Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

На месте TEM биологических ассамблей в жидкости

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50936

⸱

30 декабря 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Здесь мы описываем процедуру изображения вирусных комплексов в жидкости при разрешении нанометров с помощью электронного микроскопа передачи.

Аннотация

Исследователи регулярно используют радиоэлектронные микроскопы (ТЭМ) для изучения биологических сущностей и оценки новых материалов. Здесь мы описываем дополнительное приложение для этих инструментов - просмотр вирусных сборок в жидкой среде. Этот захватывающий и новый метод визуализации биологических структур использует недавно разработанный микрофлюидный держатель образца. Наша видео статья демонстрирует, как собрать и использовать микрофлюидный держатель для изображения жидких образцов в TEM. В частности, в качестве нашей модельной системы мы используем симианские ротавирусные двухслойные частицы (DLPs). Мы также описываем шаги, чтобы покрыть поверхность жидкой камеры с сродством биопленок, которые привязывают DLPs к окну просмотра. Это позволяет нам изображения сборки таким образом, что подходит для определения 3D-структуры. Таким образом, мы представляем первый взгляд на подвирусные частицы в родной жидкой среде.

Введение

Общей целью биологов и инженеров является понимание внутренней работы молекулярных машин. Передача Электронные микроскопы (ТЭМ) являются идеальными инструментами для визуализации этих сложных деталей при почти атомномразрешении 1-2. Для того, чтобы поддерживать высокую вакуумную систему TEM, биологические образцы, как правило, встроенные в тонкие пленки стекловидногольда 3,сахара 4, солитяжелых металлов 5, или некоторые комбинациииз них 6. В результате изображения встроенных образцов могут выявить лишь ограниченные снимки динамических процессов.

Ранние попытки сохранить биологические образцы гидратированных в экологических жидких камерах были предприняты Парсонс и его коллеги с использованием дифференциальных этапов перекачки. Электронные дифракционные узоры неоближенных кристаллов каталазы были успешно записаны с разрешением 3 евро в гидратированномсостоянии 7-8. Кроме того, фазополученные липидные области могут быть исследованы в гидратированных мембранахэритроцитов человека 9-10. Однако движение, вызванное распространением жидкости и ее вмешательством в электронный луч, привело к серьезной потере разрешения, и дальнейшие эксперименты с использованием биологических образцов не были предприняты до недавнего времени.

Недавно были введены недавно разработанные держатели микрофлюидных образцов, которые используют полупроводниковые микрочипы для формирования микро-масштабной экологической камеры. Эти устройства могут поддерживать образцы в жидкости, пока они расположены в столбцеTEM 11-12. Этот технический прорыв в визуализации TEM позволил исследователям впервые просмотреть прогрессивные события на молекулярном уровне13. Мы называем эту новую модальность«молекулярной микроскопией на месте», так как эксперименты теперь могут проводиться «внутри» столбца14-15. Общая цель этого метода заключается в изображении биологических сборок в жидкости для того, чтобы наблюдать их динамическое поведение при разрешении нанометра. Смысл разработанной методики заключается в том, чтобы записывать наблюдения в режиме реального времени и изучать новые свойства биологического механизма в растворе. Эта методология расширяет использование ТЭМ для более широких целей в клеточной и молекулярнойбиологии 12-16.

В текущей видео-статье мы представляем всеобъемлющий протокол для сборки и использования коммерчески доступного держателя микрофлюидных образцов. Эти специализированные держатели используют микрочипы кремния нитрида, произведенные с интегрированными проме сторонами, чтобы сформировать жидкую камеру, которая заключает мельчайшие объемы раствора. Тонкие прозрачные окна выгравированы в микрочипах для целей визуализации12. Мы демонстрируем правильное использование микрофлюидного держателя для изучения симиановых ротавирусных двухслойных частиц (DLPs) в жидкости с помощью TEM. Для обеспечения того, чтобы биологические сборки, такие как DLPs, не быстро рассеиваются на большие расстояния во время визуализации, мы используем подход Affinity Capture, чтобы привязать их к поверхности микрофлюиднойкамеры 16. Этот молекулярный шаг захвата имеет большое преимущество перед альтернативными методами для визуализации биологических образцов в жидкости, поскольку он позволяет приобретение изображений, которые будут использоваться для обработки вниз по течению процедур. Этот шаг захвата, используемый в сочетании с микрофлюидной визуализацией, уникален для нашихпроцедур 17. Читатели, использующие структурные биологические приложения с использованием TEM или микрофлюидных камер визуализации, могут рассмотреть вопрос об использовании методов сродства захвата, когда динамические наблюдения на молекулярном уровне являются конечной целью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Affinity Захват устройства16

