Методическая статья

Характеристики микрогелей полиэтиленгликоля, образующихся в осадке, контролируются молекулярной массой реагентов

11.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51002

⸱

23 декабря 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron, 2Saint Vincent Saint Mary's High School

В этой статье

Краткое содержание

Эта работа описывает образование микрогелей полиэтиленгликоля (ПЭГ) с помощью реакции фотополимеризованного осаждения. Увеличение молекулярной массы ПЭГ увеличивало диаметр микрогеля и коэффициент набухания. Исследуются простые адаптации к реакции осаждения микрогеля ПЭГ для будущего применения микрогелей в качестве средств доставки лекарств и каркасов тканевой инженерии.

Аннотация

Эта работа описывает образование микрогелей полиэтиленгликоля (ПЭГ) с помощью реакции фотополимеризованного осаждения. Реакции осаждения имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами изготовления микросфер. В отличие от эмульсионных, суспензионных и дисперсионных методов, микрогели, образованные осаждением, имеют однородную форму и размер, т.е. низкий индекс полидисперсности, без использования органических растворителей или стабилизаторов. Мягкие условия реакции осаждения, настраиваемые свойства микрогелей и низкая вязкость для инъекций делают их применимыми для целей in vivo. В отличие от других методов изготовления, характеристики микрогеля могут быть изменены путем изменения исходной молекулярной массы полимера. Увеличение исходной молекулярной массы ПЭГ увеличивало диаметр микрогеля и коэффициент набухания. Предлагаются дальнейшие модификации, такие как инкапсуляция молекул во время сшивки микрогелей. Изучаются простые адаптации к строительным блокам микрогеля ПЭГ для будущего применения микрогелей в качестве средств доставки лекарств и каркасов тканевой инженерии.

Введение

По определению, микрогели - это гидрогели любой формы с эквивалентным диаметром примерно 0,1-100мкм1. Благодаря своим размерам и характеристикам полимерные микрогели представляют собой универсальный инструмент для совершенствования систем доставки лекарств и тканевой инженерии. В то время как объемные гидрогели с большим успехом используются в качестве каркасов тканевой инженерии и средств доставки лекарств2-4, недавний переход к микромасштабному контролю скаффолдов предоставляет уникальную возможность использовать микрогели в качестве базовых материалов для строительных каркасов. Кроме того, микрогели имеют большое отношение площади поверхности к объему для клеточных взаимодействий и в растворе имеют низкую вязкость, что делает их идеальными для инъекций. Наконец, микрогели могут быть сформированы с использованием многочисленных полимеров различными методами в зависимости от желаемых характеристик микрогеля, что делает их легко настраиваемыми для различных применений.

Методы производства микрогелей включают суспензию, эмульсию, дисперсию или осаждение полимеризации. Для эмульсионной и суспензионной полимеризации обычно требуются органические растворители и поверхностно-активные вещества или стабилизаторы для формирования микрогелей. Характер этих методов позволяет получить высокодисперсное распределение частиц по размерам5. Реакции дисперсии и осаждения приводят к образованию частиц с более низкой полидисперсностью6; Однако частицы, образованные в результате дисперсионной полимеризации, по-прежнему требуют использования стабилизирующих агентов6. Микрогели, образующиеся в результате реакций осаждения, уникальны тем, что они образуют частицы однородного размера и формы без использования стабилизаторов или поверхностно-активных веществ. Образование микрогеля достигается при выращивании фазы полимерных цепей, отделенной от непрерывной фазы энтальпическим или энтропийным осаждением7. Осаждение полимеризации часто происходит при высоких температурах, которые могут быть снижены за счет использования космотрофных солей, которые снижают растворимость полимера в растворителе8. Эта работа посвящена микрогелям, полученным из полиэтиленгликоля (ПЭГ) в результате реакции фотополимеризованного осаждения в биологически совместимых условиях, с вариациями для изменения свойств микрогеля и инкапсуляции молекул для доставки лекарств.

