, например , путем замены цезия или внутриклеточного раствора с высоким содержанием хлорида для изоляции тормозящих токов. Кроме того, альтернатива визуализации паттернов экспрессии в фиксированных срезах может быть также выполнена в живом срезе на подходящей установке для визуализации с системой перфузии в ванне.

Таким образом, этот протокол позволит практикующему врачу охарактеризовать функциональную топографию и синаптическую физиологию проекций in vitro, что может быть невозможно при использовании стандартных методов, например: Определение характеристик дальних проекций, которые не могут быть сохранены в срезе. Описанный протокол трансфекции может быть применен к оптогенетическим экспериментам in vivo 1-3,12,14, поскольку механизм доставки тот же. Наконец, хотя этот протокол описывает трансфекцию мышей, многие из доступных вирусных векторов могут быть использованы для теоретической трансфекции и экспрессии этих опсинов у широкого спектра видов млекопитающих, что позволяет провести множество сравнительных и видоспецифичных исследований1-3.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Автор (CCL) получил грант на публикацию от компании Leica Microsystems, которая производит инструмент, используемый в этой съемке этого протокола.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NIH/NIDCD R03 DC 011361, грантом SVM CORP LAV3202, грантом NSF-LA EPSCoR PFUND86, а также грантом на публикацию от Leica Microsystems (CCL) и грантом NIH/NIDCD R01 DC 008794 (SMS).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПолибренSanta Cruz BiotechSC134220
Параформальдегид 32% растворEMS15714
VECTASHIELDVector LabsH-1400
AAV вирусные конструкцииUNC Vector CoreNA
Мышь стереотаксический держатель головыStoelting51730
Nanocool injectorHarvard Аппарат703040
УФ-лазер: 355 нм, Nd:YVO4; 1 Вт;DPSS Lasers, Inc3500
ГальвонометрыCambridge Scanning6210
зеркалаCambridge Scanning6m2003S-A
креплениеCambridge Scanning6102103L
кабельCambridge Scanning6010-19-120
водитель/контроллерCambridge Scanning67121-1
Затвор - с покрытием ZM (совместимый с ультрафиолетовым излучением)UniblitzL23-ZM2
Контроллер затвораUniblitzVMM-D1
Усилитель токаStanford Research SystemsSR570
6713 платаNational Instruments777741-01
2110 коммутационная коробкаNational Instruments777643-01
PCI-MIO-16E-4National Instruments777383-01
BNC-2090National Instruments777270-01
КабелиNational Instruments184749-01
MATLABMathworks
TCS SP2Leica Microsystems

Ссылки

  1. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).
  2. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).
  3. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Zemelman, B. V., Lee, G. A., Ng, M., Miesenbock, G. Selective photostimulation of genetically ChARGed neurons. Neuron. 33, 15-22 (2001).
  6. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36, 129-139 (2008).
  7. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  8. Lanyi, J. K. Halorhodopsin: A light-driven chloride ion pump. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 11-28 (1986).
  9. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2, (2007).
  10. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).
  11. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  12. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  13. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit. Science. 324, 354-359 (2009).
  14. Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. Gain control by layer six in cortical circuits of vision. Nature. 483, 47-52 (2012).
  15. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  16. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65, 230-245 (2010).
  18. Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. Intracortical convergence of layer 6 neurons. Neuroreport. 23, 736-740 (2012).
  19. Mancuso, J. J., et al. Optogenetic probing of functional brain circuitry. Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).
  20. Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons. J. Vis. Exp. (57), (2011).
  21. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).
  22. Cox, C. L., Sherman, S. M. Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus. Neuron. 27, 597-610 (2000).
  23. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat. J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).
  24. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus. Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).
  25. Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
  26. Suter, B. A., et al. Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments. Front Neural Circuits. 4, (2010).
  27. Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).
  28. Lee, C. C., Sherman, S. M. Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission. Hear Res. , 287-2843 (2012).
  29. Shepherd, G. M. Circuit mapping by ultraviolet uncaging of glutamate. , Cold Spring. 998-1004 (2012).
  30. ScanImage, Ephus, and other DAQ software [Internet]. , Janelia Farms. Ashburn (VA). Available from: http://www.ephus.org (2003).
  31. UNC Gene Therapy Center [Internet]. , University of North Carolina. Chapel Hill (NC). Available from: http://genetherapy.unc.edu/services.htm (2003).
  32. Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics (2003).
  33. Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: http://syntheticneurobiology.org (2003).
  34. Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.mmrrc.org (2003).
  35. GENSAT Brain Atlas [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.gensat.org/cre.jsp (2003).

Перепечатки и разрешения

Теги

patch clampCre lox
Лазерная сканирующая фотостимуляция оптогенетически нацеленных контуров переднего мозга
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.