Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Флуоресценция

23.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51030

⸱

24 февраля 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Volcani Center, 2Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 3Department of Applied Sciences, Institute for Adriatic Crops and Karst Reclamation, 4The Institute of Plant Sciences, Volcani Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем здесь простой флуоресценции в гибридизация (FISH) метод локализации вирусов и бактерий в насекомых и растительных тканей. Этот протокол может быть продлен для визуализации мРНК в целом горе и срезах.

Аннотация

Флуоресценции в гибридизация (FISH) является имя, данное различными методами, обычно используемых для визуализации генных транскриптов в эукариотических клетках и могут быть дополнительно модифицированы, чтобы визуализировать другие компоненты в клетке, такие как инфекции с вирусами и бактериями. Пространственная локализация и визуализация вирусов и бактерий во время инфекционного процесса является важным шагом, который дополняет профилирование экспрессии эксперименты, такие как микрочипы и RNAseq в ответ на различные стимулы. Понимание пространственно-временных инфекции с этими агентами дополняет биологические эксперименты, направленные на понимание их взаимодействия с клеточными компонентами. Несколько методов для визуализации вирусы и бактерии, такие как системы гена-репортера или иммуногистохимических способов отнимают много времени, а некоторые ограничены работать с модельных организмов и включают сложные методики. РЫБЫ, что цели РНК или ДНК видов в клетке является относительно легко и быстро меняТПК для изучения пространственно-временной локализации генов и для диагностических целей. Этот метод может быть надежными и относительно легко реализовать, когда протоколы используют короткий гибридизации, коммерчески-приобретенные зондов, которые не являются дорогими. Это особенно надежной, когда пробоподготовка, фиксация, гибридизация и микроскопическая визуализация не связано с рядом сложных шагов. Здесь мы опишем протокол для локализации бактерий и вирусов в насекомых и растительных тканей. Метод основан на простого приготовления, фиксации и гибридизации насекомых тотальных препаратов и рассеченных органов или ручной частей установки, с 20 пар оснований короткие ДНК-зонды, конъюгированные с флуоресцентных красителей на их 5'-или 3'-концами. Этот протокол был успешно применен к ряду насекомых и растительных тканей, и могут быть использованы для анализа экспрессии мРНК или других РНК или ДНК видов в клетке.

Введение

При изучении взаимодействия между растительных вирусов и других патогенов с их зараженных растений хозяев, важно, чтобы визуализировать патогены и их соответствующих нуклеиновых кислот в месте, независимо ли они вызывать отрицательные эффекты на их хозяев. Это особенно важно при изучении движения патогена внутри и между клеток растений. В месте локализации генных продуктов возбудителя является важным шагом, который дополняет другие подходы к изучению процесса патогенности. Многие патогены растений, особенно вирусы, передаются насекомыми, имеющие сложные и интимные взаимодействия с их переносчиков. Локализация этих вирусов в их векторов имеет важное значение для изучения путь для передачи, а также возможные сайты взаимодействия внутри вектора. Передача некоторых вирусов растений насекомых-векторная оказывается помощь эндосимбиотических бактерий, которые проживают в пределах этих насекомых. Чтобы лучше изучить передачу этих вирусов растений бу их векторы, важно также, чтобы визуализировать эндосимбиотических бактерии в целом, и тех, кто участвует в передачи вируса, в частности. Колокализации вирусных и эндосимбиотических бактерий Таким образом, желательно за расследование возможных связей между этими организмами в пределах своей насекомых хозяина. Помимо передачи вируса, эндосимбиотических бактерии влияют несколько аспектов биологии насекомых-переносчиков, тем самым пространственная локализация этих бактерий в течение насекомых представляет большой интерес и важность.

