Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Исследование рецептор-лигандных систем целлюлозосомы с помощью одномолекулярной силовой спектроскопии на основе АСМ

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50950

⸱

20 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Целлюлосомы - это мультиферментные комплексы, предназначенные для переваривания целлюлозы. SMFS на основе АСМ была использована для изучения механических свойств и конфигурации сворачивания сборок белков, ассоциированных с целлюлосомами. Мы представляем полный рабочий процесс иммобилизации белков, сбора данных и анализа данных для изучения взаимодействий отдельных рецептор-лигандных комплексов, участвующих в сборке целлюлозосом.

Аннотация

Целлюлозосомы - это дискретные мультиферментные комплексы, используемые подмножеством анаэробных бактерий и грибов для переваривания лигноцеллюлозных субстратов. Сборка ферментов на некаталитическом скеффолдном белке управляется взаимодействиями между семейством родственных рецептор-лигандных пар, содержащих взаимодействующие модули когезина и докерина. Чрезвычайно прочная связь между когезиновыми и докериновыми модулями приводит к константам диссоциации в низком пикомолярном и наномолярном диапазоне, что может затруднить точные измерения скорости с помощью обычных объемных методов. Одномолекулярная силовая спектроскопия (SMFS) с использованием атомно-силового микроскопа измеряет реакцию отдельных биомолекул на силу и, в отличие от других методов манипуляции с одиночными молекулами (т.е. оптического пинцета), является оптимальной для изучения высокоаффинных рецептор-лигандных взаимодействий из-за своей способности зондировать высокосиловой режим (>120 пН). Здесь мы представляем наш полный протокол изучения сборок целлюлозных белков на уровне отдельных молекул. Используя топологию белка, полученную из нативной целлюлозы, мы работали с фермент-докерином и углеводсвязывающим модулем-когезином (CBM-когезином), каждый из которых имеет доступную свободную тиоловую группу в сконструированном остатке цистеина. Мы представляем наш протокол иммобилизации поверхности для конкретного места, а также нашу процедуру измерения и анализа данных для получения подробных параметров связывания для высокоаффинного комплекса. Мы демонстрируем, как количественно оценить силы разворачивания в одной подобласти, комплексные силы разрыва, кинетические скорости смещения и потенциальную ширину связующей ямы. Далее описывается успешное применение этих методов для характеристики взаимодействия когезин-докерин, ответственного за сборку многодоменных целлюлолитических комплексов.

Введение

Целлюлозы - это большие мультиферментные комплексы, отображаемые на поверхности анаэробных целлюлозолитических бактерий (например, C. thermocellum), которые эволюционировали для эффективной деполимеризации лигноцеллюлозы растительной клеточной стенки в растворимые олигосахариды1. Центральным признаком целлюлосом является высокоаффинное взаимодействие когезина и докерина. В наиболее распространенной парадигме высококонсервативный докериновый модуль из 60-75 аминокислот I типа отображается на С-концевом конце различных бактериальных ферментов. Модуль докерина направляет сборку синергетических комбинаций ферментов на некаталитический белок скаффолда («скаффолдин»), который содержит полипротеин когезиновых доменов, специфичных для модуля докерина I типа. На более высоких уровнях архитектура целлюлосомы может стать очень сложной, включая альтернативные пары когезина и докерина (например, тип II, тип III), которые закрепляют структуры на поверхности клетки и позволяют собирать разветвленные структуры, содержащие несколько скаффолдинов. Различные типы когезин-докеринов, несмотря на наличие родственных структур, демонстрируют дифференциальную специфичность связывания, подавляющую перекрестную реактивность с непреднамеренными скаффолдинами или компонентами других видов бактерий, продуцирующих целлюлозосомы. В то время как биоинформатические подходы успешно идентифицировали тысячи уникальных целлюлозных компонентов на генетическом уровне, известно сравнительно мало белковых структур, а механизмы, работающие в определении специфичности когезина-докерина, остаются активной областью исследований в области структурной биологии.

