Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

15.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51021

⸱

23 января 2014 г.

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Это видео демонстрирует простой и надежный стратегию подготовки чистых культур эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга в течение 10-12 дней и будет полезна для исследования сосредоточены на многие аспекты мозговой ангиогенеза.

Аннотация

Эмбриональные мозг эндотелиальные клетки могут служить в качестве важного инструмента в изучении ангиогенеза и развития нервно-сосудистого и взаимодействий. Два сосудистые сети эмбрионального переднего мозга, мягкой мозговой оболочки и Перивентрикулярная, пространственно отличительные и имеют различное происхождение и динамику роста. Эндотелиальных клеток из мягкой мозговой оболочки и перивентрикулярных сосудистых сетей имеют уникальные профили экспрессии генов и функции. Здесь мы представляем шаг за шагом протокол для изоляции, культуры и проверки чистых популяций эндотелиальных клеток из перивентрикулярном сосудистой сети (PVECs) эмбрионального переднего мозга (конечный мозг). При таком подходе конечный мозг лишен пиальных мембраны, полученной из эмбриональных день 15 мышей фарш, расщепляли коллагеназы / диспазы, и диспергировали механически в суспензии отдельных клеток. PVECs очищают от клеточной суспензии с использованием позитивного выделение anti-CD-31/PECAM-1 антитела, конъюгированного с микросферы с помощью сильного магнитногометод разделения. Очищенные клетки культивируют на коллаген 1 покрытых чашек для культивирования в эндотелиальной клеточной культуральной среды, пока они не сливаться и далее субкультивировали. PVECs получены с этого протокола выставочная булыжник и шпинделя форме фенотипов, как визуализируется фазового контраста световой микроскопии и флуоресцентной микроскопии. Чистоту PVEC культур был создан с маркеров эндотелиальной клетки. В наших руках, этот метод надежно и последовательно дает чистые популяции PVECs. Этот протокол принесет пользу исследований, направленных на получение механистические понимание переднего мозга ангиогенеза, понимая PVEC взаимодействия и перекрестные переговоры с нейронных типов клеток и имеет огромный потенциал для терапевтического ангиогенеза.

Введение

Ангиогенеза, нейрогенез и миграция нейронов являются важнейшими событиями в центральной нервной системе (ЦНС) развития, восстановления и регенерации. Несколько элегантные исследования показали, что эндотелиальные клетки стимулируют пролиферацию нейронов и наоборот посредством выпуска растворимых факторов и при непосредственном контакте. Мы обнаружили, что любопытно, что в большинстве этих исследований 1-3, в то время как нейронные предшественниках / нервные стволовые клетки выделяют из эмбрионального мозга, они культивировали совместно с эндотелиальных клеток из мозга взрослого человека, других источников для взрослых тканей или с эндотелиальных клеточных линий. Это может быть частично из-за технических трудностей, связанных с ОД и культивирования чистые популяции эндотелиальных клеток из эмбриональных мозга. Однако, ангиогенез, нейрогенез и миграция нейронов являются одновременно события, происходящие в порядков более надежной в эмбриональном мозге, чем в нормальном взрослом мозге. Перивентрикулярная сосудистая сеть из embryoniс переднего мозга (конечный мозг) происходит от судна, расположенного в базальных ганглиев зачатка и развивается в виде упорядоченной градиентом от вентральной спинного конечного мозга на эмбриональный день 11 (Е11) 4,5. Это сплетение сосудов перивентрикулярном сосудистой сети отличаются от мягкой мозговой оболочки сосудов на основе происхождения, анатомического расположения, характер роста, и регулирование развития 4,5. Направление распространения перивентрикулярном ангиогенеза градиента соответствует конечного мозга поперечную нейрогенного градиент. В конечном мозге, перивентрикулярная ангиогенез градиент и градиент ГАМК нейронов мигрируют по касательной перекрывает пространственно, а 6. Что касается сроков, ангиогенез градиент в преддверии нейрогенного градиента и ГАМК нейронов градиентом примерно на сутки. Таким образом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки в пространстве и времени и возможности для предоставления критических сигналы для поддержки конечного мозга нейрогенез имиграции нейронов 4,6. Таким образом, использование эмбриональных перивентрикулярных эндотелиальных клеток в сокультивирования экспериментов с нейронных клеток-предшественников и / или нейронов обеспечит более благоприятные модель для изучения нейроваскулярные взаимодействия и разработки новых путей для лечения нейродегенеративных заболеваний или ишемического / черепно-мозговой травмой.

