Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Гельминтами Сбор и определение от дикой природы

16.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51000

⸱

14 декабря 2013 г.

 , 
1Department of Forestry and Natural Resources, Purdue University, 2Helm West Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

Дикие животные обычно паразитируют на широком спектре гельминтов. Четыре основных типа гельминтов - это "круглые черви" (нематоды), "колючие черви" (акантоцефалы), "сосальщики" (трематоды) и "ленточные черви" (цестоды). Здесь мы описываем, как гельминты собираются у позвоночного животного, как они сохраняются и таксономически идентифицируются.

Аннотация

Дикие животные обычно паразитируют на широком спектре гельминтов. Четыре основных типа гельминтов — это «круглые черви» (нематоды), «колючие черви» (акантоцефалы), «сосальщики» (трематоды) и «ленточные черви» (цестоды). Оптимальным методом сбора гельминтов является обследование хозяина, который был мертв менее 4-6 часов, поскольку большинство гельминтов все еще живы. Должно быть проведено тщательное вскрытие и обследованы все основные органы. Органы промывают через сито 106 мкм под проточной водой и исследуют содержимое под стереомикроскопом. Подсчитываются все гельминты и фиксируется репрезентативное число (либо в 70% этаноле, либо в 10% буферизованном формалине, либо в спирт-формалин-уксусной кислоте). Для видовой идентификации гельминтов либо очищают от лактофенола (нематоды и мелкие акантоцефалы), либо окрашивают (трематоды, цестоды и крупные акантоцефалы) с помощью гематоксилина Харриса или кармина семишона. Гельминты определяются по видам путем изучения различных структур (например, спикулы самцов у нематод или ростеллум у цестод). Изложенные здесь протоколы могут быть применены к любому позвоночному животному. Они требуют некоторого опыта в распознавании различных органов и способности дифференцировать гельминтов от других тканевых остатков или содержимого кишечника. Сбор, консервация и окрашивание — это простые методы, требующие минимального количества оборудования и реагентов. Таксономическая идентификация, особенно по видам, может занять очень много времени и может потребовать представления образцов эксперту или анализа ДНК.

Введение

Позвоночные паразитируют на четырех основных группах гельминтов (червей). Две группы, трематоды, или сосальщики, и цестоды, или ленточные черви, относятся к типу Platyhelminthes. Две другие группы — это нематоды, или круглые черви (Nematoda) и акантоцефалы, или колючеголовые черви (Acanthocephala). Многие из этих паразитов были зарегистрированы как причины заболеваемости и смертности среди диких птиц и млекопитающих1,2.

Большинство гельминтов имеют сложные жизненные циклы, включающие более одного хозяина1,2 . Например, у трематод есть один или два промежуточных хозяина (обычно беспозвоночных) и конечный хозяин. Для завершения цикла должны быть доступны все хозяева и, таким образом, взрослые гельминты должны присутствовать в последних хозяевах (которые являются темой данной рукописи). Поэтому важно иметь в виду, что сезонные колебания распространенности и интенсивности некоторых видов гельминтов могут возникать и желательно проводить долгосрочный мониторинг для захвата всего гельминта ауны конкретного хозяина.

Оптимальный метод сбора гельминтов - это осмотр хозяина, который был усыплен. Это позволяет собирать гельминтов, пока они еще живы, и правильно расслаблять и фиксировать их. Материал от хозяев, которые были мертвы более 24 часов назад или были заморожены и разморожены для исследования, часто хуже и его трудно идентифицировать. Трематоды и цестоды от замороженных или формалинизированных хозяев часто сильно заражены и утратили структуры, имеющие решающее значение для идентификации, такие как оральные шипы у трематод или крючки на сколексе ленточных червей. Однако реальность такова, что большая часть материала, доступного от позвоночных хозяев в наши дни, заморожена или сохранена.

Базы данных, содержащие информацию о последовательности ДНК гельминтов, быстро растут, и таким образом таксономическая идентификация уже возможна для многих видов. Поэтому гельминты должны быть максимально сохранены для потенциальных анализов ДНК. Однако ДНК хорошего качества невозможна, если образцы зафиксированы в формалине. Описанные здесь методы сбора и уничтожения гельминтов позволят получить материал, пригодный для экстракции ДНК и генетического анализа.

