Методическая статья

Методы сбора молока для мышей и Ривза олень мунжтак

20.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51007

⸱

19 июля 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

В этой статье

Краткое содержание

Сбор молока из животных моделей облегчает различные направления исследований: понимание пассивного иммунитета, идентификацию патогенов, ответственных за вертикальную передачу, и, благодаря использованию трансгенных мышей, даже коммерческое производство белков, обнаруженных в грудном молоке человека. Здесь мы проиллюстрируем простой метод сбора молока у мышей и оленей мунтжака Ривза.

Аннотация

Животные модели обычно используются в исследовательских лабораториях для выполнения того, что обычно считается непрактичным в родном хозяине патогена. Сбор молока у животных дает ученым возможность изучать многие аспекты воспроизводства, включая вертикальную передачу, пассивный иммунитет, биологию молочных желез и лактацию. Получение достаточного объема молока для этих исследований является сложной задачей, особенно на моделях мелких животных. Здесь мы проиллюстрируем недорогой и простой метод сбора молока у мышей и оленей мунтжака Ривза, который не требует специализированного оборудования или обширной подготовки. Этот конкретный метод требует двух исследователей: один для сцеживания молока и стабилизации животного, а другой для сбора молока в соответствующую емкость либо от мунтжака, либо от мышиной модели. Модель мыши также требует использования пипетки P-200 и соответствующих наконечников для пипетки. Несмотря на то, что этот метод является недорогим и относительно простым в применении, исследователям следует знать, что для оптимального сбора молока требуется обезболивание животного.

Введение

Животные модели обеспечить понимание болезни патологии, которые не могут быть получены путем анализа ин витро. Для обеспечения наиболее эффективных результатов, важно использовать животную модель, которая тесно связана с болезнью и видов, представляющих интерес. Например, мунтжака в Ривза (Muntiacus reevesi), небольшой азиатские олени 1,2 и трансгенные мыши, экспрессирующие оленевых прионных белков (CerTgPrP) 3 являются полезными животных моделей для оленевых видов. Оба вида polyestrous, что позволяет круглый год разведение, и, следовательно, в соответствии источником для связанных с беременностью тканях и жидкостях для изучения конкретных механизмов в оленевых биологии. Исследования молока имеют широкий спектр приложений, которые являются более просто (и недорого), совершенных в животных моделях, чем у человека. Исследователи могли исследовать молоко и молозиво, как потенциального источника 1) инфекционного передачи болезни, 2) иммуноглобулины, переданные от матери к потомству в развитмат ветствующую защитную эк пассивного иммунитета 4 и 3) лактоферрина, белок, содержащийся в грудном молоке человека, участвующего в пассивного иммунитета, что исследователи в настоящее время пытается коммерчески производить 5.

Сбор значительное количество молока от мелких животных может оказаться трудной задачей. Роджерс был предложен подход для сбора молока от крыс 6, который впоследствии был использован в мышах. DePeters и Hovey предложены два способа сбора молока, один вручную с помощью вакуум-сгенерированный создаваемое каучук пипетки грушей на пипеткой Пастера и второй требующей строительство доильного аппарата, который затем прилагается к источнику вакуума (такие как кран) чтобы собрать мыши молоко 7. Здесь мы предлагаем простой, низкий затратный метод для сбора молока от мышей и Ривза олень мунжтак, что требует единственную имеющуюся лабораторного оборудования и основные технические навыки. Наш метод дает достаточные объемы молока для различныхприложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Мышь Доение протокол

Методы, описанные в этом протоколе были утверждены IACUC.

1. Разделение плотины от Offspring

  1. Выберите плотину, чтобы доить. Выберите плотина с помете 4 и более щенков, которая 8-12 дней после родов, чтобы обеспечить максимальное молоко коллекции хотя коллекция можно в любой момент времени после родов до 21 дней.
  2. Отделите плотину с ее помета, по крайней мере 2 часа перед доением.
    Примечание: В случае, если одно желание доить более одного плотину в данный период времени, это приемлемо для размещения разделенных плотин в одной клетке с достаточное питание и водоснабжение.