Мы подчеркиваем важность устранения пиальных мембрану, не только для ограничения загрязнения эпителиальных клеток, но и отделить пиальных эндотелиальные клетки, которые на молекулярном уровне и функционально отличается от эндотелиальных клеток перивентрикулярном сосудистой сети 4,6 (называемые PVECs отличить от пиальных ECS) . Здесь мы описываем метод, который мы обычно используем в нашей лаборатории, чтобы получить богатый и чистый выход PVECs. Эти эндотелиальные клетки получают из эмбриональных переднего мозга, выделенных из одного тайм-беременной мыши. Они могут быть расширены, субкультивировали, и замораживали успешно для использования в будущем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка реагентов и решения

  1. Покрытие 35 мм чашки для культивирования: Коллаген типа 1 раствор подается в виде водного раствора в 20 мМ уксусной кислоты (~ 100 мг белка / пробирку). Развести соответствующий объем раствора коллагена в рабочей концентрации 0,01% с использованием стерильной культуральной ткань класса воду. Coat блюда с 1 мл раствора коллагена в течение 3-4 ч при комнатной температуре (RT) или 37 ° С, или в течение ночи при 2-8 ° С. Удалите излишки раствора из чашки, покрытой и дайте ему высохнуть в течение ночи. Промойте блюдо с класса тканевой культуры водой или PBS перед добавлением СМИ. Покрытые блюда можно хранить при температуре 4 ° С в течение одного месяца.
  2. Подготовить всю Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM). Дополнение в DMEM (500 мл) с добавлением 10% FBS и антибиотиками противогрибковое раствора (концентрация 1x; 1 мл/100 мл). Полный DMEM можно хранить при температуре 4 ° С в течение двух месяцев.
  3. Подготовка аликвоту (50 мл) DMEM с ДНКазой I (0,001 мг / мл), (именуемые DMEM-ДНКазы I).
  4. Подготовка другой аликвоты (10 мл) в DMEM с коллагеназой и диспазы (1 мг / мл) (именуемые DMEM-collagenase/dispase).
  5. Подготовка эндотелиальных клеток культуральной среде (ECCM, 500 мл) с добавлением EGF (5 мкг), ECGS (100 мг) и 5 ​​мкл антибиотической-противогрибковое раствора. ECCM можно хранить при температуре 4 ° С в течение двух месяцев.
  6. Prewarm все средства массовой информации перед использованием.
  7. Получают буфер Очистка: PBS, рН 7,2 с 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА. Держите буфер холодной (2-8 ° С).

2. Удаление эмбрионов и Препарирование мозге

Все эксперименты с использованием лабораторных животных утверждаются по уходу за животными и использование комитетов больнице Маклина и соответствовать NIH принципов для ухода и использования лабораторных животных.

  1. Используйте приуроченные беременных мышей CD1 (эмбриональный день 15). День влагалища открытия плагина считается эмбриональных день 0 (E0). CD1 плотины обычно производят большие пометы, поэтому 10-12 эмбрионс, как ожидается, от беременной плотины.
  2. Для гистеротомии, анестезию беременных мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) / Ксилазина (5 мг / кг). Для мышей примерно 20-30 г, доставить 0,3 мл раствора анестетика 10 мл / кг кетамина / ксилазина и убедитесь, что боль и страдания минимальна во внутрибрюшинных инъекций анестетика. Используйте руки сдержанность для инъекций.
  3. Проверьте глубокого наркоза на носок крайнем случае. Удалить эмбрионы из глубоко под наркозом мышей. Обезглавьте каждый эмбрион сразу же после снятия с матерью. Поместите эмбриональных головы в стерильные чашки Петри в лед холодной PBS.
  4. Следуйте гистерэктомии путем немедленного эвтаназии с анестезиологической передозировки (130 мг / кг пентобарбитала, ф), способ эвтаназии, которая согласуется с AVMA принципов для эвтаназии животных: 2013 Edition.
  5. Под стереомикроскопом, удалить мозг из головы с мелкими ножницами микроострийных и тонких щипцов. Примечание: высокое качество рассекатьионный необходимо успешно удалить мягкой мозговой оболочки мембраны из эмбрионального мозга. Это достигается за счет практике. Изобразительное щипцы и микронаконечник ножницы также являются ключевыми инструментами для получения хорошего рассечение.
  6. Используйте пинцет, чтобы получить уверенный захват на мозг и микроострийных ножницами, чтобы очистить от мягкой мозговой оболочки мембраны. Снимите среднего мозга и задний мозг и изолировать конечного мозга. Трансфер пиальных без конечного мозга от всех эмбрионов в 35 мм культуры блюдо с 2 мл PBS в лед.

