Методическая статья

Выделение корковых микроглии с сохранившимися иммунофенотипа и функциональности из мышиных новорожденных

DOI:

10.3791/51005

⸱

30 января 2014 г.

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из ключей к успешной расследования микроглии биологии является сохранение микроглии immunofunction экс естественных условиях в процессе выделения из ткани ЦНС. Изоляция микроглии через ротационным качанием результатов в высокочистых и immunofunctional клеточных культурах по оценке флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA после активации микроглии с провоспалительных стимулов липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение микроглии из ткани ЦНС является мощным исследовательским инструментом используется для изучения микроглии биологию экс естественных. Настоящий способ подробно процедуру для изоляции микроглии из неонатальных мышиных коры с помощью механического перемешивания с роторной качалке. Эта изоляция микроглии метод дает очень чистые корковых микроглии, которые проявляют морфологические и функциональные характеристики, указывающие на покоящихся микроглии в нормальных, непатологических условиях в естественных условиях. Эта процедура также сохраняет микроглии иммунофенотип и биохимический функциональность как показали индукции морфологических изменений, ядерной транслокации р65 субъединицы NF-kB (p65) и секреции чертой провоспалительных цитокинов, фактор некроза опухоли-α (ФНО-α ), на липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм) проблемы. Таким образом, настоящее процедура изоляции сохраняет иммунофенотип обоих покоя и мероприятияотключенной микроглии, обеспечивая экспериментальный метод исследования микроглии биологию в бывших естественных условиях условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки микроглии, макрофаги наблюдения паренхимы ЦНС, составляют около 12% от общего клеточной популяции взрослого мозга млекопитающих. Микроглия выводятся из желточного мешка миелоидных клеток-предшественников и различаются по плотности клеток и морфологии в различных cytoarchitectural регионов в взрослой ЦНС 1-5. В здоровом взрослом мозге, микроглии небольшие, разветвленные или полярные клетки с мелкими, динамических процессов. В отличие от периферической макрофагов морфологии, микроглии продемонстрировать покоя, низкопрофильный фенотип у здоровых мозгов, которые могут появиться как сотовый бездействия, однако в естественных условиях исследования изображений показывают, что микроглии процессы динамически расширить и убрать для контроля за их микросреду таким образом, напоминает " отбор проб и геодезия "6,7.

Микроглия высоко и дифференциально реагировать на окружающую среду и патофизиологических изменений в головном мозге, переключениеот Surveillant к государственным обычно рассматривается как их покоя и активированного государств эффекторных соответственно. Этот переключатель в активации может быть опосредованы рецепторами зацепления мембраносвязанных распознавания образов (PRRS), такие как платные-подобных рецепторов (TLR,), которые реагируют на патоген-ассоциированных молекулярных структур (PAMPs), а именно бактериальных и вирусных-производных липопротеинов , нуклеиновые кислоты, углеводы и 8-11. В дополнение к PAMPs, РРСС, также было показано, чтобы вызвать активации микроглии против стерильных непатогенных молекул, известных как опасность / повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPS), которые представляют собой возмущение в ЦНС гомеостаза, таких как повреждение клеток 12-16. После включения РРСС инициировать внутриклеточных каскад, который приводит к изменениям в микроглии морфологии клеток и генной экспрессии сигнализации, а именно, активированной микроглии адаптировать фенотип амебоидной-как, перемещать р65 NF-kB субъединицы (P65) в ядро ​​клетки, и активируют произвоводств и секреция провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкин-1 β (IL-1β), наряду с активными формами кислорода (АФК) 16-24. Хотя интеграл в врожденного иммунного ответа ЦНС, эти выделяемые молекулы также было обнаружено увеличение нейронов окислительный стресс, тем самым вызывая и обостряя нейродегенерацию в пораженных государств, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера 25-29.