С момента изобретения атомно-силового микроскопа (АСМ) Биннигом и др.3, были разработаны и постоянно совершенствуются различные режимы работы АСМ, включая бесконтактную визуализацию, визуализацию в колебательном режиме4 и спектроскопию одной молекулы (SMFS)5,6. SMFS превратился в широко используемый метод прямого исследования отдельных белков7-11, нуклеиновых кислот12-15 и синтетических полимеров16-19. В типичном эксперименте SMFS по исследованию связывания рецептор-лиганд20,21 кончик кантилевера АСМ модифицируют одним из партнеров по связыванию, в то время как плоскую стеклянную поверхность модифицируют комплементарным партнером по связыванию. Модифицированный кантилевер соприкасается с поверхностью, что позволяет партнерам связываться. Затем основание консоли отводится с постоянной скоростью, а сила измеряется методом оптического прогиба рычага. Результирующие следы данных о силе-расстоянии демонстрируют пилообразные пики, если было установлено связывание. В случаях, когда партнеры по связыванию слиты с несколькими белковыми доменами, каждый пик в кривой сила-расстояние может быть коррелирован с развертыванием одного белкового домена или свернутого субдомена, в то время как последний пик соответствует разрыву границы раздела связывания белка. Конкретные положения устойчивых к силе элементов могут быть использованы в качестве отпечатка пальца для идентификации различных белковых доменов, представляющих интерес. Этот метод может быть использован для исследования важных аминокислот, участвующих в сворачивании и стабилизации белка. В литературе было описано множество моделей, рассматривающих характерное поведение удлинения силы, наблюдаемое в экспериментах SMFS. К наиболее часто используемым моделям относятся свободно шарнирная цепь (FJC) модели22, червячная цепь (WLC) модели18,23-25 и свободно вращающаяся цепь (FRC) модели25,26.

В нашей предыдущей работе11 мы использовали одномолекулярную силовую спектроскопию для исследования взаимодействия модулей когезина и докерина. В данной работе мы представляем экспериментальный протокол функционализации стеклянной поверхности и кантилевера с помощью белковых конструкций фермент-докерин и CBM-когезина. Мы также представляем протокол SMFS на основе АСМ, включающий процедуры сбора и анализа данных. Описанный протокол может быть легко обобщен на другие молекулярные системы и должен оказаться особенно полезным для исследователей, заинтересованных в парах высокоаффинных рецепторных лигандов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Схема геометрии растяжения, использованной в данной работе для исследования взаимодействия когезина и докерина, представлена на Рисунке 1A. Протокол иммобилизации белков для функционализации кантилевера и покровного стекла, описанный здесь, является модифицированной версией процедуры, опубликованной ранее27. Белки экспрессировали из плазмидных векторов в E. coli стандартными методами. Белки были сконструированы с доступной растворителю тиольной группой, которая в сочетании с химией малеинимида использовалась для прикрепления белка к поверхности покровного стекла и кантилевера посредством стабильной тиоэфирной связи. Введенные остатки цистеина в обоих слитных белках CBM-когезин и ксиланаза-докерин располагались со стороны N-конца белков, вдали от интерфейса связывания когезина и докерина11. Подробный обзор химических связей, использованных при иммобилизации белков, показан на Рисунке 1B.