Предыдущие исследования с гидрогелями PEG показывают, что условия полимеризации сильно влияют на физико-механические свойства гидрогелей, а именно на содержание воды в гидрогеле и модуль сжатия3,9. Эти сшитые материалы представляют интерес, потому что взаимосвязь между структурными и физическими свойствами, описанная в Flory10, может быть использована для адаптации сшитого гидрогеля к конкретным областям применения. Эти принципы схожи и для микрогелей. Было обнаружено, что микрогели ПЭГ, образующиеся в преципитации, обладают потенциалом для регенеративной медицины11, однако необходимы дальнейшие исследования свойств микрогеля для расширения их репертуара для будущих биомедицинских применений. В этом отчете описывается процедура изготовления микрогелей с помощью реакции осаждения и изменения характеристик, таких как диаметр микрочастиц, индекс полидисперсии (PDI), плотность и набухание, которые будут важны для дальнейшей разработки этих материалов для доставки лекарств или регенеративной медицины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка растворов для использования в производстве микрогелей

  1. Перед началом реакции осаждения внесите необходимые растворы и прогрейте их до 37 °С. Необходимые растворы включают 0,5% фотоинициатор, 1,5 М Na2SO4, буферный раствор, 200 мг/мл раствор ПЭГ-диакрилата (ПЭГ-DA) и 1 фосфатно-солевой буфер (PBS). Примечание: Акрилатируйте все прекурсоры ПЭГ в соответствии с опубликованными методами и храните при -20 °C под аргоном до использования12.
  2. Взвесьте фотоинициатор и растворите в деионизированном (DI) H2O до 0,5 (мас.)% раствора. Важно беречь раствор от воздействия ультрафиолетового излучения.
    1. После полного растворения профильтровать через фильтр 0,22 мкм. Этот раствор можно сделать заранее и хранить при температуре 4 °C в темноте. Примечание: Уменьшите время перемешивания примерно до 1 часа, нагревая раствор до 40 °C во время перемешивания.
  3. Для 1x PBS добавьте 1 таблетку PBS в 1 л DI H2O и отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм. PBS может быть изготовлен заранее и храниться при температуре 4 °C.
  4. Отмерьте 39,4 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, pH=7,4) и добавьте 612 μл триэтаноламина' (TEOA) и 260 μл 6 М соляной кислоты (HCl). Примечание: TEOA очень вязкий; предварительно нагрейте TEOA до 37 °C перед пипетированием.
    1. Отрегулируйте pH буфера так, чтобы он составлял примерно 7,7, и отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм (конечный pH ~ 7,8). Буферный раствор можно масштабировать, изготавливать заранее и хранить при температуре 37 °C.
  5. Каждый раз приготовьте раствор PEG-DA перед началом реакции; при хранении раствора наблюдается снижение реакционной способности. Взвесьте PEG-DA и добавьте буфер PBS/TEOA/HCl до конечной концентрации 200 мг/мл. Примечание: Добавляйте буфер медленно, чтобы тщательно контролировать концентрацию PEG><, поскольку PEG набухает в растворе. Примечание: Это решение обладает широкими возможностями настройки. Варианты персонализации микрогелей включают: изменение начальной молекулярной массы ПЭГ для изменения свойств микрогеля, использование разлагаемого предшественника ПЭГ для производства разлагаемых микрогелей, стерильную фильтрацию всех растворов для биологически стерильных микрогелей, завершение процесса формирования в ламинарном проточном колпаке и, наконец, добавление функциональных групп на поверхность путем включения их в раствор ПЭГ.
  6. Взвесьте Na2SO4 и растворите в DI H2O для получения 1,5 М раствора. Для достижения наилучших результатов раствор сульфата натрия также должен быть приготовлен непосредственно перед началом реакции.
    1. Нагрейте и переведите раствор до тех пор, пока Na2SO4 полностью не растворится. При необходимости профильтруйте через фильтр 0,22 мкм.