Тем не менее, механизмы активации микроглии в патологических состояний полностью не выяснены. Таким образом, изоляция микроглии является мощным исследовательским инструментом в этих биологических процессов, так как многие в естественных особенностей активации микроглии может быть обобщены в культуре. Существует несколько методов для выделения микроглии, в том числе изоляции через градиентом Перколла следующие ферментативного переваривания ткани ЦНС 30,31. Тем не менее, ферментативное расщепление может изменитьиммунофенотип клеток путем снижения клеточной поверхности антиген выражение 32, и приводит к снижению выхода клеток на животное, чем методом, описанным в данном документе. В частности, мы сообщаем средний урожай микроглии за щенка коры 7,5 х 10 5 клеток, в то время как ранее сообщалось методы изоляции от всей ЦНС через Перколла градиента доходности 3-5 × 10 5 клеток 30,33,34. Настоящая процедура обходит использование пищеварения ферментов по изоляции микроглии на основе их свойств низкой приверженности, тем самым сохраняя микроглии иммунофенотип и функциональность.

В настоящем исследовании мы описывают выделение клеток микроглии из смешанных глиальных культурах, полученных из новорожденных гетерозиготных CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), и C57BL / 6 мышей коры через механическим перемешиванием на роторной качалке, расширение ранее опубликовал метод 24,35. Мы используем бывшего напряжение мыши для легкой визуализации микроглии, какэти мыши выразить GFP под контролем эндогенного локуса CX3CR1 - моноцитов-специфического промотора 36-38. Этот метод дает очень чистые микроглии культурами в консервированных иммунофенотипа исключая виво, как показано на морфологических изменений, ядерной транслокации р65 и секреции TNF-α, когда вызов с бактериальным липополисахаридом (ЛПС) или Pam 3 CSK 4, TLR4 и TLR1 / 2 агонистов , соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перед началом этого протокола, собирать новорожденных мышей в послеродовых дней 1-3 (Р1-3) в стерильный контейнер вложенных с оригинальным клетке подстилки для защиты и тепла. Важно работать быстро и эффективно через этот протокол, чтобы оптимизировать микроглии выход. Пожалуйста, см. таблицу 1 для полного списка реагента.

1. Подготовка инструментов, культурой, а блюда

  1. Подготовка 10 мл / щенка микроглии полной среде (MCM; 1x минимальной основной среде Эрла [MEM] дополнен: 1 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 0,6% объем / объем D-(+)-глюкозы, 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (P / S), 4% объем / объем фетальной сыворотки теленка (FBS), 6% об / об сыворотки лошади), а также добавить к каждой Т-75 колбу (1 колбу / детенышей); крышка и место горизонтально в инкубатор (37 ° С, 5% СО 2), чтобы уравновесить в течение 1 часа. Важно, чтобы уравновесить это средства массовой информации в колбе (ов), прежде чем начать вскрытие.
  2. Prepaповторно, аликвоту, и тепло в 37 ° С водяной бане MCM для вскрытия (6 мл / щенков) и в отдельном MCM коническую трубку для сотового ресуспендированием (2 мл / щенка). Подготовка, аликвоту, и охладить на льду Минсинг Media (HBSS мм; дополненной: 100 мкг / мл P / S, 0,01 М HEPES, 3 мл / детенышей) и рассечения информации (СД; MEM с добавлением 100 мкг / мл P / S; 2 мл / щенок).
  3. Стерилизация следующие хирургические инструменты погружением в 70% этаноле в течение 10 мин: ножницы # 1 (1; обезглавить), Forcep № 1 (2;, чтобы обеспечить нос и удалить кору), ножницы # 2 (1; nonangled; открыть головы ), Forcep № 2 (1; удалить кожу головы), Forcep № 3 (1; удалить череп), Forcep № 4 (2; удалить мозговые оболочки), ножниц № 3 (1; рубить ткани мозга). Дайте высохнуть на воздухе на стерильной площадку.
  4. Протрите горизонтально-воздушного потока рабочей станции и рассечение микроскоп с 70% этанола.
  5. Внесите DM на 2 стерильных, 100 мм чашки Петри для захвата голову (3 мл; 1 блюдо / 3 щенков) и рассечение (1 мл;1 блюдо / щенок, охлаждали на льду перед вскрытием). Внесите ММ в 1 стерильной, 100 мм чашки Петри для мясорубки ткани мозга (1 мл; 1 блюдо / щенка).