1. Подготовка образцов

  1. Буферы
    1. Приготовьте трис-солевой буфер с добавлением кальция (TBS): 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.2
    2. Приготовьте боратный буфер: 50 mM Na2B4O7, pH 8.5
      Схема процесса, демонстрирующая этапы подготовки образцов, представлена на Рисунке 2.
      При работе с кантилеверами и покровными стеклами рекомендуется использовать самозажимные пинцеты.
  2. Аминосиланизация покровного стекла (приблизительно 1,5 ч)
    1. Поместите покровное стекло (диаметром 24 mm, толщиной 0,5 mm) в PTFE-держатель.
    2. Обработайте покровное стекло в ультразвуковой ванне в смеси этанола и ультрачистой воды (1:1 (v/v)) в течение 15 мин.
    3. Промойте покровное стекло ультрачистой водой.
    4. Поместите покровное стекло в раствор Пиранья (1:1 H2SO4 (концентрированная) : H2O2 (30%) (v/v)) на 30 мин, затем тщательно промойте ультрачистой водой. Высушите покровное стекло под мягкой струей N2. Осторожно: раствор Пиранья обладает чрезвычайно сильным коррозионным действием. Необходимо использовать средства защиты глаз и кожи.
    5. Погрузите покровное стекло в смесь этанола, ультрачистой воды и 3-аминопропилдиметилэтоксисилана в соотношении 45:5:1 (v/v). Поместите на шейкер при RT на 60 мин (приблизительно 50 rpm).
    6. Последовательно погрузите покровное стекло в этанол и ультрачистую воду (по 2 раза в каждый). Высушите покровное стекло под мягкой струей N2.
    7. Прокалите покровное стекло в печи (80 °C в течение 30 мин).
    8. Силанизированные покровные стекла можно хранить в атмосфере аргона до 6 недель.
  3. Аминосиланизация кантилеверов (приблизительно 1,5 ч)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный протокол функционализации зонда подходит для кремниевых кантилеверов.
    1. Поместите кантилеверы на чистое предметное стекло. Обработайте их УФ-озоном в течение 15 мин.
    2. Погрузите кантилеверы на 3 мин в смесь этанола и 3-аминопропилдиметилэтоксисилана (1:1 (v/v)) с каталитическим количеством (0,25% (v/v)) ультрачистой воды.
    3. Промойте кантилеверы при осторожном перемешивании последовательно в течение 60 сек в стаканах с толуолом, этанолом и ультрачистой водой. Осторожно просушивайте кантилеверы на фильтровальной бумаге между промывками.
    4. Поместите рычаги на чистое предметное стекло и прокалите (80 °C в течение 30 мин).
  4. Восстановление дисульфидных связей белка (приблизительно 3 ч)
    Все растворы следует готовить таким образом, чтобы получить приблизительно 30 µl разбавленного белка на один кантилевер и 20 µl разбавленного белка на одно покровное стекло. Растворы белков следует смешивать с гелем для восстановления дисульфидных связей Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) в соотношении 1:2 (v/v).
    1. Приготовьте аликвоты бусин TCEP для восстановления дисульфидных связей в микропробирках. При дозировании суспензии бусин TCEP рекомендуется обрезать кончики микропипеток ножницами для увеличения диаметра отверстия.
    2. Промойте суспензию бусин TCEP 1 ml буфера TBS и центрифугируйте при 850 rcf в течение 3 мин.
    3. Осторожно удалите и отбросьте супернатант с помощью микропипетки.
    4. Повторите шаги 1.4.2–1.4.3 дважды.
    5. Добавьте концентрированный раствор белка (1-10 mg/ml) к бусинам TCEP (1:2 белок : суспензия бусин TCEP (v/v)) и осторожно перемешайте, используя наконечник микропипетки. Избегайте появления пузырьков воздуха.
    6. Поместите смесь белка и суспензии бусин TCEP на ротатор на 2,5 ч.
  5. ПЭГилирование покровных стекол и кантилеверов (приблизительно 1,5 ч)
    1. Перед модификацией с помощью линкеров NHS-PEG-maleimide выдержите аминосиланизированные кантилеверы и покровные стекла в боратном буфере (pH 8.5) в течение 45 мин для депротонирования первичных аминогрупп на поверхности.
    2. Перед открытием крышки и взвешиванием необходимого количества порошка для приготовления 25 mM раствора убедитесь, что NHS-PEG-maleimide прогрет до RT. Неиспользованный NHS-PEG-maleimide следует хранить в атмосфере аргона при -20 °C. Требуется приблизительно 30 µl полимерного раствора на один кантилевер и 90 µl на 2 покровных стекла (сложенных вместе).
    3. После взвешивания 5 kDa NHS-PEG-maleimide добавьте боратный буфер и перемешайте на вортексе до получения 25 mM раствора.
      Примечание: Раствор следует использовать как можно быстрее из-за чрезвычайно короткого периода полураспада NHS при pH 8.5. Перемешивание на вортексе и перенос жидкости на кантилеверы/покровные стекла должны быть завершены в течение 1-2 мин.
    4. Инкубируйте кантилеверы в каплях 30 µl раствора NHS-PEG-maleimide в чашке Петри. Для покровных стекол нанесите 90 µl раствора NHS-PEG-maleimide на одно стекло и накройте его вторым стеклом, создавая «сэндвич» с раствором NHS-PEG-maleimide посередине.
    5. Инкубируйте кантилеверы/покровные стекла с раствором NHS-PEG-maleimide в атмосфере, насыщенной водяным паром, при RT в течение 1 ч.
  6. Конъюгация белка (приблизительно 2 ч)
    Критически важно: минимизируйте воздействие воздуха на ПЭГилированные кантилеверы и покровные стекла.
    1. Центрифугируйте растворы белка с бусинами TCEP при 100 rcf в течение 1 мин и соберите супернатант.
    2. Разбавьте раствор белка буфером TBS. Стремитесь к тому, чтобы концентрация белка при конъюгации с поверхностью находилась в диапазоне 0,5-2 mg/ml. Отставьте восстановленные и разбавленные растворы белка на несколько минут, пока промываете кантилеверы и покровные стекла.
    3. Промойте кантилеверы и покровные стекла в трех последовательных стаканах с ультрачистой водой.
    4. Осторожно удалите остатки жидкости с покровных стекол, аккуратно прикоснувшись краями к фильтровальной бумаге под мягкой струей N2. Осторожно удалите остатки жидкости с кантилеверов, приложив их к фильтровальной бумаге. Немедленно нанесите разбавленный раствор белка.
    5. Установите покровные стекла в соответствующий держатель образцов, совместимый с прибором АСМ.
    6. Инкубируйте ПЭГилированные покровные стекла и кантилеверы с соответствующими разбавленными растворами белков при RT в течение 1-2 ч.
    7. Промойте кантилеверы в трех последовательных стаканах с TBS для удаления несвязанных белков. Промойте покровные стекла с помощью пипетки не менее 10 раз.
    8. Храните кантилеверы и покровные стекла в буфере TBS до начала измерений.