2. Производство микрогеля

  1. Поместите 127,5 мкл PBS/TEOA/HCl буфера, 10 мкл 0,5% фотоинициатора и 25 мкл 200 мг/мл раствора PEG в пробирки, где будут формироваться микрогели; обычно 2 мл микроцентрифужные пробирки.
    1. Нагрейте эти трубки вместе с раствором 1,5 M Na2SO4 до 37 °C.
    2. Перемешайте трубки во время нагревания. Примечание: Этот протокол микрогеля может быть масштабирован.
  2. Чтобы инкапсулировать молекулы в микрогели, добавьте нужную молекулу (например, овальбумин) в буфер PBS/TEOA/HCl, фотоинициатор и раствор ПЭГ. После сшивания молекула будет захвачена микрогелевой сетью.
  3. Завершайте каждую микрогелевую реакцию по одной. Возьмите первую пробирку и добавьте 87,5 мкл 1,5 М Na2SO4.
  4. Перемешайте пробирку с помощью пипетки 3-5 раз; либо подождите 30 секунд. После смешивания концентрация соли будет равномерно распределена и раствор должен быть прозрачным.
  5. Поместите трубку под ультрафиолетовый свет и сшивку на 30 секунд. После сшивки поверх раствора должен образоваться мутный слой, в котором находятся микрогели. Схема реакции приведена на рисунке 1.
  6. Добавьте 750 μl PBS для получения гранулы после центрифугирования и хорошо перемешайте.
  7. Промойте микрогели 5 раз, центрифугируя в течение 2 минут при 4 000 x g до образования гранул и заменив надосадочную жидкость на PBS. Примечание: Не тревожьте микрогелевую гранулу во время замены буфера, возможно, не удастся удалить всю надосадочную жидкость.

3. Размер и полидисперсность микрогеля

  1. Пипетка 30 мкл микрогелей из гранулы, образовавшейся в результате центрифугирования, в 1 мл DI H2O. Для достижения наилучших результатов ультразвуком обрабатывайте раствор микрогеля на водяной бане в течение 1 часа (50-60 Гц и 1,4 А) или энергично перемешайте, чтобы суспензировать микрогели.
  2. Нанесите пипеткой 15 μл микрогелевого раствора на чистое предметное стекло и наденьте сверху защитный стекло #1.5. Переверните предметное стекло и крышку, наденьте на лабораторную салфетку и нажмите на предметное стекло, чтобы удалить излишки раствора и убедиться, что микрогели находятся в одном слое.
  3. Сделайте несколько снимков микрогелей с помощью масляного объектива DIC 100X. Обычно на один образец делается 5 изображений, и рекомендуется 3 образца на партию, что в сумме составляет 15 изображений. Примечание: на сегодняшний день не наблюдалось никаких вариаций от партии к партии.
  4. Измерьте микрогели, чтобы получить репрезентативный диаметр.
  5. Рассчитайте PDI с помощью следующего объемного уравнения, в котором N — общее количество микрогелей, а Vi — объем микрогеля i.

4. Плотность микрогеля

  1. Приготовьте растворы декстрана 7, 6, 5, 4, 3 и 1 (мас.)% в DI H2O для определения плотности микрогелей. Эти плотности были рассчитаны как 1,022, 1,020, 1,018, 1,016, 1,014 и 1,010 г/см3 соответственно.
  2. Добавьте 1 мл 7% раствора декстрана в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
    1. Медленно внесите пипеткой 1 мл 6% раствора декстрана, чтобы образовать отчетливый слой поверх 7% декстрана.
    2. Подождите 5 минут, затем добавьте 1 мл 5% раствора.
    3. Продолжайте до тех пор, пока все растворы декстрана не будут расслоены в порядке убывания концентрации декстрана.
  3. Тщательно нанесите слой микрогелей поверх 1% раствора декстрана.
  4. Центрифугируйте градиент в течение 10 мин при 4000 x g и 5 °C. Положение микрогеля после центрифугирования позволило легко рассчитать плотность13.