2. Мозговая ткань Рассечение

  1. До эвтаназии, мягко санировать шею и голову щенка с 70% этанола с помощью лабораторной ткани. С ножницами № 1, быстро усыпить щенка, удалив голову; захвата голову в предварительно подготовленную чашку Петри. Усыпить и завершить вскрытие одного щенка, прежде чем перейти к следующему животного.
  2. Перенести голову к охлажденному рассечение блюдо; под микроскопом рассечение обеспечить головой, зажимая нос, используя Forcep № 1 (в качестве альтернативы, головка может быть обеспечено путем прокалывания щипцы через глазницы), открытые головы с помощью ножниц № 2 путем создания Y-рез: начать от основания головы и под углом к ​​глазам. Используйте Forcep № 3, чтобы мягко удалить кожу головы пилинг с боков, обнажая череп.
  3. Использование Forcep № 3, аккуратно удалить соединительную ткань в основанииГлава. Когда база черепа подвергается, тщательно открытый череп, пронизывая одну руку из Forcep в между мозгом и черепом (после межполушарной щели); сцепление; осторожно потяните череп вверх, чтобы разорвать.
  4. Сорвать соединительную ткань под вентральной стороне мозга с помощью Forcep № 1, а затем удалить мозг, используя тот же инструмент. Поднимите мозг из черепа с помощью направленную вверх силу под вентральной стороне мозга.
  5. Держать мозг в анатомическом положении: спинной стороной вверх, чтобы визуализировать кору под микроскопом рассечение; обеспечить мозг на месте путем вставки кончики щипцов на пересечении среднего мозга и коре; полностью удалить корковых мозговых оболочек с Forcep # 4, затем приступить к удалению вентральной мозговые оболочки. После того, как мозговые оболочки были полностью удалены, отделить кору от остальной части мозга с помощью Forcep # 4. Важно, чтобы полностью удалить мозговых оболочек ткани, чтобы максимизировать чистоту микроглии и yielг.

3. Мозговая ткань Mincing

  1. Коре Переезд в предварительно приготовленный мясорубки блюдо; продолжать мясорубки шаг с использованием стерильной техники в класс II Кабинета биологической безопасности.
  2. Фарш мозговой ткани с помощью ножниц № 3; передача измельченной ткани в 15 мл коническую трубку;. Промыть ножницы и мясорубки блюдо с 1 мл ММ каждого, собирать и распределять полоскания в 15 мл коническую трубку с фарш ткани Этот шаг полоскания будет максимизировать выход микроглии, гарантируя, что весь остаточный ткань переносили в коническую пробирку. Оставьте тканевой суспензии в покое на 1-2 мин, что позволяет измельченной ткани, чтобы поселиться в нижней части трубы. Не превышать 2 мин, как ММ не содержит необходимые питательные вещества.
  3. Осторожно снимите и выбросьте 2 мл супернатанта с общей 1000 мкл микропипетки со стандартным наконечником пипетки, убедившись, что не нарушить устоявшуюся фарш-ткани.
  4. Добавьте 3 мл MCM к мясным-ткани; растирают ткани с полной силой с помощью универсального 1000 мкл микропипетки со стандартным наконечником пипетки без видимых твердых тканей не должно оставаться, когда растирание завершена.. Добавить еще 3 мл MCM с тем же наконечником пипетки, сбор остаточного растирают образца от кончика пипетки.