Томатный желтый лист локон вирус (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) является наиболее важным вирусное заболевание комплекс культивируемых помидор по всему миру 1-4. TYLCV это вирус флоэмы ограниченной и исключительно векторением по белокрылки Bemisia tabaci 5,6. Предложена модель, описывающая транслокацию begomoviruses в их белокрылки векторов было предложено 6-9. Два конкретных барьеров активно перешли мажорING этот circulative передач: средняя кишка / гемолимфы и гемолимфы / слюнных желез барьеры. Этот процесс передачи Предполагается, посредничестве неизвестных рецепторов, которые распознают вирус капсида. TYLCV, как полагают, чтобы пересечь B. tabaci средней кишки 6,10, и поглощается через первичный слюнной железы 6, прежде чем он будет введен в растение. В белокрылки гемолимфы, TYLCV взаимодействует с белком GroEL производимого насекомых вторичного эндосимбиотических бактерии Hamiltonella. Это взаимодействие обеспечивает безопасную перевозку TYLCV в гемолимфе, и защищает его от нападения насекомых иммунной системы 11. Hamiltonella и Portiera, первичный эндосимбионта из белокрылки, размещены в bacteriocytes, клетки насекомых, найденные в гемолимфе и дом эндосимбиотических бактерий 11. B. tabaci таит дополнительные эндосимбиотических бактерий, включая риккетсий, Arsenophonus, Wolbachia и Фричаеа, который может быть локализован внутри или за пределами bacteriocytes, и имеют различные эффекты на биологии насекомого 12.

Несколько докладов пытались изучить локализацию TYLCV в растениях и белокрылки с помощью трудоемких и дорогостоящих протоколов, таких как просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), антител и РНК на месте на микроскопическом толщиной разделе 10,13, недавнее исследование описано локализацию растительных вирусов внутри их растений и векторных хозяев, используя простой протокол 14. Здесь мы опишем простой протокол для локализации TYLCV в B. tabaci расчлененный midguts и слюнных желез, и в разделах получены из TYLCV-инфицированных растений. Мы дополнительно описывают локализацию Portiera, первичной эндосимбионта из B. tabaci, и его вторичные эндосимбионты Hamitonella, риккетсии и Arsenophonus. Этот протокол основан на использовании коротких ДНК-зондов, которыефлуоресцентно меченый на их 5'-конце и специфической гибридизации с комплементарными последовательностями в вирусных или бактериальных последовательностей генов. Обработка образца относительно легко и сигнал, полученный высоко специфичен. Описанный протокол может быть использован для локализации вирусы, бактерии и другие патогены в их растений, животных и насекомых хозяев, и может быть дополнительно использован для локализации мРНК в той или иной ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Генеральный белокрылка, завод, и вирусов Подготовка к FISH анализа

  1. Задняя B и Q биотипа белокрылки на хлопковых рассады (Gossypium Hirsutum Л. резюме. Ачала) и поддержания внутри насекомых-доказательство клетках и комнат роста при стандартных условиях 25 ± 2 ° C, относительной влажности 60%, и 14-ч света / 10-ч темноты фотопериода.
  2. Выполните ПЦР для проверки инфекции с эндосимбионтов использованием эндосимбионта-специфических праймеров, как описано выше 15-19.
  3. Покупка рассады томатов (Solanum Esculentum резюме. Бифштекс) с коммерческой детской или семена томатов растений.
  4. Поддержание в тех же условиях, описанных выше выращивания растения, пока не будет достигнут четыре правда листьев этап, возраст наиболее подходящий для белокрылки-опосредованной инокуляции TYLCV 15 (см. раздел 4.1 ниже).