5. Равновесное набухание микрогеля

  1. Чтобы измерить набухшую массу (Ms) микрогелей, определяемую как массу после равновесного набухания (48 часов), сначала промывают микрогели 5x в DI H2O и набухают в течение минимум 48 часов в предварительно взвешенных микроцентрифужных пробирках.
  2. Центрифугируйте микрогели в течение 10 мин при давлении 4 000 x г.
  3. Удалите всю надосадочную жидкость и запишите влажную массу. Используйте методы фильтрации, чтобы убедиться, что вся лишняя вода удалена для получения более точных результатов.
  4. Заморозьте микрогели при -80 °C, затем лиофилизируйте до постоянной массы для получения сухой массы (Md).
  5. Рассчитайте содержание воды в микрогелях по формуле % воды = (Ms - Md) / Md x 100.
  6. Определите содержание полимера по Полимер% = 100 - Вода% .
  7. Выполняйте статистический анализ всех данных с помощью SAS с n-way ANOVA и апостериорным тестом Тьюки. Различия отмечаются при p<0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Размер микрогеля зависит от условий полимеризации. На рисунке 2A показано, как диаметр микрогеля увеличивается при возрастании исходной молекулярной массы PEG и времени сшивания. Репрезентативные изображения микрогелей с различной молекулярной массой, подвергнутых сшиванию в течение 30 сек, используются для определения размера и представлены на рисунках 2C-G. Для PEG с молекулярной массой 3 000 Da средний диаметр микрогеля увеличился с 1,65±0,26 до 2,20±0,54 μm при увеличении времени УФ-...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Физические свойства микрогелей ПЭГ исследовали на предмет изменения условий полимеризации. Для этой реакции осаждения буферный раствор, 20% (масс./об.) раствор ПЭГ-диакрилата (MW 3000, 4600 или 6000 Да) и фотоинициатор смешивали и нагревали до 37 °C. Добавление 1,5 M Na2SO4, космотрофной соли, которая усиливает взаимодействие между молекулами воды, вызывало мгновенное осаждение ПЭГ при его добавлении. Этот эффект более заметен при более высокой молекулярной массе PEG8, что позволяет предп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Финансирование этого проекта осуществлялось через награду NSF CBET Award 1061834. Авторы выражают благодарность CIBA за образец фотоинициатора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатно-солевой буфер (PBS)MP Биомедицинский2810305
триэтаноламин (TEOA)J.T. Baker9468-01Разогреть до 37 °°; C перед пипетированием
Соляная кислота (HCl)BDH AristarBDH3028
Сульфат натрияJ.T. Baker3891-01
Irgacure 2959Ciba029891301PS04
Овальбумин (OVA)Invitrogen34782
PEG 1,500Alfa Aesar A16241
PEG 3,000Fluka03997-1KG
PEG 4,000Alfa AesarA16151
PEG 4,600Sigma373001-250G
PEG 6,000Fluka03394-1KG
PEG 10,000Alfa AesarB21955
Dextan 70TCID1449