Ниже мы подробно описываем методы вскрытия позвоночных (амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих; моногенные трематоды из рыб не включены) для сбора гельминтов, а затем процедуры по их сохранению и обработке для таксономической идентификации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животные, использованные в следующих экспериментах, были найдены мертвыми в результате дорожно-транспортных происшествий.

1. Вскрытие животных и скрининг основных органов для коллекции гельминтов

  1. Расположите животное на плоской поверхности и осмотрите все внешние отверстия, включая уши, ротовую полость и глаза, с помощью увеличительного стекла на наличие нематод (круглых) и трематод (плоских и несегментированных) (см. рисунок 1).
  2. Если вы работаете с птицами, промойте их водопроводной водой, чтобы увлажнить перья перед вскрытием.
  3. С помощью острого лезвия или ножа и с помощью пары рассекающих щипцов сделайте разрез над брюшной полостью, стараясь не разорвать какие-либо органы. Для черепах с твердым панцирем используйте ручную пилу, чтобы разрезать кость в области моста между грудным и брюшным щитками.
  4. Откройте грудную полость, как указано выше; для крупных животных могут потребоваться косторезы или небольшая ручная пила, чтобы разрезать ребра.
  5. Если вы работаете с птицами, осмотрите воздушные мешки на месте перед удалением каких-либо органов. При необходимости используйте лупу.
  6. Осмотрите обе полости на наличие филяриальных круглых червей и крупных трематод.
  7. Перед удалением желудочно-кишечного тракта из брюшной полости завяжите одну нить близко к началу пищевода и еще одну в конце толстой кишки (прямой кишки).
  8. Разделите следующие органы грудной клетки в чашки Петри (или стеклянные лотки, если органы слишком большие) для исследования под стереомикроскопом (10-30X): сердце и крупные кровеносные сосуды, трахея и легкие.
  9. Удалите печень, желчный пузырь и протоки, поджелудочную железу, селезенку, почки и мочевой пузырь и обследуйте их, как описано в шаге 1.8.
  10. Удалите всю пищеварительную систему и поместите каждую секцию в стеклянную посуду/подносы.
  11. После извлечения органов промойте полость тела с помощью шланга или пульверизатора, наполненного 0,9% физиологическим раствором, в сетчатое сито размером 106 мкм и исследуйте содержимое сита под стереомикроскопом на наличие филяриальных червей или кровяных трематод.
  12. Вскройте ножницами каждый участок пищеварительного тракта, соскребите слизистую и внимательно осмотрите на наличие крупных паразитов (>1 см). При необходимости используйте лупу. Хоботки акантоцефалов часто глубоко внедрены в стенку кишечника и, возможно, их придется осторожно вытаскивать из ткани с помощью щипцов и/или маленьких ножниц.
  13. Поместите каждую открытую секцию под проточную воду и промойте все содержимое в сито 106 мкм, как описано в шаге 1.11.
  14. Откройте сердце и крупные кровеносные сосуды (легочные и аорты), трахею, мочевой и желчный пузыри и исследуйте содержимое таким же образом.
  15. Разрежьте и разрежьте твердые органы, такие как легкие, печень, почки, селезенка и поджелудочная железа, с помощью острого лезвия и щипцов. Промойте их под проточной водой на сите 106 мкм, как описано в шаге 1.11.
  16. Запишите типы обнаруженных паразитов, количество каждого типа и орган(ы), в котором они обнаружены. Методы фиксации и окрашивания перечислены ниже.
  17. Наклейте этикетки на флаконы/банки, положив туда небольшой кусочек простой индексной карточки, исписанный карандашом (чернила и линейчатые карточки будут «течь» в спирте и пачкать образцы).

