Генерация химер лимфатических узлов для изучения происхождения стромальных клеток лимфатических узлов

Summary

Описано создание химер лимфатических узлов/жировых пакетов для изучения происхождения стромальных клеток лимфатических узлов. Метод включает в себя выделение лимфатических узлов у новорожденных мышей и эмбриональных жировых пакетов, генерацию химерных жировых пакетов лимфатических узлов и их перенос под капсулу почки мыши-хозяина.

Abstract

Строма является ключевым компонентом структуры и функции лимфатических узлов. Однако мало что известно о его происхождении, точном клеточном составе и механизмах его формирования. Лимфатические узлы всегда инкапсулированы в жировую ткань, и недавно мы продемонстрировали важность этой связи для формирования стромы лимфатических узлов. Клетки-предшественники адипоцитов мигрируют в лимфатический узел во время его развития, и при взаимодействии с рецептором Lymphotoxin-b отключают адипогенез и дифференцируются в лимфоидные стромальные клетки (Bénézech et al.¹⁴). Основываясь на потенциале лимфоидной стромы жировой ткани, мы представляем метод с использованием химеры лимфатических узлов/жировых пакетов, который позволяет проследить происхождение предшественников стромальных клеток лимфатических узлов. Мы покажем, как изолировать новорожденные лимфатические узлы и эмбриональную жировую ткань EYFP⁺ и создать химеру жировых пакетов LN/EYFP⁺. После переноса под капсулу почки мыши-хозяина лимфатический узел включает в себя клетки-предшественники местной жировой ткани и завершает свое формирование. Анализ потомства клеток жировых пакетов EYFP⁺ в полученных лимфатических узлах может быть выполнен с помощью проточного цитометрического анализа ферментативно расщепленных лимфатических узлов или с помощью иммунофлуоресцентного анализа криорезов лимфатических узлов. Используя жировые пакеты из различных моделей мышей с нокаутом, этот метод обеспечит эффективный способ анализа происхождения различных популяций стромальных клеток лимфатических узлов.

Introduction

Лимфатические узлы (ЛН) являются ключевыми органами иммунной системы, расположенными в стратегических местах тела, вдоль лимфатической сосудистой сети. Они обеспечивают фильтрацию антигенов и патогенов и обеспечивают площадку для презентации антигена в лимфоцитах и индукции адаптивных иммунных реакций. Строма, которая формирует основную структуру ЛН и координирует движение различных кроветворных участников адаптивного иммунного ответа, занимает центральное место в функции этих органов. Различные популяции стромальных клеток дают необходимые и специфические сигналы для перемещения, локализации, выживания, пролиферации и созревания гемопоэтического компонента иммунной системы^1-3. Взрослые стромальные клетки LN делятся на три категории: эндотелиальные клетки крови, лимфатические эндотелиальные клетки и фибробласты. Эти три категории охватывают гетерогенные популяции. Фибробластические популяции содержат фибробластические ретикулярные клетки (FRC), фолликулярные дендритные клетки (FDC), маргинальные ретикулярные клетки (MRC), в то время как фибробласты, образующие капсулу, мозговое вещество и другие клетки, которые еще не идентифицированы^1-5. Происхождение и механизмы, управляющие созреванием различных популяций стромальных клеток LN, неясны, а отсутствие специфических маркеров, позволяющих картировать судьбу конкретных популяций стромальных клеток LN, делает их изучение особенно сложным. Тем не менее, полное понимание онтогенеза стромальных клеток LN необходимо для понимания адаптивных иммунных реакций, механизмов, способствующих толерантности, и лежит в основе разработки искусственных LN.

До сих пор изучение происхождения и развития стромальных клеток LN в основном ограничивалось прямой оценкой развития LN у эмбрионов и новорожденных у мышей дикого типа и различных нокаутных линий мышей^6-9. Эти подходы ограничены эмбриональной и перинатальной летальностью некоторых линий мышей, несущих делеции в генах, важных для развития LN. Более того, некоторые из генов, необходимых для развития лимфоидной ткани, также участвуют в широком спектре биологических процессов, как в случае с RANK^10-11 или NF-κB2¹². Для решения этих проблем были проведены выделение и трансплантация эмбриональных LN под почечную капсулу мыши-хозяина^12-13. Этот метод позволяет, например, переносить генетически модифицированные эмбриональные LN в среду дикого типа для оценки развития органов, а также набора и организации клеток-хозяев. Тем не менее, рост эмбрионального LN, привитого под капсулу почки взрослого хозяина, нарушается, что ограничивает использование этого метода.