2. Администрация окситоцина, анестезии и глаз смазки

  1. Администрирование 2 МЕ / кг окситоцина внутрибрюшинно (IP). Окситоцин является гормоном, который действует на молочных железах кормящих женщин стимулирует высвобождение молока. Окситоцин можно приобрести фром ветеринар.
  2. Администрирование обезболивающий смеси, содержащей 80-100 мг / кг кетамина в комбинации с 5-10 мг / кг ксилазина IP. Например, в 10 мл основного анестетика смесь может быть подготовлен заранее для мышей весом около 30 г и будет включать 0,1 мл ксилазина, 8,9 мл H 2 O и 1,0 мл кетамина. 0,25 мл общее анестезирующее будет степенный мышь такого размера в течение примерно 20-30 мин, которая должна обеспечить достаточное время для сбора молока.
    Примечания: Чтобы определить, что животное было успешно наркозом, осторожно положите ее на живот на твердую поверхность; она не должна двигаться ноги или попытки подняться на ноги, если она полностью под наркозом. В случае мышь не полностью наркозом с исходной дозы, исследователь может управлять другой ¼ или ½ от первоначальной дозы анестетика смесь в зависимости от размера мыши и / или уровня седации, что мышь уже достиг . Тем не менее, это могло бы яncrease вероятность неблагоприятной реакции на анестезию, а также может привести к мышь будучи более глубоко под наркозом и / или под наркозом в течение более длительного периода времени.
    Примечание: Если доения более одного дамбу, необходимо, чтобы поразить окситоцин и анестезии инъекции в связи с коротким периодом полураспада окситоцина и время седации для кетамина и ксилазина.
  3. Нанесите небольшое количество смазки глаз к углу каждого глаза и распространяются для предотвращения глаза мыши от высыхания в то время как под наркозом.

3. Коллекция Молоко

Коллекция молоко наиболее легко осуществляется с двух исследователей: один исследователь провести наркозом мышь, вручную выражая молоко (именуемые R1) и один исследователь собирать молоко (R2). Этот метод также может быть выполнена с одним человеком, если мышь закреплен на плоской поверхности, чтобы избежать повреждений.

  1. R2 должны быть оборудованы стерильных колодки алкоголя приготовительные, пипс Р-200Etman, чистый наконечник пипетки для каждой мыши, и контейнер для хранения молока, такой как 1,5 мл пробирку Эппендорфа или 1,2 мл криопробирку (см. таблицу материалов).
  2. Как окситоцин начинает вступать в силу, молоко разочарование станет видимым в молочной области мыши (см. рисунок 1А). R1: Берем стерильный алкоголь подготовительную площадку и аккуратно протрите молочной площадь мыши, чтобы очистить площадь перед доением. Вручную выразить молоко из соска при помощи большим и указательным пальцами, чтобы массируют и отжать ткань молочной железы в движении вверх, пока шарик видно из молока не начинает формироваться на основании соска.
  3. Нажмите P-200 Pipetman поршень, чтобы его первой остановки, чтобы выпустить воздух из кончика пипетки и подготовиться к сбора молока.
  4. Поместите наконечник пипетки в верхней части капле молока и осторожно тянуть молоко в наконечником пипетки медленно выпуская давление на поршень. Будьте осторожны, не вставляйте конец слишком близко к соску или кожи (см.Фигура 1В). Это не обязательно, чтобы полностью освободить поршень, так как это будет тянуть молоко вплоть до верхней части кончика пипетки и будет трудно изгнать часто вязкой молоко в холдинговой контейнера.
  5. Выгнать молоко в контейнере с помощью большой палец, чтобы нажать на поршень мимо первой остановки (см. рисунок 1С). Чтобы облегчить изгнание небольших объемах, нажмите пипетки против стороне трубки так, чтобы жидкость не теряется.
  6. Продолжить вручную сцеживать молоко из каждого соска, двигаясь в любом направлении по часовой стрелке или против часовой стрелки, чтобы не пропускать любые соски. Это и приемлемым и полезным вернуться к и постоянно сцеживать молоко из той же соска, если она производит больше молока, чем другой.