2. Сбор данных

В данной работе использовался специально сконструированный АСМ28, управляемый контроллером MFP-3D AFM от Asylum Research с помощью специально написанного программного обеспечения Igor Pro. Прогиб кантилевера измеряется методом оптического отклонения луча29. Представленные здесь протоколы подготовки образцов и анализа данных применимы независимо от используемой модели АСМ. Однако модель АСМ должна подходить для измерений в жидкостях и обеспечивать доступный диапазон скоростей по z-пьезоэлементу примерно 200-5,000 nm/sec.

  1. Установите функционализированный кантилевер и стеклянную поверхность в АСМ. На протяжении всей процедуры поверхность должна оставаться покрытой буфером. При установке кантилевера сводите к минимуму его воздействие с воздухом. После правильной юстировки лазерного луча дайте системе стабилизироваться в течение не менее 30 мин для уменьшения эффектов дрейфа и, при необходимости, проведите повторную юстировку.
  2. Запишите спектр теплового шума при расположении кантилевера вдали от поверхности, т. е. в отсутствие эффектов демпфирования.
  3. Для поиска поверхности без повреждения кончика кантилевера перед началом измерений используйте малоинвазивный метод, например, акустический подход. По возможности выполняйте приближение кантилевера к поверхности вручную, используя наушники для прослушивания теплового шума на необработанном выходном сигнале отклонения (raw deflection) контроллера АСМ. Как только кантилевер приблизится к поверхности, станет слышно отчетливое изменение звука.
    Примечание: теперь кончик кантилевера должен находиться на расстоянии 2-5 µm поверхности. Характер изменения звука зависит от используемого кантилевера. Резонансная частота кантилевера, использованного в данной работе, в воде составляет приблизительно 25 кГц, что превышает диапазон слышимости человека. Из-за эффектов демпфирования вблизи поверхности резонанс смещается в сторону более низких частот, что переводит резонанс кантилевера в слышимый диапазон. Таким образом, воспринимается кажущееся увеличение частоты и интенсивности звука.
    В случаях, когда аудиовывод сигнала отклонения недоступен, приближение к поверхности может осуществляться с помощью z-пьезоэлектрика при включенной активной обратной связи по сигналу отклонения. Как только сигнал отклонения увеличивается на заданную величину вследствие вдавливания в поверхность, процесс приближения прекращается.
  4. Определите обратную чувствительность оптического рычага (InvOLS), которая представляет собой величину смещения острия (в нм) на один вольт сигнала отклонения. Для этого выполните вдавливание острия кантилевера в поверхность. Рекомендуется установить заданное напряжение отклонения (set point voltage), соответствующее смещению острия кантилевера приблизительно на 3 нм.
  5. Определите жесткость кантилевера путем аппроксимации спектра теплового шума функцией отклика простого гармонического осциллятора в соответствии с теоремой о равнораспределении энергии30,31.
  6. Запустите экспериментальный цикл. В данной работе использовался следующий набор параметров измерения: скорость сближения: 3000 нм/с; сила индентирования: 180 пН; время выдержки на поверхности: 10 мс; скорости отвода: 0,2, 0,7, 2,0. 5.0 µm/sec с частотой дискретизации соответственно 2000, 5000, 15 000, 20 000 Гц; расстояние отвода: 500 нм.
    Примечание: частота дискретизации не должна превышать 10 точек/нм во избежание избыточной выборки и для поддержания приемлемого объема данных.
  7. После каждого измерения зависимости силы от расстояния перемещайте пьезопозиционеры по осям x и y, чтобы при каждой кривой «сила — расстояние» кантилевер взаимодействовал с новым участком поверхности. Данный метод позволяет охватить большую площадь поверхности покровного стекла при проведении длительных измерений.
  8. Используйте периодический сброс нулевого значения (резерирование) калибровки отклонения платформы (т. е. положение фотодиода) и высоту шасси z-пьезопривода при длительных измерениях в случае, если сигнал отклонения выходит за пределы допустимого диапазона или теряется контакт с поверхностью.
  9. По завершении серии измерений проведите еще одно измерение InvOLS, используя значительно большую силу индентирования, чем та, что применялась перед измерениями, чтобы получить более точное значение InvOLS.
  10. Запишите еще один спектр теплового шума вдали от поверхности. Определите коэффициент жесткости пружины в конце экспериментального цикла.