2. Насекомое Погрузка, фиксация, зонд Дизайн, Гибридизация, и Визуализация для Эндосимбионтом РЫБЫ

  1. Соберите 10 взрослых белокрылок стремлением от хлопчатника, или забрать 10 3-е или 4-е Instar нимф из листьев хлопчатника.
  2. Сразу погрузиться фиксатором Карнуа (хлороформ-этанол-ледяной уксусной кислоты, 6:03:01, объем / объем) внутри пробирки Эппендорф. Fix в течение 2 часов в течение ночи (желательно на ночь).
  3. Полностью удалите фиксатор и обесцветить в 6% H 2 O 2 в этаноле в течение 2 часов.
  4. Сохранение образцов в абсолютном этаноле в течение нескольких дней до нескольких недель при комнатной температуре, или перейти к следующему шагу.
  5. Дизайн зонды в качестве дополнительных обратных праймеров ДНК на основе 16S рибосомальной РНК-генов каждого бактерии. Для проектирования зондов, принять на счет те же соображения для разработки праймеров ПЦР. Используйте олигонуклеотидных зондов BTP1 5'-Су5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', Rb1 5'-Су3 TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', BTH 5'-Су3 CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'и Ars2 5'-cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'для конкретной адресности Portiera, риккетсий, Hamilonella и Arsenophonus соответственно.
  6. Гибридизации пробы течение ночи в темноте в гибридизации буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,9 М NaCl, 0,01% [вес / объем] додецилсульфата натрия, 30% [объем / объем] формамид), содержащей 10 пмоль флуоресцентного зонда на мл . Объединить более одного зонда с различными флуоресцентными красителями, если необходимо. Используйте неинфицированных белокрылок с целевым бактерии и образцов не-зонда в качестве отрицательных контролей.
  7. Установите образцы вся, на предметное стекло микроскопа, в гибридизации буфера, содержащейся с жидким блокатор, накрыть покровным, печать с лаком для ногтей, и вид под флуоресценции или конфокальной микроскопии.

3. Белокрылка Орган Рассечение, фиксация, Гибридизация, и Визуализация для TYLCV РЫБЫ

  1. Соберите взрослых белокрылок постоянно выращенных на TYLCV-инфицированных растений томата стремлением и анеsthetize воздействием бумажным полотенцем, пропитанной ацетоном. Expose белокрылок только в течение 1-2 мин, как слишком длительное воздействие ацетона можете исправить белокрылки тканей. Используйте nonviruliferous белокрылок выращенных на неинфицированных растений томата и никаких образцов зонд для контроля, чтобы подтвердить специфической гибридизации.
  2. Mount белокрылки на депрессии стекла микроскопа для органа вскрытия с помощью Стерео микроскоп.
  3. Потяните прочь насекомых голову от переднегруди и анализировать слюнных желез в 1x PBS с добавлением 1% толуидиновым синевы для лучшей визуализации, из-за их малого размера. Разрешить поглощение пятно в течение 2-3 мин.
  4. Потяните насекомое друг от друга на стыке между грудной клетки и брюшной полости, чтобы наблюдать и изгнать из в кишки. Выгнать содержимое брюшной полости, нажав щипцами на животе чаевых.
  5. Аккуратно снимите PBS и толуидиновым синим от успешных вскрытий и осторожно добавить 300 мкл фиксатором Карнуа исправить органы в течение 5 мин.
  6. дд фиксатором с одной стороны депрессивного скважины, а не сверху, чтобы предотвратить неконтролируемое движение рассеченных органов. После прикосновения к фиксатором, органы будут придерживаться к стеклу, и на протяжении всего процесса они не будут двигаться.
  7. Удалить фиксатор и добавить 500 мкл буфера для гибридизации с добавлением 10 пмоль флуоресцентного зонда ДНК Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', которая является комплементарной последовательности в геном белка оболочки TYLCV.
  8. Гибридизации на ночь при комнатной температуре в темноте путем инкубации слайда с образцом внутри небольшой влажной камере, состоящей из небольшой пластиковой коробке с мокрым бумажным полотенцем внизу.
  9. После гибридизации, забрать органы с тонкой инструмента рассечение и быстро переместить их в свежем стекло микроскопа, содержащего 30 мкл новый буфер гибридизации с добавкой DAPI (0,1 мг / мл в 1x PBS) и содержащиеся жидким блокатора.
  10. Покройте образцы с покровным, печать остроумиеч лак для ногтей и вид под флуоресценции или конфокальной микроскопии.