  1. Очистите кремниевые нитридные E-чипы, инкубируя их в 15 мл ацетона в течение 2 мин, а затем 15 мл метанола в течение 2 мин (Рисунок 1A). Разрешить чипы высохнуть под ламинарным потоком воздуха.
  2. Инкубировать сушеные чипсы на нагретой тарелке перемешать (без перемешивания) в течение 1,5 часа при температуре 150 градусов по Цельсию, а затем дать им остыть до комнатной температуры перед использованием.
  3. Используйте шприцы Гамильтона для составления липидных смесей в маленьких стеклянных трубках, чтобы содержать 25% хлороформа, 55% DLPC (1,2-дилауроил-фосфохолин) в хлороформе (1 мг/мл) и 20% липид ni-NTA (1,2-диолеоил-иминодиадиатический кислотно-сукцинил-никелевая соль) в хлороформе (1 мг/мл) при общем объеме 40 л.
  4. Нанесите 1 зл алицит смеси на каждую каплю воды Милли-З на кусок Парафильма во влажной чашке Петри(рисунок 1B). Инкубация образцов на льду не менее 60 мин.

2. Захват макромолекул17

  1. Поместите E-чип с интегрированным спейсером 150 нм поверх образца монослой и инкубировать в течение 1 мин(рисунок 1С).
  2. Аккуратно свяжите чип с образца и добавьте 3 йл алицита его помеченного белка A. Incubate в течение 1 мин при комнатной температуре(рисунок 1D).
  3. Пятно от избыточного падения с помощью Whatman #1 фильтровальной бумаги и сразу же добавить 3 йл aliquot раствора антител. Инкубация в течение 1 мин при комнатной температуре.
  4. Удалите избыток раствора с помощью шприца Гамильтона и немедленно добавьте 1 йл алицит ротавирусных DLPs (0,1 мг/мл) в буферный раствор, содержащий 50 мМ HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 и 10 mM CaCl2. Инкубация в течение не менее 2 минут при комнатной температуре. Подготовка DLPs была описана ранее18.

3. Соберите микрофлюидную камеру и загрузите держателя образца in situ

  1. Загрузите мокрый E-чип, содержащий вирусный образец, в кончик держателя микрофлюидного образца. Свечение разряда второй плоский E-чип в течение 1 мин, а затем загружены на верхней части чипаспейсера (рисунок 2, панели 1-5).
  2. Кроме того, для увеличения контрастности биологических макромолекул, тяжелых металлических пятен (например,0,2% уранал-мэта) можно добавить к влажным образцам до размещения второго E-чипа на мокром образце. Тем не менее, E-чип, содержащий образец, должен быть промыт водой Милли-З до добавления контрастного реагента.
  3. Сэндвич всю сборку вместе, чтобы сформировать запечатанный корпус, удерживаемый на месте механически в держатель на 3 латунныхвинта (рисунок 2, панели 6-8).
  4. После сборки кончик держателя перекачивается до 10-6 Torr с помощью турбо-накачиваемой сухой насосной станции перед размещением держателя внутри TEM.