4. Обезболивающий Восстановление в плотины

  1. В большинстве случаев, он является общим для плотина начать, чтобы начать просыпаться во время процесса доения. Если это не так, разместить плотину в CAGэ косвенно под источником тепла, например, подогревом циркулирующей одеяло, пока она не начинает просыпаться.
    Примечание: Как плотина начинает просыпаться, держать тщательное наблюдение ее деятельности, пока она не в состоянии идти о ее клетке на ее собственную.
  2. После того, как плотина движется по клетке без борьбы, поместите ее обратно в ее оригинальной клетки с ее помета. Нет болезненных ощущений не было по отношению к способности щенков ", чтобы кормить после сбора молока отметил.

2. Muntjac Доение протокол

Методы, описанные в этом протоколе были утверждены IACUC.

1. Разделение Doe от Offspring

  1. Выберите лань доить. Ривза олень мунжтак обычно рождают одного палевый 2. Молоко лань на следующий день после родов, чтобы позволить палевый возможность получить доступ к основных питательных веществ в молозиве 8.
    Примечание: палевый обычно скрывает и не появляется в течение прокedure; Разделение пары мать-потомок не является необходимым.

2. Администрация окситоцина, анестезии и глаз смазки

  1. Администрирование 10 МЕ / кг окситоцина внутримышечно (IM). Окситоцин является гормоном, который действует на молочных железах кормящих женщин, чтобы стимулировать ухудшением молока. Окситоцин можно приобрести от ветеринара.
  2. Администрирование анестетика BAM IM 11, содержащий буторфанола 0,45 мг / кг, azaperone 0,25 мг / кг, medetomadine 0,07 мг / кг. Одна доза анестетика смеси БАМ будет степенный в Muntjac примерно 20-30 мин, что обеспечивает достаточно времени для полного сбора молока. Еще один вариант для анестезии является мидазолам на 1-2 мг / кг, которая будет степенный в Muntjac примерно 10-15 мин. Хотя это обеспечивает достаточное время для сбора молока, это анестетик метаболизируется быстрее, чем BAM и животное может попытаться избежать в конце короткого периода времени.
    Примечание: Минимальный реакция на боль, Незначительные рефлексы при прикосновении уши, после чего способности R1 для удержания МДж без борьбы показывает, что животное было успешно наркозом.
    Примечание: В случае мунжтак не полностью наркозом с исходной дозы, исследователь может управлять другой ¼ или ½ от первоначальной дозы анестетика смеси в зависимости от размера животного и / или уровня седации, который уже был достигнуты. Тем не менее, это может увеличить вероятность неблагоприятной реакции на анестезию, а также может привести к мунтжака быть более глубоко под наркозом и / или под наркозом в течение более длительного периода времени.
  3. Нанесите небольшое количество смазки на углу каждого глаза и распространения, чтобы предотвратить глаза Muntjac от высыхания в то время как под наркозом.

3. Коллекция Молоко

Коллекция молоко наиболее легко осуществляется с двух исследователей; один исследователь провести наркозом Muntjac вколенях в то время как вручную выражая молоко (именуемые R1), и второй исследователь, чтобы держать голову Muntjac в удобной и безопасной позиции и собирать молоко (R2).

  1. В зависимости от анестетика, доения должна быть выполнена либо 1) в своих ручек, чтобы обеспечить безопасное место для них, если они просыпаются во время процедуры (мидазолам, вызванной) или 2) в постельных принадлежностей без прихожей поддерживать чистоту (БАМ- индуцированной).
  2. R1 и R2 должен быть оснащен этанола пропитанной марли и несколько 15 мл конические полипропиленовые пробирки, чтобы удерживать молоко.
  3. Как окситоцин начинает вступать в силу, молоко разочарование станет видимым в молочной площади Muntjac в. R1: Sanitize в перчатках руки и пальцы, а также весь вымени и сосков каждого отдельного животного с этанолом пропитанной марли. R2: Держите голову Muntjac в безопасном и удобном положении, чтобы обеспечить легкость дыхания и помочь предотвратить рубца срыгивание. Держите кл коллекция трубок OSE, чтобы соска доят, не касаясь его, чтобы предотвратить возможное загрязнение.
  4. Экспресс молока из одной соска с помощью большого и указательного пальцев, чтобы аккуратно сожмите ткань молочной железы в восходящем движении, пока сосок не наливается молоко, и аккуратно свернуть молоко из соска и в трубку, что R2 держит (см. рисунок 2 ).
  5. Примечание: молоко выходит в потоке, поэтому очень важно для R2 иметь набор трубка расположены так, что практически не будет молока впустую.
  6. Вымя в Muntjac делится на сектора. R1: Продолжайте сцеживать молоко из каждого квадранта, пока молоко больше не течет легко. Если молоко не может быть выражено с одного соска, выразить от всех других сосков, прежде чем вернуться к первой. Это и приемлемым и полезным вернуться к и постоянно сцеживать молоко из той же соска, если она производит больше молока, чем другой.