4. Обращение завод, ручной секционирования, фиксация и Гибридизация для TYLCV РЫБЫ

  1. Привить рассады томатов с TYLCV помощью содержащий вирус белокрылки опосредованного прививку. Вирус может быть обнаружен с помощью этого метода FISH в бессимптомно растений через неделю после прививки. Симптомы Типичные болезни могут видеть три недели после прививки. Используйте неинфицированных растений томата и никаких образцов датчиков для контроля, чтобы подтвердить специфической гибридизации.
  2. Используйте острый гистологическое лезвие для подготовки вручную вырезать 2-4 см длинные продольные или поперечные сечения помидор стебли и листья.
  3. В пробирки Эппендорфа, исправить секции фиксатором Карнуа в течение 2 ч в течение ночи при комнатной температуре.
  4. Удалить фиксатор и сохранить разделы в абсолютном этаноле в течение нескольких дней до нескольких недель при комнатной температуре, или перейти к следующему шагу.
  5. Вымойте разделытри раза, 1 мин каждый, в гибридизации буфера.
  6. Гибридизуются секции с 500 мкл буфера для гибридизации с добавлением 10 пмоль флуоресцентного олигонуклеотидного зонда Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', которая является комплементарной последовательности в геном белка оболочки TYLCV.
  7. Вымойте секций в три раза, 1 мин каждый, в гибридизации буфера.
  8. Разделы Mount целые в гибридизации буфера с добавлением DAPI (0,1 мг / мл в 1x PBS) и содержащиеся жидким блокатор, накрыть покровным, печать с лаком для ногтей и видом под флуоресценции или конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Система учился в этой рукописи показано на рисунке 1 и включает зараженный растение с TYLCV, взрослый и нимфу белокрылки B. tabaci, а внутренняя анатомия белокрылки, показывая путь к TYLCV транслокации в насекомое. Рисунок 2 показывает двойной рыбы во взрослой белокрылки для первичной симбионта Portiera и вторичной симбионта Arsenophonus. Рисунок 3 показывает двойной рыбы для Portiera и Hamiltonella, и Рисунок 4

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь для локализации вируса растений в ее растения-хозяина и вектора насекомых, и эндосимбиотических бактерий в их конкретном узле белокрылки, могут быть адаптированы для локализации других вирусов в растениях и даже в животных тканях. Кроме того, протокол может быть использован для локализации эндосимбиотических и патогенные бактерии и другие микроорганизмы в растительных и животных систем. Описанные методы основаны на простой концепции гибридизации между короткой, флуоресцентно-меченного олигонукл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

не Исследования в лаборатории Ганим поддержали исследовательского гранта не. 908-42.12/2006 от немецко-израильского фонда (МФП), грант №. IS-4062-07 от Соединенных Штатов-Израиль Двусторонней сельскохозяйственных исследований и развития фонда (бард), и исследовательский грант не. 884/07 от Израиля Science Foundation (ISF), чтобы МГ

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Флуоресцентная маркировка  ЗондыMetabion20 bp ВЭЖХ очищенныеПоследовательность разработана заказчиком
Толуидин синийSigma-Aldrich89640
Додецилсульфат натрияSigma-AldrichL3771Молекулярная биология
Класс ФормамидSigma-AldrichF9037Молекулярная биология Класс
Tris-HClSigma-AldrichT5941Молекулярная биология Класс
Ледяная уксусная кислотаСигма-Олдрич320099Молекулярная биология
ГидроблокаторТед Пелла Инк.No 22309
класса

Ссылки

  1. Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
  2. Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
  3. Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
  4. Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
  5. Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
  6. Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
  7. Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
  8. Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
  9. Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
  10. Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
  11. Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
  12. Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
  13. Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
  14. Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
  15. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
  16. Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
  17. Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
  18. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
  19. Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in situFISH
Флуоресценция
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.