4. Растущие корковых клеток

  1. Центрифуга измельченной ткани для осаждения клеток (215 XG; 5 мин; РТ; клиническая центрифуга с Бакет ротор). Вернуться осажденные клетки к биологической безопасности кабинета, снимите и выбросьте супернатант; мягко ресуспендируют осадок клеток (2 мл / трубки; MCM); добавить клеток ресуспендирование к заранее подготовленной Т-75 колбу; довершение колбу и поместить его горизонтально в увлажненный, стандарт тканевой культуры инкубатор (37 ° С, 5% СО 2). Разрешить клетки инкубировать 24 часов.
  2. После 24 часов, слегка постучите колбу против ладони сорватьткани мусора. Проверьте клетки до и после нажатия, чтобы обеспечить полное удаление мусора. Набор колбу вертикали; удалить и выбросить информации; добавить свежий мкм до дна колбы (12 мл; 37 ° С); колпачок и поместить обратно в инкубатор, в горизонтальном направлении.
  3. Проверьте клетки ежедневно загрязнения и контролировать рост.
  4. В примерно 17-21 дней в пробирке (DIV), клетки микроглии будет готов для урожая от смешанного глиальных культуры. Чтобы определить, клетки готовы, изучения клеток под перевернутой фазе контрастного микроскопа. Микроглия готовы для сбора урожая, когда на ~ 40% слияния. Они появляются в виде небольших, ярких, сферических клеток, растет в виде монослоя на вершине другой глии.

5. Выделение микроглии из смешанного Glial культуры

  1. Для выделения микроглии, энергично нажмите колбу против лабораторном столе. Эта агитация помогает отдельные микроглии из других глиальных клеток в связи с низким уровнем приверженности свойств микроглии.
  2. Seal Т-75 колбы шапки с парафильмом и повернуть смешанные глиальных культур (200 оборотов в минуту; 37 ° С; 5 часов). помощью регулируемой температурой, nonhumidified ротационного шейкера Не позволяйте клетки пожать дольше 5 часов Осмотрите. что микроглии подняли с поверхности колбы после 5 часов, с использованием инвертированного фазового контрастного микроскопа. Микроглия яркие, сферической, свободно плавающего клетки. Там будет остаточный слой астроцитов и олигодендроцитов прилипших к нижней части колбы.
  3. Сбор Всплывшую среду, содержащую микроглии в стерильный конической трубки центрифуги; пеллетах микроглии (215 XG; 5 мин; Бакет ротор).
  4. Ресуспендируют микроглии осадок в теплой микроглии роста среды (MGM; MEM с добавлением: 1 пирувата мМ натрий, 0,6% об / vglucose 1 мм L-глутамина, 100 мкг / мл P / S, 5% об / об FBS; ~~~HEAD=iobj 2 мл / колбу), определить концентрацию клеток, используя гемоцитометра, и пластина 1 х 10 5 клеток / лунку в формате 24-луночного планшета напластик или стерильные скользит стекло крышка (500 мкл / лунку; MGM). Используя эту процедуру средняя урожайность микроглии составляет 7,5 х 10 5 клеток / щенок коры.
  5. 24-часовой пост-покрытие, удалить все средства массовой информации и подпитку клеток с пресной MGM (37 ° C) для удаления плавающих клеток и мусора. Этот шаг имеет решающее значение для выживания клеток и поддерживать покоящиеся микроглии. Клетки могут быть использованы для экспериментов сразу после повторной подачи.

6. Пример лечения

  1. Защиту клеток до 10 нг / мл Пам 3 ЦСК 4 (PAM), 10 нг / мл липополисахарида (LPS) или управления транспортным средством; инкубировать в течение 2 или 24 часов в увлажненном инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2).