3. Анализ данных

Блок-схема на Рисунке 3 иллюстрирует процесс анализа данных. Все манипуляции с данными следует выполнять с помощью подходящего программного пакета, такого как Igor Pro или MATLAB. Сначала преобразуйте необработанный сигнал с детектора в единицы силы и скорректируйте смещение и дрейф. Затем используйте модели эластичности биополимеров для определения энергетических барьеров на путях разворачивания и идентификации субдоменов белка. В завершение определяют кинетические и энергетические параметры взаимодействия рецептора с лигандом.

  1. Преобразование единиц и коррекция данных
    1. Умножьте исходный сигнал отклонения (в вольтах) на InvOLS (нм/вольт) и константу жесткости (пН/нм), чтобы перевести напряжение детектора в единицы силы.
    2. Выполните смещение данных таким образом, чтобы значение силы для незагруженного кантилевера было равно 0 пН: для этого сначала вычислите среднее значение силы для последних 10% кривой зависимости силы от расстояния (полученных на максимальном удалении от поверхности), а затем вычтите это среднее значение из всех значений силы в данной кривой.
    3. Сместите каждую кривую по оси x таким образом, чтобы первое пересечение с осью расстояния происходило в точке 0 нм.
    4. Значение InvOLS зависит от положения лазерного пятна на кантилевере. Даже небольшой дрейф в оптической системе считывания может вызвать заметные изменения InvOLS, если размер пятна сопоставим с площадью контакта кантилевера. Скорректируйте это путем анализа шума сигнала отклонения при нулевой силе. При неизменных условиях окружающей среды шум сигнала отклонения прямо пропорционален InvOLS.
      1. Измерьте среднеквадратичное (RMS) значение отклонения (уровень шума при нулевой силе) для последних 10% каждой кривой зависимости силы от расстояния.
      2. Постройте график зависимости шума от номера кривой и примените подходящий метод аппроксимации. Обычно лучше всего работает экспоненциальная аппроксимация в виде Формула экспоненциального затухания, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), математическое представление., где N — шум, ni — номер кривой, а N0 и k — параметры аппроксимации. Для некоторых наборов данных может быть подходящей линейная аппроксимация.
      3. Определите коэффициент масштабирования (SF) для каждой кривой:

        Уравнение 1:
        уравнение статического равновесия; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); математическая формула
        где ni — номер кривой, nf — номер конечной кривой, а C — смещение.
      4. Затем разделите все значения силы в каждой отдельной кривой на этот коэффициент масштабирования. Эта процедура масштабирует каждую кривую согласно отношению RMS-значения шума текущей кривой к RMS-значению шума конечной кривой, полученной непосредственно перед измерением InvOLS.
      5. Выполните коррекцию отклонения, чтобы преобразовать ось расстояния (z) в молекулярное растяжение (z*). Это учитывает изгиб кантилевера под действием силы, который сокращает расстояние между кончиком кантилевера и образцом по сравнению со значением, регистрируемым датчиком положения z-пьезоэлемента.

