Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание вызванной хирургически, модели у мышей по расследованию защитную роль Progranulin в остеоартрита

28.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50924

⸱

25 февраля 2014 г.

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, NYU Hospital for Joint Diseases, 2Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем протокол для дестабилизации медиального мениска (DMM) модели у мышей, эффективный инструмент для остеоартрит (ОА) исследований. Кроме того, мы продемонстрировали, что дефицит progranulincan развития преувеличивать О.А. и прогрессирования, используя данную модель, указывая, что progranulin играет защитную роль в патогенезе ОА.

Аннотация

Дестабилизация медиального мениска (DMM) модель является важным инструментом для изучения патофизиологических роли многочисленных артрита, связанных молекул в патогенезе остеоартрита (ОА) в естественных условиях. Тем не менее, подробный, особенно визуализируются протокол для установления этой сложной модели у мышей, не доступен. Здесь мы воспользовались дикого типа и progranulin (PGRN) - / - мыши в качестве примеров по внедрению протокола для индукции DMM модель на мышах, и по сравнению начало ОА следующий создания этого хирургически индуцированной модели. Проведенные на мышах операции были либо обман операция, которая только что открыл суставной капсулы, или операцию DMM, который разрезать menisco-большеберцовой связки и вызвало дестабилизацию медиального мениска. Тяжесть Артроз оценивали с помощью гистологического анализа (например, окрашивания Сафранин О), выражения ОА-связанных генов, деградация хряща молекул внеклеточного матрикса, и остеофит формыAtion. Операция DMM успешно индуцированных О.А. инициации и прогрессировании и в дикого типа и PGRN-/ - мышей, и потери фактора роста PGNR привело к более тяжелым ОА фенотипа в этом хирургически индуцированной модели.

Введение

Остеоартрит (ОА), также известный как дегенеративный артрит, влияет 15% населения земного шара и более 46 миллионов человек в Соединенных Штатах, и характеризуется синовита, дегенерации хряща, и формирование остеофитов 1. Это может быть результатом сложного взаимодействия генетических, метаболических, биомеханических и биохимических факторов. Основные механизмы ОА продолжают уклоняться научное сообщество. Есть в настоящее время многочисленные животные модели, которые могут имитировать патогенеза ОА 2,3. Важно установить животные модели у мышей как из-за наличия различных генетически модифицированных мышей и экономической эффективности экспериментов. Среди различных видов экспериментальных моделях О.А., хирургически индуцированной дестабилизация медиального мениска (DMM) модели является хорошо принят О.А. модель из-за его хорошей воспроизводимости и относительно медленным прогрессированием во время развития ОА. Оба этих атрибутов естьбыл ключевым для оценки прогрессирования ОА в различных обработок или трансгенов 3-8. Тем не менее, последовательность хирургического модели ОА зависит от различных факторов, во время операции и в результате, применение хирургического мышиной модели ограничена.

Progranulin (PGRN) является многофункциональным фактор роста выражается в различных клетках. Известно, что PGRN играет важную роль в различных физиологических и болезненных процессов, таких как заживление ран 9, 10, опухолей и воспалений 11-15. Исследования также показали, что недостаточность PGRN может вызвать дегенеративные заболевания нервной системы у человека и мышей 16-18. Известно, что PGRN выражается в человеческой суставного хряща, и его уровень значительно выше у хряща пациентов с ОА и ревматоидный артрит 19. Кроме того, PGRN также играет важную роль в пролиферации хондроцитов 20, дифференциации и Эндохондральныйокостенение роста пластины в процессе разработки 21,22. Недавно мы сообщали, что PGRN против себя TNF-α посредством связывания с рецепторами TNF и выставлены противовоспалительное функцию в воспалительных моделей артрита 13,14,23,24. Тем не менее, роль PGRN при ОА, особенно в естественных условиях, остается загадкой. Здесь мы представляем процедуру, чтобы вызвать хирургическую модель DMM, и исследовать роль PGRN в развитии ОА путем создания DMM модель в WT и PGRN-/ - мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все хирургических процедур, связанных с животными должно быть одобрено по уходу за животными и Этического комитета местного Учреждения, с усилием, чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт, вызванный хирургии.

1. Подготовка

  1. Выбор 8-12 недель самцов C57BL / 6 мышей с массой тела примерно 25 г в течение операции.
  2. Обезболить животных через внутрибрюшинной инъекции коктейля, содержащего как ксилазина (5 мг / кг) и кетамин (40 мг / кг).
  3. Бритье колено с бритвами, то хирургически драпировать животное и стерилизовать хирургические сайт бетадином и алкоголя (3х) и закрывала глаза мыши мазью.