7. Анализируя микроглии для функциональности Экс Vivo через иммунофлуоресцентный изображений и иммуноцитохимии

  1. После обработки культуральной среде урожай клеток в микроцентрифужные пробирки (1,5 мл) и CENTRifuge используя настольный микроцентрифужную (2 мин; 900 XG), чтобы очистить СМИ. Передача супернатант в чистую пробирке; анализ сразу, или хранить при температуре -20 ° С до использования. Анализ концентрации ФНО-α в надосадочной культуре клеток с помощью коммерчески доступных мыши TNF-α ИФА.
  2. Промыть клеток фосфатно-буферным раствором (PBS), и зафиксировать клетки с 4% (вес / объем) параформальдегида / 4% (вес / объем) сахарозы / PBS, рН 7,4 (4% PFA, 15 мин; RT). После фиксации, мыть клетки с PBS в течение 5 мин при осторожном встряхивании на орбитальном шейкере.
    1. Иммунофлуоресценции / Иммуноцитохимия. После фиксации и PBS мыть, обрабатывать микроглии для иммуноцитохимии. Все шаги, проведенные с осторожном встряхивании. Проницаемыми клеток в PBS с 0,1% Triton X-100; блок клеток в PBS/10% нормальной козьей сывороткой в ​​течение одного часа. Инкубируйте клетки O / N при 4 ° С с кроличьей анти-NF-kB антитела (субъединицы p65, 1/1, 250) или кролика против Iba-1 антитела (1/750) в блокирующем буфере. ВизуальныйИзе антиген: антитело после инкубации с флуоресцентно конъюгированного козьего антитела против кроличьего IgG вторичного антитела (1 час, 1/1, 000). Удаления несвязанного вторичное антитело промыванием PBS с 0,1% Triton X-100 (3x 5 мин).
    2. Счетчик пятна клеток с 4 ',6-диамидино-2-фенилиндол / PBS (DAPI, 0,1 мкг / мл). Визуализировать ядро клетки микроглии Все полученные из CX3CR1-GFP + / - мышей выразить GFP. Использование длины волны фильтра 350 нм для визуализации DAPI; длина волны фильтра 488 нм для визуализации GFP и длина волны фильтра 594 нм для визуализации P65 и МБА-1 Иммунокомплексы.
  3. Установить крышку скользит с использованием водного раствора Монтаж и визуализировать микроглии с помощью флуоресцентной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сохраняя иммунофенотип и функциональность микроглии экс естественных во время изоляции имеет решающее значение, чтобы иметь возможность использовать эти клетки в качестве следственного модели для микроглии биологии. Для того чтобы продемонстрировать успешное сохранение микроглии immunofunctionality помощью данного способа, мы выделили корковых микроглии с P3 новорожденных (CX3CR1-GFP + / - и C57BL / 6) и обработанных культур с либо ЛПС или Пэм.

Как показано на фиг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящая процедура предлагает эффективный способ выделения корковых микроглии от новорожденных мышей. Эта процедура имеет двукратное преимущество 1) сохранение микроглии иммунофенотипа и функциональности, как это определено флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA, и 2) что позволяет микроглии, чтобы созреть в присутствии других глиальных клеток (астроцитов и oligodentrocytes) до изоляция, которая может способствовать важные взаимодействия клетка-клетка в глиальных период культура созревания. Важно отметить,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что исследование было проведено в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношениях, которые могли бы быть истолкованы как потенциального конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIEHS R01ES014470 (КМЗ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ГлюкозаSigmaG8270Сделать 20% исходный раствор с водой MilliQ; фильтр стерилизовать; хранить при температуре 4 °Deg; C; Срок годности: 3-6 месяцев. Использовался для создания MCM и MGM.
Пируват натрия 100 мМ (100x)ГиклонSH30239.01Хранить при 4 °C. Используется для изготовления MCM и MGM.
Пенициллин/стрептомицин 10 000 единиц/мл (100x)Gibco15140-122Хранить при -20 °C. Используется для производства MCM, MGM, MM и DM.
L-глютамин 200 мМ (100x)Gibco25030-081Хранить при -20 °C. Используется для изготовления MCM и MGM.
Фетальная бычья сыворотка (определена)ГиклонSH30070.03Фильтр стерилизовать; хранить при -20 °C. Используется для изготовления MCM и MGM.
Минимальное содержание Medium Earle's (MEM)Cellgro15-010-CVбез L-глутамина. Содержит соли Эрла. Используется для создания MCM, MGM и DM.
Сыворотка для лошадейGibco16050Фильтр стерилизовать; хранить при -20 °C. Используется для изготовления MCM и MGM.
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS)Cellgro21-021-CVбез кальция и магния. Хранить при 4 °C. Используется для изготовления MM.
HEPES 1 MGibco15630-031Магазин при 4 °C. Использовался для изготовления MM.
T-75Колба Corning430641
4',6-диамидино-2-фенилиндол, дилактат (DAPI)InvitrogenD3571Используется для окрашивания ядра клетки.
Кролик анти-Iba1Wako019-19741Используется при разведении 1/750 для окрашивания ICC Iba1.
Кролик анти-NF&каппа; B (p65)Abcam7970Используется при разведении 1/1,250 для окрашивания ICC для p65.
Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA11012Используется в разведении 1/1000 для визуализации комплекса антиген:антитело в ICC.
10 мл Одноразовая серологическая пипеткаFisher Scientific13-678-11E
50 мл Одноразовая центрифужная пробиркаFisher Scientific05-539-8
15 мл Одноразовая центрифужная трубкаFisher Scientific05-539-12
Стерильный полистирол Чашка ПетриFisher Scientific875713100 мм x 15 мм
Ножницы: Прямой Метзембаум (ножницы #1)Roboz SurgicalRS-60101; 5 дюймов; используется для удаления головы
Ножницы: Vannas
(ножницы #2)		Fine Science Tools15000-081; неугловые; режущая кромка 2,5 мм; используются для раскрытия кожи головы
Ножницы: Student Vannas (ножницы #3)Fine Science Tools91501-091; изогнутые; используются для измельчения мозговой ткани
Щипцы: Dumont #7
(щипцы #1)		Fine Science Tools91197-002; Используется для фиксации носа и удаления коры головного мозга 
Щипцы: Dumont #2
(щипцы #2)		Fine Science Tools11223-201; используются для удаления скальпа
Щипцы: Dumont #3
(щипцы #3)		Fine Science Tools11231-301; используются для удаления черепа
Щипцы: Dumont #5a
(щипцы #4)		Fine Science Tools11253-211; используются для удаления мозговых оболочек
Table of Specific Equipment
Стерео диссекционный микроскоп Zoom Микроскоп OlympusSZ4060помещается в ламинарно-горизонтальный проточный
шкаф Ламинарно-горизонтальный проточный шкафNuaireNU-201-330
Шкаф биологической безопасностиLabconco3440001Класс II
Водяная рубашка CO2 ИнкубаторVWR97025-836Установлен на 37 градусов; C, 5% CO2
Swing-Out Bucket-out Bucket-outFisher Scientific75006441Для использования с поворотным ротором
Swing-out RotorFisherScientific 75006445Максимальный радиус: 19,2 (см)
Центрифуга Sorvall Legend RT+
(клиническая центрифуга)		Fisher Scientific75-004-377 С поворотно-откиднымротором
микроцентрифуга AccuSpin Micro 17
( настольная микроцентрифуга)		Fisher ScientificS98645с микролитровым ротором (24 x 1,5/2,0 мл; Кот #: 75003524)   

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
  3. Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
  4. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
  5. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
  6. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  8. Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
  9. Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
  10. Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
  11. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
  12. Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
  13. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  14. Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
  15. Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
  16. Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
  17. Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
  18. Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
  19. Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
  20. Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
  21. Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
  22. Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
  23. Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
  24. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
  25. Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
  26. Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
  27. Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
  28. Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
  29. Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
  30. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  31. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
  32. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
  33. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
  34. Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
  35. Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
  36. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  37. Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
  38. Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
  39. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
  40. Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cortical Microglia IsolationMicroglia ImmunophenotypeMurine NeonatesMechanical AgitationMixed Glial CulturesImmunofluorescence MicroscopyELISAMeningeal Tissue RemovalRotary ShakerCell Culture Plates

Похожие статьи