        Уравнение 2:
        Уравнение статического равновесия, z* = z - F/k, формула; физические расчеты, анализ силы
        Где z — измеренное положение z-датчика, F — сила, действующая на кантилевер, и k — константа жесткости.
  2. Анализ контурной длины
    Контурная длина белка — это максимальная растянутая длина полипептидной цепи. Состояние фолдинга белка характеризует его геометрию и расстояние между концами, определяемые вторичной и третичной структурой. Контурная длина белка напрямую связана с его состоянием фолдинга9,25,32. Положение конкретных разрывов на кривых зависимости силы от растяжения сильно варьируется из-за полидисперсности ПЭГ-линкеров, а также внешних параметров, таких как температура, свойства буфера и скорость нагружения. Это затрудняет прямой анализ данных, но проблему можно решить, преобразовав данные зависимости силы от растяжения в пространство контурной длины. Данный метод позволяет проводить усреднение по огромным массивам данных и использовать автоматическое распознавание образов для идентификации характерных событий разворачивания. Таким образом, становится возможной сортировка отдельных кривых силы в зависимости от типа проявляемого взаимодействия. Для преобразования данных зависимости силы от растяжения в пространство контурной длины используется следующая ранее описанная процедура25.
    1. Решение модели WLC (уравнение 3)23 для контурной длины L при фиксированной длине персистенции p приводит к уравнению 4, которое определяет контурную длину L(x,u). Здесь x — расстояние, а u=F*p/kBT, где kB — постоянная Больцмана, а T — температура. Рассматриваются только действительные решения. Дополнительными ограничениями являются x, F>0, L>0, x>0;

      Уравнение 3:
      Формула зависимости силы от растяжения, F(x,L), уравнение физики полимеров, иллюстрирующее энтропийную упругость.

      Уравнение 4:
      Статическое равновесие, L(x,u), сложная формула, учебная диаграмма, интерпретация аналитического выражения.
      где
      Уравнение полиномиальной функции \( g(u) \), математический анализ, символьные вычисления.
    2. Постройте график преобразованных точек данных (зависимость силы от контурной длины). Примените порог силы примерно 10 пН для исключения шума. Неспецифические взаимодействия можно отсечь, применив фильтр длинных волн (long-pass filter). Постройте гистограмму контурных длин.
    3. Выполните кросс-корреляцию33 полученных гистограмм с шаблонной гистограммой и примените смещение по оси x для коррекции полидисперсности ПЭГ. Используйте полученные значения корреляции для оценки сходства отдельных кривых данных. Таким образом, данные можно распределить по предопределенным классам для упрощения дальнейшего анализа.
    4. Используйте аналогичный метод автокорреляции для поиска повторяющихся элементов в одной кривой, например, при многократном разворачивании Ig-доменов.
    5. Отсортируйте кривые вручную для изучения других событий разворачивания.
  3. Анализ скорости нагружения
    Извлеките кинетическую и энергетическую информацию о диссоциации рецептора и лиганда, применив соответствующие модели к спектру сил, т. е. к графику зависимости силы разрыва от ln(скорости нагружения).
    1. Для данной скорости растяжения определите силу разрыва и скорость нагружения для интересующих событий разрыва:
      1. Выполните линейную аппроксимацию кривой зависимости силы от времени в окрестности интересующего события разрыва. Определите скорость нагружения по наклону прямой, аппроксимирующей пик. Повторите эту процедуру для каждой кривой, на которой наблюдается интересующее событие разрыва.
      2. Определите наиболее вероятную силу разрыва, применив гауссову аппроксимацию к гистограмме сил разрыва. Возможны альтернативные функции аппроксимации.
      3. Определите наиболее вероятную скорость нагружения.
    2. Повторите шаги 3.3.3.1–3.3.3.3 для всех скоростей растяжения.
    3. Постройте график зависимости наиболее вероятных сил разрыва от натурального логарифма наиболее вероятных скоростей нагружения для получения спектра сил.
    4. Примените подходящую теоретическую модель к спектру сил для извлечения кинетических и энергетических параметров (Рисунок 4C). Во многих случаях можно использовать линейную модель Белла-Эванса20,34, которая позволяет получить хорошие оценки для koff (константы скорости диссоциации в отсутствие силы) и Dx (расстояния до переходного состояния вдоль координаты реакции), как показано в уравнении 5.