LNs и жировые отложения анатомически тесно связаны и развиваются одновременно во время эмбриогенеза. Недавно мы продемонстрировали, что ассоциация LN/жировая ткань играет решающую роль в обеспечении стромальных клеток-предшественников для LN. В частности, передача сигналов через LTβR контролирует судьбу клеток-предшественников адипоцитов, блокируя адипогенез и вместо этого способствуя созреванию в сторону фенотипа стромальных клеток LN¹⁴. Здесь мы описываем метод, основанный на генерации химер LN-жировых пакетов, позволяющих отслеживать клетки, полученные из жировой ткани, в развивающейся LN. Этот метод будет полезен для определения вклада жировых тканей в различные популяции стромальных клеток LN и в сочетании с использованием тканей из генетически модифицированных линий мышей позволит лучше понять механизмы, контролирующие дифференцировку различных субпопуляций стромальных клеток LN.

Protocol

Мыши были выведены и содержались в условиях SPF в Подразделении биомедицинской службы Университета Бирмингема в соответствии с правилами Министерства внутренних дел Великобритании и местного комитета по этике. Все процедуры, описанные в настоящем протоколе, регулируются лицензией на проект, утвержденной как местным комитетом по этике, так и Министерством внутренних дел.

1. Выделение новорожденных LN

1. Принесите в жертву новорожденных мышей при вывихе шейки матки.
2. Разрежьте голову, и вскройте тело ножницами от верхней части грудного отдела до нижней части брюшной области и тщательно удалите все внутренние органы (сердце, легкие, печень, кишечник, почки, мочевой пузырь) из брюшной полости.
3. Перенесите тело в чашку Петри диаметром 90 мм, содержащую среду RF10 (RPMI1640 среды с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина). Начиная с этого этапа, ткани будут храниться в стерильных условиях и обрабатываться в колпаке для культуры тканей.
4. Перенесите корпус в новую чашку Петри 90 мм, содержащую RF10.
5. Под рассекающим микроскопом осторожно отделите брюшину от кожи в паховой области. Паховая ЛУ расположена на пересечении трех кровеносных сосудов в жировом пакете.
6. Осторожно снимите ЛН. Убедитесь, что вся жировая ткань удалена. Перенесите LN в чашку Петри 50 мм, содержащую среду RF10. Держите салфетки на льду, продолжая процедуру.

2. Выделение жировых пакетов E18.5

1. Чтобы получить эмбрионы мышей на 18,5-й день беременности (E18.5), установите временную беременность, поместив самку и самца мыши в клетку на ночь. Утром отделите мышей и проверьте наличие вагинальных пробок (гестационный день Е0,5).
   1. Усыпить закупоренных самок на 18,5 день беременности по причине вывиха шейки матки.
   2. Извлеките эмбрионы и поместите их в чашку Петри диаметром 90 мм, содержащую RF10.
2. Начиная с этого этапа, ткани должны обрабатываться с использованием стерильной техники в капюшоне для культуры тканей. Под препарирующим микроскопом разрежьте голову, вскройте эмбрионы ножницами от грудного отдела до дна брюшной области и тщательно удалите все внутренние органы (сердце, легкие, печень, кишечник, почки, мочевой пузырь) из полости тела.
3. Очистите тело от всех оставшихся висцеральных тканей и промойте его в PBS, чтобы удалить все следы крови, которые могут затруднить вскрытие.
4. Переложите чистые корпуса в свежую чашку Петри 90 мм, содержащую RF10.
5. Аккуратно отделите брюшину от кожи в паховой области. Паховая ЛУ расположена на пересечении трех кровеносных сосудов в жировом пакете.
6. Осторожно извлеките ЛН и выбросьте его. Очень важно полностью удалить ЛН, чтобы гарантировать, что жировая подушка, используемая для химер, не загрязнена лимфоидными стромальными клетками.
7. Снимите паховую жировую подушку и переложите ее в чашку Петри диаметром 50 мм, содержащую фильтрующий материал RF10. Держите салфетки на льду, продолжая процедуру.