2. Сохранение гельминтов

  1. Гельминтов, которых необходимо сохранить для последующих генетических исследований, помещают их непосредственно в 80-90% этанол (без глицерина). Этанол должен быть получен путем разбавления 95% этанола, предпочтительно реагентного качества (Таблица 1). Никогда не позволяйте этим образцам подвергаться воздействию формалина, так как формалин разрушает ДНК до непригодного для использования состояния.
  2. Поместите живые трематоды на предметное стекло микроскопа, опустите в каплю физиологического раствора, установите стеклянную крышку и пропустите предметное стекло над пламенем, не доводя до кипячения физиологического раствора.
    1. Опустите предметное стекло в чашку Петри, содержащую AFA (спирт-формалин-уксусная кислота, см. Таблицу 1) и дайте крышке отойти.
    2. Зафиксируйте в AFA от одного до нескольких дней, промойте водопроводной водой и переложите в стеклянные флаконы объемом 5 мл (или более крупные стеклянные флаконы/банки в зависимости от размера и количества паразитов), наполненные 70% этанолом для длительного хранения.
  3. Зафиксируйте мертвые трематоды в AFA или 10% буферизованном формалине на 48 часов, а затем переложите во флакон/банку, наполненную 70% этанолом, для длительного хранения.
  4. Расслабьте живых цестод в чашке Петри, облив их почти кипящей водой, а затем переложите в флакон/банку, наполненную 70% этанолом, для длительного хранения.
  5. Расслабьте живых акантовцефалов, поместив их в чашку Петри на один-несколько часов в воду из-под крана в холодильнике (~4 °C) до полного выведения хоботка (это может занять до 24 часов). Переложите во флакон/банку, наполненную 70% этанолом или AFA для длительного хранения.
  6. Относитесь к мертвым цестодам и акантоцефалам так же, как к мертвым трематодам (см. выше).
  7. Убейте живых, мелких (<5 мм) или хрупких нематод (например, трихостронгилид, капиллярид) в горячем (почти кипящем) 70% этаноле и храните во флаконе/банке, наполненном 70% этанолом с добавлением 5% глицерина (Таблица 1), чтобы сохранить червей в случае испарения.
  8. Убейте (и очистите) средние и крупные (>5 мм) нематоды (например, аскариды, спируриды, оксиуриды, филяриды), поместив в чашку Петри с холодной ледяной уксусной кислотой (Таблица 1) и через 15 минут переложите во флакон/банку, наполненную 70% этанолом и 5% глицерином. Уксусную кислоту можно использовать таким образом многократно.
  9. Поместите мертвых нематод прямо во флакон/банку, наполненную 70% этанолом и 5% глицерином.

3. Таксономическая идентификация гельминтов

  1. Приготовьте гематоксилин Харриса, растворив гематоксилин в спирте и растворив сульфат алюминия аммония в воде с помощью нагрева. Смешайте оба раствора и доведите до кипения.
    1. Добавьте йодат натрия и кипятите 2-3 мин. Процедите (фильтрующую бумагу 541) раствор после того, как он вернется к комнатной температуре.
  2. Перекрашивайте трематод, цестод и акантоцефаланов, оставляя их в разбавленном (1:10) гематоксилине Харриса или семихонском кармине на ночь (см. Таблицу 1).
    1. Удаляйте пятна с помощью этанола с 70% кислотой до тех пор, пока не станут видны органы (может занять от нескольких секунд до более часа, и за ним следует внимательно наблюдать).
    2. Остановите удаление пятен, переложив образцы на 70% основной этанол не менее чем на 30 минут. Затем обезвоживайте их в серии градуированных этанолов (80%, 95%, 100%) и очищайте их в ксилоле или метилсалицилате.
    3. Устанавливайте образцы на предметное стекло микроскопа после добавления капли канадского бальзама и покровного стекла. Дайте высохнуть на ночь.
  3. Мелкие и средние нематоды и акантоцефаланы в течение 15-30 мин во временных креплениях лактофенола на предметном стекле микроскопа с покровным стеклом.
    1. Используйте 80% фенол в течение 60 минут для крупных нематод (аскарид и спирурид) и акантоцефалов. Исследуйте под световым микроскопом (40-400X) для оценки более мелких структур (мужских спикул и крючков).
  4. Используйте следующие подходы для обследования специальных конструкций.
    1. Для цестод отрезают сколекс и помещают на предметное стекло микроскопа в лактофенол и «раздавливают» покровным листком для измерения и подсчета роззвездных крючков (см. рисунок 1Б).
    2. При нематодах отрежьте передний конец и установите анфас на предметное стекло микроскопа в несколько капель лактофенола (без покровного стекла) или в глицериновый желе для постоянного крепления (с покровным стеблем) и осмотрите ротовой аппарат под световым микроскопом (35-400X) (см. рисунок 1D).
    3. Отрежьте хвосты крупных нематод и установите на предметное стекло микроскопа в лактофеноле с покровным стеблем для наблюдения за вентральными сосочками и морфологией спикул самцов под световым микроскопом (см. рисунок 1D).
  5. Идентификация паразитов на виды, используя комбинацию первичной литературы и стандартных таксономических справочников, таких как:
    1. Trematodes: Yamaguti (1958, 1971)3,4 и Gibson et al. 5-7
    2. Акантоцефалы: Ямагути8
    3. Цестоды: Ямагути9, Шмидт10, Халил и др. 11
    4. Нематоды: Yamaguti12 и Anderson et al. 13