2. Хирургическое Процесс

  1. Сделать 1 см продольный медиальной пара-надколенника разрез выставить коленного сустава.
  2. Откройте коленного сустава мягко через боковой вывих коленной чашечки и связки коленной чашечки.
    1. Разрежьте коленного сустава капсула продольночерез медиальной пара-надколенника разрез в шаге 2.1.
    2. Проанализируйте коленного сустава капсулу щипцами.
    3. Захватите дистальной части задней лапы с левой стороны, а также выполнять боковую вывих коленной чашечки и связки коленной чашечки щипцами. Держите заднюю лапу мягко и убедитесь, чтобы избежать травмы в лапы. Чем лучше суставная капсула рассечена, тем меньше сила будет обязан сделать дислокацию.
  3. Капельное стерильный физиологический раствор на поверхности суставного хряща в процессе работы, чтобы избежать высыхание поверхности хряща.
  4. Разрезать медиальной meniscotibial связка, которая прикрепляет медиального мениска на плато большеберцовой кости. Избегайте ранив хрящ по дну медиального мениска.
    1. Определить медиального мениска, который находится между медиального мыщелка бедренной кости и медиальной плато большеберцовой кости.
    2. Определить meniscotibial связки, которая соединяет боковой стороны медиального мениска с межмыщелковой возвышения большеберцовой кости.
    3. Держите приветй лапать осторожно стороны, и прорезать медиальной meniscotibial связки тщательно, используя номер 10 хирургического лезвия. Убедитесь в том, чтобы не вызвать ранение в суставном хряще и других связок. Во многих случаях, охватывающих жировой ткани должна быть потянул в сторону, но не должен быть удален с целью выявления связки.
  5. Закройте коленного сустава капсула с 6-0 рассасывающиеся нити.
  6. Закройте кожу 6-0 шелковой нити.

3. Послеоперационный уход

  1. Применить одну каплю 0,25% бупивакаина в хирургическом месте каждой мыши, чтобы минимизировать послеоперационные боли.
  2. Оставьте действовали мышей бесплатно, чтобы получить воду и еду.

4. Гистологическое Заброшенные хирургической DMM модели

  1. Жертвоприношение мышей в указанные моменты времени (например, 4 недели, 8 недель и 12 недель. Здесь мы показали результаты 8 недель в качестве представителя) после операции.
  2. Весь коленные суставы фиксированы, Декальцинированное, embedded парафином, а затем разрезали серийно на 5 интервале мкм.
    1. Разрежьте целые задние конечности с п. 10 лопастей.
    2. Проанализируйте кожу и мышцы задних конечностей тщательно, и исправить образцы с 4% PFA в течение 3 дней в РТ.
    3. Снимите PFA, и очистите образцы с водой. После этого образцы декальцинировать в ЭДТА при 4 ° С в течение 2 недель.
    4. Обезвоживают образцов в этаноле градиента. Более подробно, сохранить образцы в 70% этаноле в течение 1 часа, а затем изменить этанола и сохранить образцы в новый набор из 70% этанола в O / N. После этого положить образцов в 80% и 90% этанола, следовательно, и держать их в течение 1 часа, соответственно, с последующим 100% этанола для O / N.
    5. Снимите этанол. Держите образцов в oxylene в течение 1 часа, и перейти к новому набору oxylene. Повторите этот шаг 3 раза.
    6. Вставить образцов в парафиновой плесени с помощью вложение центр Leica. После этого образцы разрезали на 5 мкм с использованием роторного микротома (Leica RM2255, Germany) и затем собирали на предметных стеклах.
    7. Последовательные сагиттальных срезов разрезают для каждого образца, охватывающей область от центра латеральный до центра медиального мыщелка.
  3. Окрашивание Сафранин О выполняется, а затем забил и статистического анализа через OARSI балльной системе, как описано выше 25.
    1. Во-первых, deparaffinize слайды в oxylene, и увлажняют их в этанол градиентом до дистиллированной воды. После этого препараты окрашивали через железный гематоксилин решения Weigert в, 0,05% Быстрый зеленый (FCF) раствор, 1% раствором уксусной кислоты Solution, и 0,1% сафранином O Solution. Установите слайды с помощью смолистый среду.
    2. Оценка на Сафранин вывода окрашенных слайды на основе потери протеогликана (красный цвет) в хряще и процент разрушения в структуре хряща, сделать статистический анализ для гистологического счет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

DMM модель была успешно создана в мышей, и дефицит PGRN преувеличены, вызванной хирургически, развитие ОА.

Шам и DMM операции (рис. 1) были выполнены в WT и PGRN-/ - мышей. 8 недель после операции, мышей умерщвляли и окрашивание сафранин О проводили на секциях из коленных суставов, а затем с помощью статистического анализа нот артрита на основе гистологии. Как показано на рисунке 2А, не было никакой очевидной дегенерация хряща в обоих геноти...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Он сообщил, что штамм мышей очень важно для DMM модели индукции, так как различные штаммы мышей различной степени тяжести ОА после DMM, с самого высокого уровня в штамме 129/SvEv, а затем C57BL6, 129/SvInJ а затем FVB / н 26. Большая часть трансгенов установлены в C57BL6 мышей, таких как PGRN-/ - мышей, которые мы использовали в настоящем исследовании, которые являются относительно чувствительными к DMM. Однако, если трансген на основе нечувствительным штамма, такого как FVB / N мышей, необходимо обратное скр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Здесь Мы заявляем, что у нас нет никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана NIH исследовательских грантов R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, и заболеваний целевых исследований Грант от ревматологии Research Foundation (к CJ Лю).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
No 10 Хирургические лезвияFeather25-2976#10
6-0 шовный материалApplied DentalWG-N53133

Ссылки

  1. Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
  2. Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
  3. Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
  4. Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
  5. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
  6. Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
  7. Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
  8. Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
  9. He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
  10. Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
  11. Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
  12. Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
  13. Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
  14. Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
  15. Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
  16. Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
  17. Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
  18. Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
  19. Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
  20. Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
  21. Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
  22. Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
  23. Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
  24. Wu, H., Siegel, R. M. Progranulin Resolves Inflammation. Science. 332, 427-428 (2011).
  25. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
  26. Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
  27. Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
  28. Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
  29. Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DMMMANKIN
Создание вызванной хирургически, модели у мышей по расследованию защитную роль Progranulin в остеоартрита
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.