3. Выделение клеток

  1. Фарш конечного мозга в 1-2 фрагментов мм с лезвием скальпеля и собирать ткани в 15 мл Сокол пробирку, содержащую 2 мл полной DMEM.
  2. Диссоциируют ткани осторожно, но тщательно с 1 мл пипетки до сгустки не исчезнут и молочно подвеска достигается.
  3. Центрифуга диссоциирован клетки при 800-1000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок в DMEM-аз I. Аккуратно отделить сеLLS еще раз, используя 1 мл пипетки и центрифуги в 800-1000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре.
  5. Ресуспендируют гранул в теплой полной DMEM. Фильтр клетки через стерильный нейлоновое сито 70 мкм. Сбор отфильтрованные клетки и держать на льду.
  6. Соберите сотовых части нераспределенной на сетке и переварить далее с DMEM-collagenase/dispase (2 мл) в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки 3 раза в DMEM-ДНКазы I через центрифугирования при 800-1000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре. Бассейн эти клетки с отфильтрованным клеток, собранных на стадии 3.5. Вымойте всего клетки один раз с полной DMEM. Продолжать определить количество клеток и магнитные шаги маркировки. Примечание: Важно, чтобы получить один-клеточной суспензии перед магнитной маркировки.

4. Магнитный Маркировка

  1. Этот протокол показывает магнитный маркировки 10 7 клеток. Для количества клеток ниже 10 7, использовать тот же объем реагента и количества клеток больше, чем 10 7, расширить масштабы всех объемов реагентов и общие объемысоответственно (например, в течение 2 х 10 7 общего числа клеток, используйте удвоенного объема всех указанных реагентов). Держите все реагенты и клетки в лед.
  2. Определение количества клеток с гемоцитометре.
  3. Центрифуга клеточной суспензии при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант полностью.
  4. Добавить 90 мкл/10 7 клетки буфера очистки к осадку клеток после чего 10 мкл CD31 микрошарики. В микросферы, предоставляемые производителем сопряжены с моноклональными анти-CD31 мыши антитела.
  5. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин в холодильник. Примечание: Более высокие температуры и / или более длительное время инкубации во время магнитных маркировки может привести к неспецифическое связывание.
  6. Промыть клеток путем добавления 1-2 мл/10 7 клетки буфера очистки и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера очистке. Перейдите к магнитной сепарации или стадии очистки.

5. Пуrification

  1. Поместите колонку MS в магнитном поле MACS Сепаратор.
  2. Промыть колонку 500 мкл буфера очистки.
  3. Применение клеточной суспензии на колонку. Загрузите соответствующее количество клеток в колонну MS как большее число клеток может засорить столбец. Внимание: Каждый столбец MS может вместить максимальное количество 2 х 10 7 клеток, для большего числа клеток, используйте несколько столбцов.
  4. Соберите и выбросьте проточные, содержащий немеченые клетки.
  5. Промывной колонны с 500 мкл буфера очистки три раза. Во время промывания, убедитесь, что резервуар колонка пуста, прежде чем добавлять последующие буферных очистки аликвоты.
  6. Удалить столбец из сепаратора MACS и поместите его на 15 мл трубки Сокол.
  7. Плунжер подается вместе с колонки MS. Внесите 1 мл буфера очистки на колонку MS и сразу же избавиться от магнитно меченых клеток, крепко нажимая на поршень в колонну.
  8. Тарелка челлс на 35 мм чашку для культивирования, предварительно покрытый коллагеном типа 1 и расти клетки в ECCM в инкубатор на 37 ° С с 95% О2 и 5% CO 2.
  9. Изменение среды каждые четыре дня. Используйте PVECs для экспериментов или субкультуры через 10-12 дней, когда блюдо конфлюентно.