4. Хранилище гельминтов в Национальной коллекции паразитов США

  1. Депонирование образцов гельминтов в Национальную коллекцию паразитов США (USNPC). Это обязательно для большинства журналов о паразитах. После подачи в рукописи каждому виду гельминтов присваивается регистрационный номер для включения в рукописи.
  2. При сдаче образцов укажите следующую информацию: 1) Научное название паразита; 2) информация о хозяине (вид, координаты долготы/широты географического местоположения); 3) орган, найденный у хозяина; 4) наименование лица, собравшего образцы, и дата сбора; 5) тип используемого фиксирующего, морочного или очищающего/монтажного носителя; 6) местонахождение других коллекций (музейный номер и номер входа), если дополнительные экземпляры представлены в другом месте; и 7) информация об издании и журнале. Эти данные также должны быть отправлены вместе с образцами и в отдельной обложке.
  3. Упакуйте образцы в прочные контейнеры с ударопрочным поглощающим материалом. Скотч/парапленка закрутите крышки на стеклянные флаконы и поместите каждый флакон в отдельный полиэтиленовый пакет. Заверните слайды в бумагу и поместите в коробку для слайдов с амортизирующим материалом между ними.
  4. Отправляйте образцы и отдельное письмо с информацией об образцах по адресу: U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С использованием описанных выше методов в период с 2007 по 2011 год в округе Миссула, штат Монтана, было проведено исследование гельминтов серой землеройки, Sorex cinereus. Всего было отловлено 56 землероек с помощью ловчих ям, которые были обследованы в течение 2 ч после смерти. Общая распространенность инфекции составила 96%; только 2 землеройки оказались свободны от паразитов. Были идентифицированы пятнадцать видов гельминтов, включая 9 видов цестод и 6 видов нематод. Один вид цестод рода Staphylocystoide...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Выявить гельминтов-паразитов, даже до рода, на основании плохого материала, крайне сложно. Цестоды и трематоды, в частности, имеют тенденцию умирать и довольно быстро портиться после смерти хозяина. Таксономия цестод во многом зависит от количества, размера и формы розвездных крючков, которые часто теряются в замороженном материале. То же самое относится и к некоторым трематодам с шипами вокруг ротовой присоски, таким как эхиностомы и гетерофииды, которые также часто теряются. Из-за толстой кутикулы нематоды и акантоцефа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Джо Н. Коделла, биолога болезней из программы Indiana USDA APHIS Wildlife Services в Университете Пердью, за предоставление образцов, использованных для сбора гельминтов, для производства этого видео. Дженнифер Серафин приготовила все химические растворы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Фиксирующий
Спирт-формалин-уксусная кислота (АФК)Fisher ScientificA407-1 (этанол)
F75F-1GAL (формальдегид)
BP2401500 (ледяная уксусная кислота)		Этанол 85% (85 мл) + формальдегид 37% (10 мл) + ледяная уксусная кислота (5 мл)
Этанол для убийства и длительного храненияFisher ScientificA407-1Этанол 100% (70 мл) + дистиллированная вода (30 мл)
Этанол для фиксации и исследования ДНКFisher ScientificAC61511-0010Этанол 80-90% (80-90 мл) + дистиллированная вода (20-10 мл) соответственно
Формалин буферизованныйFisher ScientificSF100-4Формалин 10% (10 мл) + дистиллированная вода (90 мл)
Глицерин-спиртFisher ScientificA407-1 (этанол)
AC15365-1000
(глицерин)		Этанол 70% (95 мл) + глицерин (5 мл
)<сильно>Очистка, окрашивание и монтаж
этанол для обезвоживания при окрашиванииFisher ScientificA407-1Этанол 80%, 95%, 100% (80 мл, 95 мл, 100 мл) + дистиллированная вода (20 мл, 5 мл, 0 мл)
ЛактофенолFisher ScientificR400-27-Фенол
Fisher ScientificA931I-1 (фенол)
A407-1 (этанол)		Фенол 100% (80 мл) + этанол 100% (20 мл)
Harris' ГематоксилинFisher ScientificS25347 (гематоксилин)<бр/> А407-1 (этанол)<бр/> А567-500 (сульфат алюминия аммония) S25553 (йодат натрия)Гематоксилин (5 г) + этанол 100% (50 мл) + сульфат алюминия аммония (100 г) + йодат натрия (0,37 г) + дистиллированная вода (1 000 мл)  
Семичон s уксусный карминFisher ScientificBP2401500 (ледяная уксусная кислота)
S25236 (кармин)
A407-1 (этанол)Ледяная		уксусная кислота (100 мл) + кармин (1,5 г) + дистиллированная вода (100 мл). Нагреть на кипящей водяной бане 15 минут и остудить. Отфильтруйте для получения исходного раствора. Смешайте 1:2 с 70% спиртом для окрашивания.
XyleneFisher ScientificX4-4Используйте только под вытяжным шкафом для химических веществ.
МетилсалицилатFisher ScientificS25437-Этанол
основнойFisher ScientificA407-1 (этанол)
S25159A (концентрированный гидроксид аммония)		Этанол 70% (100 мл) + гидроксид аммония (0,1 мл)
Этанол кислотойFisher ScientificA407-1 (этанол)
SA9233-100 (соляная кислота)		Этанол 70% (99,5 мл) +  соляная кислота (0,5 мл)
Канадский бальзамFisher ScientificB10-100-