3. Генерация LN-fat Pad Chimera

1. Подготовка системы культивирования органов in vitro ¹⁵.
   1. Подготовка губки и фильтров: Это можно сделать заранее, а губки и фильтры хранить в стерильном виде в чашке Петри в культуральном шкафу.
      1. Разрежьте обертку Vulkan на 1-1,5 см^{по 2} части
      2. Отварите губки в течение 2 часов в дистиллированной воде.
      3. Дайте губкам высохнуть в течение пары часов в колпаке для клеточных культур.
      4. Кипятите фильтры в течение 20 минут.
      5. Дайте фильтрам высохнуть в течение пары часов в колпаке для клеточных культур.
   2. Приготовьте среду DMEM, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, 10 мМ HEPES, 1x MEM раствором заменимых аминокислот, 50 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глютамина.
   3. Добавьте 2 мл фильтрующего материала в чашку Петри диаметром 50 мм.
   4. Выложите одну губку на дно чашки Петри. Намочите губку с обеих сторон, погрузив их в среду.
   5. Поместите один фильтр поверх губки. Фильтр расположен на границе раздела жидкость-воздух.
2. Под препарирующим микроскопом осторожно соотнесите одну ЛУ новорожденного с одной эмбриональной жировой подушкой.
3. Поместите химеру LN-fat pad поверх фильтра.
4. Переложите чашку Петри в прямоугольный пластиковый ящик с парой отверстий на крышке и содержащей воду на дне для обеспечения влажности.
5. Приклейте крышку к коробке скотчем. Оставьте два отверстия в крышке открытыми.
6. Перенесите коробку в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 °C с 5%_CO2. Дайте коробке уравновеситься в течение 2 часов, прежде чем заклеить отверстия в крышке скотчем.
7. Инкубируйте ткани в течение не менее 2 дней, чтобы LN прикрепился к жировой подушке и мог переноситься под капсулу почки.

4. Перенос химеры LN-жировой подушки под капсулу почки мышей-хозяев

1. Соберите химеры LN-жировой подушки из фильтра и перенесите их под капсулу почки мышей-хозяев. Метод переноса капсул с почкой уже был описан ¹⁶.

5. Изоляция передаваемых LN

1. Через 3-4 недели под почечной капсулой химеры LN-fat pads готовы к сбору. Усыпьте мышей-хозяев в соответствии с утвержденными рекомендациями.
2. Удалите почку у мышей-хозяина.
3. Под рассекающим микроскопом изолируют химеру LN-жировой подушки и препарируют LN.

6. Ферментативное расщепление перенесенных LN для проточно-цитометрического анализа

1. Сделайте один разрез в LN маленькими ножницами, чтобы ферменты проникли в орган и облегчили пищеварение.
2. Поместите одну LN в 1,5 мл Eppendorf, содержащего 600 мкл буфера для сбраживания (RPMI 1% FCS, 2,5 мг/мл Collagenase D, 100 мкг/мл DNase I).
3. Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C на перемешивающем термоблоке. Делайте пипетку вверх и вниз для помощи диссоциации тканей каждые 10 минут.
4. Добавьте 6 мкл ЭДТА 0,5 М в пробирку и проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы завершить диссоциацию тканей.
5. Центрифуга в течение 5 мин при 490 x g.
6. Ресуспендируйте клеточную гранулу в окрашивающем растворе (PBS, 0,1% БСА, 5% сыворотке крови крыс и 5% сыворотке мыши), содержащем комбинацию первичных антител.
7. Выдерживать 30 минут на льду.
8. Дважды постирайте в PBS
9. При необходимости инкубируйте со вторичными антителами в течение 20 минут.
10. Стирайте 2 раза в PBS.
11. Анализ на проточном цитометре.