Ссылки

  1. McNaught, A. D., Wilkinson, A. IUPAC Compendium of Chemical Terminology (The Gold Book). 2nd edn. , Blackwell Scientific Publications. (1997).
  2. Lu, S. X., Anseth, K. S. Release behavior of high molecular weight solutes from poly(ethylene glycol)-based degradable networks. Macromolecules. 33, 2509-2515 (2000).
  3. Peppas, N. A. Hydrogels in Medicine. 1, CRC Press, Inc. (1986).
  4. West, J. L., Hubbell, J. A. Photopolymerized hydrogel materials for drug delivery applications. React. Polym. 25, 139-147 (1995).
  5. Hunkeler, D., et al. Theories and Mechanism of Phase Transitions, Heterophase Polymerizations, Homopolymerization, Addition Polymerization. Advances in Polymer Science. 112, Springer. Berlin Heidelberg, Ch. 115-133 (1994).
  6. Arshady, R. Suspension, emulsion, and dispersion polymerization: A methodological survey. Colloid Polym. Sci. 270, 717-732 (1992).
  7. Bai, F., Yang, X. L., Huang, W. Q. Synthesis of narrow or monodisperse poly(divinylbenzene) microspheres by distillation-precipitation polymerization. Macromolecules. 37, 9746-9752 (2004).
  8. Bailey, F., Callard, R. W. Some properties of poly(ethylene oxide) in aqueous solution. J. Appl. Polym. Sci. 1, 56-62 (1959).
  9. Cruise, G. M., Scharp, D. S., Hubbell, J. A. Characterization of permeability and network structure of interfacially photopolymerized poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Biomaterials. 19, 1287-1294 (1998).
  10. Flory, P. Principles in Polymer Chemistry. , Cornell University Press. (1953).
  11. Flake, M. M., et al. Poly (ethylene glycol) microparticles produced by precipitation polymerization in aqueous solution. Biomacromolecules. 12, 844-850 (2011).
  12. Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. Bioerodible hydrogels based on photopolymerized poly(ethylene glycol)-co-poly(.alpha.-hydroxy acid) diacrylate macromers. Macromolecules. 26, 581-587 (1993).
  13. Scott, R. A., Elbert, D. L., Willits, R. K. Modular poly(ethylene glycol) scaffolds provide the ability to decouple the effects of stiffness and protein concentration on PC12 cells. Acta Biomaterialia. 7, 3841-3849 (2011).
  14. Ianeselli, L., et al. Protein-Protein Interactions in Ovalbumin Solutions Studied by Small-Angle Scattering: Effect of Ionic Strength and the Chemical Nature of Cations. J. Phys. Chem. B. 114, 3776-3783 (2010).
  15. Scott, R., Marquardt, L., Willits, R. K. Characterization of poly(ethylene glycol) gels with added collagen for neural tissue engineering. J. Biomed. Mater. Res. A.. 93, 817-823 (2010).
  16. Lin, H., Kai, T., Freeman, B. D., Kalakkunnath, S., Kalika, D. S. The Effect of Cross-Linking on Gas Permeability in Cross-Linked Poly(Ethylene Glycol Diacrylate). Macromolecules. 38, 8381-8393 (2005).
  17. Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. Release of protein from highly cross-;linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization. Biomaterials. 22, 929-941 (2001).
  18. Bryant, S. J., Anseth, K. S., Lee, D. A., Bader, D. L. Crosslinking density influences the morphology of chondrocytes photoencapsulated in PEG hydrogels during the application of compressive strain. J. Orthop. Res. 22, 1143-1149 (2004).
  19. Padmavathi, N. C., Chatterji, P. R. Structural Characteristics and Swelling Behavior of Poly(ethylene glycol) Diacrylate Hydrogels. Macromolecules. 29, 1976-1979 (1996).
  20. Ross, A. E., Tang, M. Y., Gemeinhart, R. A. Effects of molecular weight and loading on matrix metalloproteinase-2 mediated release from poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. AAPS J. 14, 482-490 (2012).
  21. Sun, G., Zhang, X. -Z., Chu, C. -C. Effect of the molecular weight of polyethylene glycol (PEG) on the properties of chitosan-PEG-poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. J. Materi. Sci. Mater. Med. 19, 2865-2872 (2008).
  22. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of Protein Release From Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 108, 197-206 (2011).
  23. Ruan, G., Feng, S. S. Preparation and characterization of poly(lactic acid)-poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid) (PLA-PEG-PLA) microspheres for controlled release of paclitaxel. Biomaterials. 24, 5037-5044 (2003).
  24. Loxley, A., Vincent, B. Equilibrium and kinetic aspects of the pH-dependent swelling of poly(2-vinylpyridine-co-styrene) microgels. Colloid Polym. Sci. 275, 1108-1114 (1997).
  25. Vivaldo-Lima, E., Wood, P. E., Hamielec, A. E., Penlidis, A. An updated review on suspension polymerization. Ind. Eng. Chem. Res. 36, 939-965 (1997).
  26. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs. Journal of Controlled Release. 5, 23-36 (1987).
  27. Matsumoto, A., Kitazawa, T., Murata, J., Horikiri, Y., Yamahara, H. A novel preparation method for PLGA microspheres using non-balogenated solvents. J. Controlled Release. 129, 223-227 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи