Одним из ключей к успешной расследования микроглии биологии является сохранение микроглии immunofunction экс естественных условиях в процессе выделения из ткани ЦНС. Изоляция микроглии через ротационным качанием результатов в высокочистых и immunofunctional клеточных культурах по оценке флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA после активации микроглии с провоспалительных стимулов липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение корковых микроглии с сохранившимися иммунофенотипа и функциональности из мышиных новорожденных
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Выделение микроглии из ткани ЦНС является мощным исследовательским инструментом используется для изучения микроглии биологию экс естественных. Настоящий способ подробно процедуру для изоляции микроглии из неонатальных мышиных коры с помощью механического перемешивания с роторной качалке. Эта изоляция микроглии метод дает очень чистые корковых микроглии, которые проявляют морфологические и функциональные характеристики, указывающие на покоящихся микроглии в нормальных, непатологических условиях в естественных условиях. Эта процедура также сохраняет микроглии иммунофенотип и биохимический функциональность как показали индукции морфологических изменений, ядерной транслокации р65 субъединицы NF-kB (p65) и секреции чертой провоспалительных цитокинов, фактор некроза опухоли-α (ФНО-α ), на липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм) проблемы. Таким образом, настоящее процедура изоляции сохраняет иммунофенотип обоих покоя и мероприятияотключенной микроглии, обеспечивая экспериментальный метод исследования микроглии биологию в бывших естественных условиях условиях.
Введение
Клетки микроглии, макрофаги наблюдения паренхимы ЦНС, составляют около 12% от общего клеточной популяции взрослого мозга млекопитающих. Микроглия выводятся из желточного мешка миелоидных клеток-предшественников и различаются по плотности клеток и морфологии в различных cytoarchitectural регионов в взрослой ЦНС 1-5. В здоровом взрослом мозге, микроглии небольшие, разветвленные или полярные клетки с мелкими, динамических процессов. В отличие от периферической макрофагов морфологии, микроглии продемонстрировать покоя, низкопрофильный фенотип у здоровых мозгов, которые могут появиться как сотовый бездействия, однако в естественных условиях исследовани....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Перед началом этого протокола, собирать новорожденных мышей в послеродовых дней 1-3 (Р1-3) в стерильный контейнер вложенных с оригинальным клетке подстилки для защиты и тепла. Важно работать быстро и эффективно через этот протокол, чтобы оптимизировать микроглии выход. Пожалуйста, см. таблицу 1 для полного списка реагента.
1. Подготовка инструментов, культурой, а блюда
- Подготовка 10 мл / щенка микроглии полной среде (MCM; 1x минимальной основной среде Эрла [MEM] дополнен: 1 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 0,6% объем / объем D-(+)-глюкозы, 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (P / S), 4% объем / объем ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сохраняя иммунофенотип и функциональность микроглии экс естественных во время изоляции имеет решающее значение, чтобы иметь возможность использовать эти клетки в качестве следственного модели для микроглии биологии. Для того чтобы продемонстрировать успешное сохранение микроглии immunofunctionality помощью данного способа, мы выделили корковых микроглии с P3 новорожденных (CX3CR1-GFP + / - и C57BL / 6) и обработанных культур с либо ЛПС или Пэм.
Как показано на фиг.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящая процедура предлагает эффективный способ выделения корковых микроглии от новорожденных мышей. Эта процедура имеет двукратное преимущество 1) сохранение микроглии иммунофенотипа и функциональности, как это определено флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA, и 2) что позволяет микроглии, чтобы созреть в присутствии других глиальных клеток (астроцитов и oligodentrocytes) до изоляция, которая может способствовать важные взаимодействия клетка-клетка в глиальных период культура созревания. Важно отметить,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что исследование было проведено в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношениях, которые могли бы быть истолкованы как потенциального конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIEHS R01ES014470 (КМЗ).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Глюкоза | Sigma | G8270 | Сделать 20% исходный раствор с водой MilliQ; фильтр стерилизовать; хранить при температуре 4 °Deg; C; Срок годности: 3-6 месяцев. Использовался для создания MCM и MGM. |
| Пируват натрия 100 мМ (100x) | Гиклон | SH30239.01 | Хранить при 4 °C. Используется для изготовления MCM и MGM. |
| Пенициллин/стрептомицин 10 000 единиц/мл (100x) | Gibco | 15140-122 | Хранить при -20 °C. Используется для производства MCM, MGM, MM и DM. |
| L-глютамин 200 мМ (100x) | Gibco | 25030-081 | Хранить при -20 °C. Используется для изготовления MCM и MGM. |
| Фетальная бычья сыворотка (определена) | Гиклон | SH30070.03 | Фильтр стерилизовать; хранить при -20 °C. Используется для изготовления MCM и MGM. |
| Минимальное содержание Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | без L-глутамина. Содержит соли Эрла. Используется для создания MCM, MGM и DM. |
| Сыворотка для лошадей | Gibco | 16050 | Фильтр стерилизовать; хранить при -20 °C. Используется для изготовления MCM и MGM. |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | без кальция и магния. Хранить при 4 °C. Используется для изготовления MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Магазин при 4 °C. Использовался для изготовления MM. |
| T-75 | Колба Corning | 430641 | |
| 4',6-диамидино-2-фенилиндол, дилактат (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Используется для окрашивания ядра клетки. |
| Кролик анти-Iba1 | Wako | 019-19741 | Используется при разведении 1/750 для окрашивания ICC Iba1. |
| Кролик анти-NF&каппа; B (p65) | Abcam | 7970 | Используется при разведении 1/1,250 для окрашивания ICC для p65. |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Используется в разведении 1/1000 для визуализации комплекса антиген:антитело в ICC. |
| 10 мл Одноразовая серологическая пипетка | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 мл Одноразовая центрифужная пробирка | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 мл Одноразовая центрифужная трубка | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Стерильный полистирол Чашка Петри | Fisher Scientific | 875713 | 100 мм x 15 мм |
| Ножницы: Прямой Метзембаум (ножницы #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 дюймов; используется для удаления головы |
| Ножницы: Vannas (ножницы #2) | Fine Science Tools | 15000-08 | 1; неугловые; режущая кромка 2,5 мм; используются для раскрытия кожи головы |
| Ножницы: Student Vannas (ножницы #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; изогнутые; используются для измельчения мозговой ткани |
| Щипцы: Dumont #7 (щипцы #1) | Fine Science Tools | 91197-00 | 2; Используется для фиксации носа и удаления коры головного мозга |
| Щипцы: Dumont #2 (щипцы #2) | Fine Science Tools | 11223-20 | 1; используются для удаления скальпа |
| Щипцы: Dumont #3 (щипцы #3) | Fine Science Tools | 11231-30 | 1; используются для удаления черепа |
| Щипцы: Dumont #5a (щипцы #4) | Fine Science Tools | 11253-21 | 1; используются для удаления мозговых оболочек |
| Table of Specific Equipment | |||
| Стерео диссекционный микроскоп Zoom | Микроскоп Olympus | SZ4060 | помещается в ламинарно-горизонтальный проточный |
| шкаф Ламинарно-горизонтальный проточный шкаф | Nuaire | NU-201-330 | |
| Шкаф биологической безопасности | Labconco | 3440001 | Класс II |
| Водяная рубашка CO2 Инкубатор | VWR | 97025-836 | Установлен на 37 градусов; C, 5% CO2 |
| Swing-Out Bucket-out Bucket-out | Fisher Scientific | 75006441 | Для использования с поворотным ротором |
| Swing-out Rotor | Fisher | Scientific 75006445 | Максимальный радиус: 19,2 (см) |
| Центрифуга Sorvall Legend RT+ (клиническая центрифуга) | Fisher Scientific | 75-004-377 С поворотно-откидным | ротором |
| микроцентрифуга AccuSpin Micro 17 ( настольная микроцентрифуга) | Fisher Scientific | S98645 | с микролитровым ротором (24 x 1,5/2,0 мл; Кот #: 75003524) |
Ссылки
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adul....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