      Уравнение 5:
      уравнение статической силы ⟨F⟩, k_B T/Δx, анализ формулы для экспериментов по тепловым флуктуациям

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы использовали описанную процедуру для исследования пары когезин-докерин I типа из C. thermocellum. После успешного связывания пары когезин-докерин на записанных кривых зависимости силы от расстояния проявились характерные пиковые паттерны. Типичная кривая представлена на Рисунке 4a. Каждый пик на кривой соответствует разворачиванию одного белкового субдомена, при этом последний пик соответствует диссоциации рецепторно-лигандного комплекса.

Для комплекса CBM-когезин-...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Чтобы получить значимые данные экспериментов с помощью силовой спектроскопии отдельных молекул, крайне важно добиться четко определенной и воспроизводимой геометрии вытягивания. Используемый здесь протокол приводит к сайт-специфической иммобилизации белковых комплексов в определенной геометрии вытягивания.

Консоли, использованные в данном исследовании, были выбраны из-за их чувствительности к усилию и высокой резонансной частоты в воде. Кроме того, малая кривизна зонда (около 10 нм) является п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы признательны за финансирование из гранта Европейского исследовательского совета Герману Гаубу. Майкл А. Нэш выражает благодарность за финансирование от Общества в науке - программы стипендий Бранко Вайса. Авторы благодарят Эдварда А. Байера, Йоава Барака и Даниэля Б. Фрида из Научного института Вейцмана за щедрое предоставление белков, использованных в этом исследовании. Авторы благодарят Германа Э. Гауба, Элиаса М. Пухнера и Стефана В. Шталь за полезные дискуссии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-АминопропилдиметилэтоксисиланABCR GmbHAB110423
5 кДа NHS-PEG-малеимидRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP Редуцирующий гель для дисульфидаThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
Tris(гидроксиметил)аминометан
BioLever мини консоли из нитрида кремнияOlympusBL-AC40TS-C2Мягкие партии
XYZ Пьезоэлектрические приводыPhysik Instrumente GmbH
Infrared " широкого спектра» ИК лазерSuperlum
MFP-3D AFM контроллерAsylum Research
Igor Pro 6.31WavemetricsСбор и анализ данных
Хлорид
натрия Хлорид
pH-метр
борат
Пинцет
Чехол для очковThermo Scientific, Menzel-Glä serдиаметр 24 мм, толщина 0,5 мм
держательизготовленный на заказ
Ультразвуковая ванна
Этаноланалитической чистоты
Серная кислота (концентрированная)аналитическая чистота
Перекись водорода (30%)аналитическая чистота
Орбитальный шейкер
Толуоланалитической чистоты
Фильтровальная бумага
Предметные стекла Микропробирки
Микропипетки
Центрифугаподходит для микропробирок
Ротатор
Чашки
Стаканы
Оптический микроскоп
кальция натрия образца из ПТФЭ Петри

Ссылки

  1. Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
  2. Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).
  3. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  4. Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  5. Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
  6. Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
  7. Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  8. Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
  9. Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  12. Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
  13. Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).
  14. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
  15. Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
  16. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  17. Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
  18. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
  19. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  20. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  21. Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
  22. Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
  23. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  24. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).
  25. Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
  26. Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
  27. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
  28. Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
  29. Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
  30. Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
  31. Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
  32. Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
  33. Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
  34. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  35. Dietz, H., Rief, M. Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).
  36. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
  37. Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Исследование рецептор-лигандных систем целлюлозосомы с помощью одномолекулярной силовой спектроскопии на основе АСМ
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.