4. Обезболивающий Восстановление в Доу

т "> Она является общей для мидазолама, вызванной лань, чтобы начать просыпаться во время процесса доения. В большинстве случаев самка попытается сбежать, прежде чем все молоко было выражено. Малой сдержанность используется в целях повышения молоко Выход, однако безопасность и комфорт как для исследователей и самки одинаково важны.

  1. Администрирование атипамезол на 2,5 мг / мг medetomadine подкожно для быстрого разворота БАМа наркозом лань.
    Примечание: При обоих видах анестезии, необходимо поддерживать тесное наблюдение за самку, пока она не в состоянии идти самостоятельно, не спотыкаясь или падения, и в состоянии есть и пить, не опасаясь аспирации или удушья. Нет болезненных ощущений не было по отношению к способности палевый, чтобы медсестра после сбора молока отметил.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мышь

От наших экспериментах, мы определили, что можно собрать около 100-400 мкл молока от одной лабораторной мыши, в зависимости от нескольких переменных. Эти переменные включают в себя 1) количество времени, отведенных для сбора, 2) дозу окситоцина ведении, 3), сколько щенков плотина в настоящее время ухода и 4) количество времени после родов. Наши исследования показали, что наибольший выход получается, когда плотины отделены от их потомства, по крайней мере 2 ч, и по крайн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мышь

Есть несколько факторов, чтобы принять во внимание при сборе молока от мыши, в том числе 1) количество времени, отведенных для сбора, 2) дозу окситоцина вводили, 3), сколько щенков плотина в настоящее время ухода и 4) сумма времени, которое прошло с родов во время сбора. Использование предыдущие исследования в качестве руководства, мы приступаем к оптимизации условий для надоев.

Предыдущие исследования напрямую связана надои с плодовитостью ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эти эксперименты были профинансированы грантом NIH #RAI093634A. Мы выражаем огромную благодарность Дженни Пауэрс, доктору ветеринарных наук, доктору философии, за ее помощь в доении мунтжака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Материалы— Мышиный
кетамин (KetaVed 100 мг/мл) (доза: 80-100 мг/кг)MWI/Vedco011075
Ксилазин (TranquiVed 100 мг/мл) (доза: 5-10 мг/кг)MWI/VedcoNADA 139236
Глазная смазкаMWI/Apexa701013
окситоцин (2 МЕ/кг)Vet One501013
Материалы— Muntjac
Midazolam (1-2 мг/кг)Amerisource Bergen Drug Corp924326Опционально: исследователь может использовать Мидазолам как отдельно, так и комбинацию BAM в качестве анестетика
Буторфанола тартрат (Торгугезик) (0,45 мг/кг)Fort Dodge Animal HealthNADA 135-780
Азаперона тартрат (0,25 мг/кг)ZooPharm
Medetomadine HCl (0,07 мг/кг)ZooPharm
Антипамезола гидрохлорид (Антиседан) (доза: 0,25 мг/кг)Orion CorporationNADA 141-033
Окситоцин (10 МЕ/кг)Vet One501013
Оборудование— Мышь
P-200 PipetmanGilsonF123601
200μ l наконечники для пипетокLight LabsB-2004-SH
1 мл шприцыMWI005427
иглы 27 GMWI002031
Оборудование— Muntjac
15 мл конические тубыVWR21008-918
22 G иглыMWI873
3 мл люэровские шприцыMWI001377

Ссылки

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  7. Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

P 200

Похожие статьи