6. Субкультура PV ECS

  1. Снимите ECCM и промойте монослоя PVECS с 1-2 мл стерильного PBS.
  2. Осторожно добавьте 1,5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клеточный монослой.
  3. Верните чашку в инкубатор. В 5-7 мин, клетки будут отделяться от поверхности чашки.
  4. После того как клетки были отделены, сразу же добавить равный объем ингибитор трипсина и растереть несколько раз.
  5. Передача клеток в стерильную 15 мл сокола трубки. Центрифуга трубки при 500 х г в течение 5 мин.
  6. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл нагретого ECCM.
  7. Семенной клеток для расширения культуры, И. М.старения или другие анализы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Фенотипическое характеристика PVECs от дня 1-12 показана фазового контраста световой микроскопии (рис. 2). Клетки, прикрепленные к блюду на день 1 показать морфологии характеристики клеточного деления (рис. 2а). Между 5-8 дней, PVECs переход от булыжник на шпиндель образный морфологию, характерную для эндотелиальных клеток и больше похоже на его в естественных условиях состояние (рис. 2В и 2С). По 12-й день культуры PVEC достигает полного слиян...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

PVEC являются более физиологически актуальным, чем взрослых эндотелиальных клетках головного мозга и ЭК из других источников тканей для исследований, посвященных сосудисто-нервных взаимодействий, а также имеют терапевтический потенциал. Для подготовки PVEC, очень важно начало с рассечения работать быстро, чтобы добиться хорошего жизнеспособность, так как мертвые клетки могут связывать неспецифически к CD31 микросферы. Кроме того, если одной клеточной суспензии не достигается до магнитной маркировки шаг, это приведет к у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным альянсом по изучению шизофрении и депрессии (NARSAD) премия для молодых следователь и Национальных Институтов Здоровья предоставляют R01NS073635 к AV.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ДНКаза ISigmaD-4527 
Коллаген, раствор типа 1 из крысиного хвоста SigmaC3867 
DPBSQuality Biologics114057-131 
ЭДТАФишер СайентификM4055 
BSASigmaA2058 
Колонка МСМилтеньи Биотех130-042-201 
Микрогранулы CD31Miltenyi Biotech130-097-418 
Сепаратор MACSMiltenyi Biotech130-042-102 
Мультистенд MACSMiltenyi Biotech130-042-303 
Сетчатый фильтр 70 & микро; mBD Bioscience352350 
Антибиотик и антимикотический растворSigmaA5955 
FBSSigmaF4135 
Коллагеназа/диспазеРош10269638001 
DMEM Лонза12-604F 
35 мм Чашка для культурыBD Bioscience353001 
15 мл туба Falcon BD Bioscience352097 
50 мл пробирка FalconBD Bioscience352098 
Набор ECCMBD Bioscience355054Kit включает добавку для роста эндотелиальных клеток, EGF и ингибитор трипсина сои Добавка
роста эндотелиальных клеток (ECGS)BD Bioscience354006 
Применение ячеекRBECGMR819-500 
DMEM F12 Технологии Жизни10565-018 
GlutaMAXLife Technologies305050-061 
Культура тканей для водыLife Technologies15230162 
0,25% ТрипсинЛайф Технолоджис15050 
Ингибитор трипсина соиBD Bioscience5425 
MatrigelBD Bioscience354234 
Набор для маркировки клеток Qtracker 655Life TechnologiesQ25021 
Плазматическая мембрана CellLight-RFP, BacMam 2.0Life TechnologiesC10608 
Биотинилированное антитело к изолектину B4SigmaL2140 
Анти-фон Виллебранд факторSigmaF3520 
Anti-CD31/PECAM-1BD Pharmingen550274 
Монтажный материал VECTASHIELD с DAPIVector LaboratoriesH-1500 
Кетаминовыйбатлер Шайн Ветеринарный Снабжение44028 
КсилазинЛлойд Лаборатории1009 
СтереомикроскопМотикСМЗ-168 
ГемоцитометрFisher Scientific267110 
Инвертированный микроскопOlympus CK-40CK-40 
Флуоресцентный микроскопOlympus FSX-100FSX-100 
Тонкие щипцыRoboz Surgical Instrument7 inox 
Ножницы с тонким микронаконечникомRoboz Surgical InstrumentRS5611 
для

Ссылки

  1. Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  2. Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
  3. Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
  4. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
  5. Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
  6. Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
  7. Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
  8. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
  9. Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
  10. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  11. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD31
Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.