4. Изображение в жидкости с помощью электронного микроскопа передачи

  1. Загрузите держатель образца in situ в электронный микроскоп передачи (компания FEI), оснащенный нитью LaB6 и работающий на 120 кВ.
  2. Включите нить TEM и отрегулируйте эвцентрическую высоту стадии микроскопа по отношению к образцу, используя функцию воблера, чтобы наклонить образец от -15 до 15 градусов взад и вперед в столбце. Эта процедура регулирует этап в z-направлении, чтобы помочь объяснить правильную толщину жидкой камеры. Этот шаг также обеспечивает точное увеличение используется при записи изображений.
  3. Запись изображений по краям и в угловых областях микрофлюидной камеры в первую очередь. Эти области обычно содержат тончайшее решение. Запись изображений образцов в условиях низких доз (1-3 электрона /No 2) с помощью камеры CCD. Используйте номинальные увеличения 6000X - 30,000X.
  4. Определите правильное значение дефокуса, сосредоточив внимание на краю жидкой камеры. Используйте значение -1,5 мкм для записи изображений при увеличении на 30 000X. Если при подготовке образца не используется толстый раствор или если контрастный агент не используется, используйте более высокие значения дефокуса в диапазоне от -2 до -4 мкм.
  5. Чтобы обеспечить раствор, содержащийся в микрофлюидной камере на протяжении всех экспериментов, сосредоточьте электронный луч до тех пор, пока пузырьки не образуются в жидкости внутри устройства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Репрезентативные изображения DLPs в жидкости с использованием E-чипов, которые были светятся разрядки (Рисунок 3A) показывают меньше DLPs в данной области просмотра, предположительно из-за диффузии, по сравнению с DLPs, которые обогащены на устройствах Affinity Capture (Рисунок 3B). Добавление уранила-formate в камеру визуализации повышает контрастность образца и, следовательно, видимость отдельных DLPs в растворе(рисунок 3C, верхняя панель). Лучший контраст позволяет вн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В нашей представленной работе мы использовали подход к захвату сродства, чтобы привязать ротавирусные DLPs к микрофлюидной платформе. Это позволило на месте изъястить макромолекулярные комплексы в жидкой микрооквидеоронии. Подход к захвату имеет важное значение по отношению к другим методам микрофлюидной визуализации, поскольку он локализует биологические образцы в окне изображения, чтобы свести на нет большие диффузные проблемы, возникающие при записи изображений в жидкости. Однако одним из ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор, Мадлен J. Герцоги, является сотрудником Protochips, Inc.

Благодарности

Авторы признают д-р Майкл J. Фридландер, директор Вирджинии Tech Carilion научно-исследовательский институт для поощрения наших научных усилий. Этот проект был поддержан фондами развития S.M.M и D.F.K., а также частично инициативой Nano-Bio Института критических технологий и прикладных наук в Virginia Tech.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Электронные чипы, спейсерные чипыProtochips, Inc.EPB-52TBD400 μ м х 50 &; m окно
E-chip, топовый чипProtochips, Inc.EPT-45W400 μ м х 50 &; m окно
Ni-NTA липидAvanti Polar Lipids790404PПорошковая форма
DLPC (12:0) липидAvanti Polar Lipids850335PПорошковая форма
Мерные колбы Fisher Scientific20-812A; 20-812C1 мл; 5 мл
Гамильтон ШприцыГамильтон Ко.80300, 804001-10 μ l; 1-25 μ l
Ватман #1 фильтровальная бумагаВатман1001 090100 штук, 90 мм
Стеклянные чашкиПетри Corning70165-101100 мм x 15 мм
Стеклянные пипетки ПастераVWR14673-01014673-010
Стеклянные пробирки для культурыVWR47729-5666 мм x 50 мм
АцетонFisher ScientificA11-11 л
МетанолFisher ScientificA412-11 л
хлороформа Электронная микрокопия12550100 мл 
Его тег Protein AAbcam, Inc.ab5295310 мг
Milli-Q водная системаEMD Millipore Corp.Z00QSV001Сверхчистая вода
HEPESFisher ScientificBP310-500500 г
Оборудование 
Poseidon In situ держатель образцовProtochips, Inc.  FEI совместимый FEI
Spirit BioTwin TEMFEI Co.120 кВ
Eagle 2k HS CCD камераFEI Co.10  Å/пиксельный отбор проб на 30 000X
Gatan 655 Dry pump stationGatan, Inc.Наконечник держателя насоса на 10-6  range
PELCO easiGlow, тлеющий разрядникTed Pella, Inc.  Режим отрицательной полярности
Isotemp с подогревом мешалкиFisher ScientificHeat до 150 °Ордм; C за 1,5 ч

Ссылки

  1. Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
  2. Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
  3. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
  4. Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
  5. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
  6. Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
  7. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
  8. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
  9. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
  10. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
  11. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  12. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
  13. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  14. Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
  15. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
  16. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
  17. Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
  18. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
  19. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
  20. Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
  21. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
  22. Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid
Posted by JoVE Editors on 10/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/50936

Теги

Жидкая средамикрофлюидный держательаффинный захватДЛЧ ротавирусаПЭМ-визуализациявизуализация вирусовтрекинг наночастицэлектронная микроскопия
На месте TEM биологических ассамблей в жидкости
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.