7. Анализ перенесенных LN методом иммунофлуоресценции

1. Фиксация для сохранения EYFP в процессе замораживания и криосекции: Поместите LN в раствор PBS, 4% PFA и 10% сахарозы и оставьте на 3-4 часа.
2. Нанесите одну маленькую каплю холодного состава на небольшой кусочек алюминиевой фольги. Избегайте образования пузырьков воздуха. Осторожно поместите ЛН без жидкости в середину капли.
3. Заморозьте орган, положив алюминиевую фольгу на сухой лед.
4. Вырежьте секции 8-10 мкм на дополнительные клеевые стекла предметных стекол с помощью криостата. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение 2 часов, прежде чем хранить их при температуре -20 °C.
5. Процедуры окрашивания могут варьироваться в зависимости от используемых первичных антител и могут быть оптимизированы в соответствии со следующим протоколом. Окрашивают срезы окрашивающим раствором (PBS, 1% BSA), содержащим комбинацию первичных антител.
6. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре во увлажненной камере.
7. Дважды постирать в PBS в течение 5 минут
8. Инкубировать со вторичными антителами в течение 1 ч.
9. Дважды постирать в PBS в течение 5 минут.
10. Устанавливайте направляющие в монтажный носитель, содержащий DAPI.
11. Захватывайте изображения с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа.

Results

Через три недели после трансплантации из почки извлекается химера LN/жирового пакета. Химера теперь очень похожа на нормальную ЛН в своем собственном жировом пакете, а ЛН видна в центре жировой ткани (Рисунок 1). Если ЛУ не может быть идентифицирована, возможно, что она была потеряна во время трансплантации на почку. При оценке роли генов, потенциально важных в развитии LN, восстановленные LN могут оставаться очень маленькими, и их будет труднее найти. Это имеет место, когда жировая ткань мышей LTβR^...

Discussion

В данной статье мы представили метод анализа и количественной оценки вклада клеток-предшественников жировой ткани в развивающиеся LN и две методики, позволяющие анализировать их потомство. Вскрытие эмбриональных жировых пакетов и LN новорожденных является деликатным процессом и требует ручных навыков, полученных в результате большой практики до создания настоящей химеры LN-жировых пакетов. Для контроля качества диссекций может быть проведен проточно-цитометрический анализ жировых пакетов и ЛН. Препарат эмбрионального жи...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-меркаптоэтанол	Sigma	M3148
50 мм Стерилиновая чашка Петри	Appleton Woods	SC265
90 мм Стерилиновая чашка Петри	Appleton Woods	SC260
Клейкие слайды	Surgipath	00202
Антимышь CD31 eFluor 450 eBioscience		48-0311
Антимышь CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Антимышиный CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Мышиный IgM Rhodamine Red	Stratech	715-296-020-JIR
Противомышиный подопланин PE/Cy7	Biolegend	127411
Противомышиный подопланин очищенный	eBioscience	14-5381
Коллагеназа D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Щипцы Inox Biologie	FST	11252-20	Сверхтонкие щипцы для рассечения эмбрионов и новорожденных
EDTA раствор 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Фетальная бычья сыворотка	Sigma	F9665
Закаленные ножницы для тонкой радужной оболочки глаза прямые 11 см	FST	14090-11	Маленькие ножницы для рассечения
HEPES раствор	Sigma	H0887
Isopore Мембранные фильтры 0.8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-Glutamine solution	Sigma	G7513
MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Пенициллин-стрептомицин	Sigma	P4458
Пластиковая коробка с крышкой	Watkins and Doncaster	E6052	Коробка для сэндвичей для культуры органов in vitro. Просверлите два отверстия в крышке, чтобы обеспечить газообмен в инкубаторе CO2.
RPMI 1640 Medium Sigma		R0883
Губки Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Стереомикроскоп	Leica	LEICA MZ95	Препарирующий микроскоп с зумом
Термомиксер	Eppendorf	5436
Vectashield Монтажная среда с DAPI	Vector Laboratories	H-1200