Ссылки

  1. Atkinson, C. T., Thomas, N. J. Parasitic Diseases of Wild Birds. Hunter, D. B. , John Wiley & Sons, Blackwell Press. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  2. Parasitic Diseases of Wild Mammals. Samuel, W. M., Pybus, M. J., Kocan, A. A. , Second Edition, Iowa State University Press. Ames, Iowa, USA. (2001).
  3. Yamaguti, S. Parts 1 and 2. The Digenetic Trematodes of Vertebrates. Systema Helminthum. I, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1958).
  4. Yamaguti, S. Synopsis of Digenetic Trematodes of Vertebrates. I and II, Keigaku Publishing Company. Tokyo, Japan. (1971).
  5. Gibson, D. I., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Trematoda. 1, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2002).
  6. Jones, A., Bray, R. A., Gibson, D. I. Keys to the Trematoda. 2, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2005).
  7. Bray, R. A., Gibson, D. I., Jones, A. Keys to the Trematoda. 3, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2008).
  8. Yamaguti, S. Acanthocephala of Vertebrates. Systema Helminthum. V, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1963).
  9. Yamaguti, S. The Cestodes of Vertebrates. Systema Helminthum. II, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1959).
  10. D, G. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. CRC Handbook of Tapeworm Identification. , CRC Press Inc. Boca Raton, Florida, USA. (1986).
  11. Khalil, L. F., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (1994).
  12. Yamaguti, S. The Nematodes of Vertebrates. Parts 1 and 2. Systema Helminthum. III, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1961).
  13. Anderson, R. C., Chabaud, A. G., Willmott, S. Keys to the Nematode Parasites of Vertebrates: Archival Volume (Nos). 1-10. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Гельминтами Сбор и определение от дикой природы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.