Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутрилимфатическое иммунотерапия и вакцинации у мышей

22.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51031

⸱

2 февраля 2014 г.

 , 
1Department of Dermatology, University Hospital Zurich

В этой статье

Краткое содержание

Профилактическая и терапевтическая вакцинация часто не удается стимулировать сильный иммунный ответ за счет неделе дренажа вакцины в лимфатические узлы и, следовательно, плохой участие иммунных клеток. Прямым инъекции вакцины к лимфоузлах так называемый внутрилимфатическое инъекция эффективность вакцины можно сильно улучшены и доз вакцины можно уменьшить.

Аннотация

Вакцины обычно вводят подкожно или внутримышечно для стимуляции иммунного ответа. Успех это требует эффективного дренажа вакцины к лимфатическим узлам, где антиген представляющие клетки могут взаимодействовать с лимфоцитами для генерации хотели иммунных реакций. Сила и тип иммунных реакций, индуцируемых также зависит от плотности или частоты взаимодействий, а также микросреды, особенно содержания цитокинов. Как только минуту доля периферии введенных вакцин достигает лимфатических узлов, вакцинация мышей и людей проводились путем прямой инъекции вакцины в паховых лимфатических узлов, то есть внутрилимфатическое инъекции. В человеке, процедура руководствуется ультразвука. У мышей, небольшой (5-10 мм) надрез в паховой области анестезированных животных, лимфатический узел локализуется и иммобилизованных пинцетом, а объем 10-20 мкл вакцины вводят под визуальным контролем.Разрез закрывается с помощью одного стежка с помощью хирургических швов. Мыши были вакцинированы с плазмидной ДНК, РНК пептида, белка, частиц и бактерий, а также в качестве адъювантов, и наблюдалось сильное повышение иммунных реакций против всех типов вакцин. Внутрилимфатическое метод вакцинации особенно подходит в ситуациях, когда обычные вакцинация вырабатывает недостаточное иммунитет или где количество доступной вакцины ограничено.

Введение

Вакцины обычно вводят подкожно или внутримышечно для стимуляции иммунного ответа. Успех этой процедуры требует эффективного дренажа вакцины в лимфатические узлы, где антиген представляющие клетки могут взаимодействовать с лимфоцитами для генерации Т-и ответов B-клеток. Кроме того, прочность и тип иммунных реакций, индуцируемых также зависит от плотности или частоты таких взаимодействий, так как сама микросреды, особенно содержания цитокинов. Как только небольшая часть вакцины вводят в периферийной ткани достигает лимфатического узла, прививки мышей и человека путем прямой инъекции вакцины в лимфатических узлах, сайт иммунные ответы были сгенерированы, были выполнены. В человеке, процедура руководствуется ультразвука, процедура также используется для управления изображениями агентов для визуализации и диагностики в лимфатическую систему. У мышей, процедура является инвазивным. Здесь небольшой (5-10 мм) incisioн выполнен в паховой области анестезированных животных 1, лимфатических узлов локализован и иммобилизованных пинцетом, а объем 10-20 мкл вакцины вводят под визуальным контролем; 10 мкл используется для первой инъекции и у молодых мышей с небольшими лимфатических узлов, тогда как 20 мкл может быть введен в лимфатических узлах старшего возраста или уже грунтованные мышей, которые имеют большие лимфатические узлы. Разрез может быть закрыт с помощью одного стежка с помощью хирургических швов. С помощью этого метода, мышей, вакцинированных ДНК плазмиды, 2,3 РНК 4, 1,3,5,6 пептида, белка 7-10 частиц, бактерий 11 12, а в качестве адъювантов 7,13 и сильного улучшения иммунной ответы против всех типов вакцин были обнаружены. Внутрилимфатическое метод вакцинации особенно подходит в ситуациях, когда обычные вакцинация вырабатывает недостаточное иммунитет или где количество доступной вакцины ограничено или веру дорогостоящим. У человека, внутрилимфатическое способ иммунизации был применен к аллергии пациентов 14,15, или пациентов с раком 16-21. Хотя в настоящее время понятие является то, что внутрилимфатическое метод является более инвазивными, чем других инъекционных методов, таких как внутримышечных и подкожных инъекций, восприятие боли не выше, чем после венозной пункции 15. Ожидается, что внутрилимфатическое вакцинация станет альтернативой или дополнением к другим методам профилактики и особенно лечебных прививок. Эта статья подробно описывает, как процедура внутрилимфатическое вакцинации, проведенных в мышей. Все процедуры, описанные, были утверждены кантона ветеринарной агентства Цюриха и осуществляется в соответствии швейцарских федеральных руководящих принципов и директив по защите животных, используемых для научных целей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Анестезия мышей

  1. Подготовьте анестетики, смешивая кетамин (диссоциативной обезболивающий) и ксилазина (седативное и обезболивающее) в буферном растворе. Концентрации кетамина и ксилазина в конечном растворе 12,5 и 2 мг / мл, соответственно.
  2. Введите анестетиков в мышах путем внутрибрюшинного введения с помощью шприца с 25-30 г иглы. С помощью 0,1 мл/10 г массы тела.
  3. Нанести глазной мази для глаз мышами в целях предотвращения высыхания роговицы.
  4. Убедите, что мышь достаточно наркозом, зажимая его ногу или палец с пинцетом. Если мышь не реагирует с рефлексами на крайнем случае, перейти к операции. Если мышь реагирует на крайнем с рефлексами или мышечных сокращений, подождите 1-2 мин и повторите тест щепотку. Если мышь все еще реагирует, заменить мышь с новой животного и повторите процедуру, начиная с шага 1.2 года.

2. Хирургическое Яncision из паховой области от Mouse

  1. Наведите мышь на спине.
  2. Смочите один паховой области с дезинфицирующей этанола (70%). Для обеспечения лучшей дезинфекции, паховая область может быть побрился для удаления шерсти предварительное обеззараживание этанолом.
  3. Возьмите задней ноги согнуть тазобедренный сустав производить примерно 90 ° угол тазобедренного сустава.
  4. Использование изогнутой microdissecting щипцов, взять кожу мыши в паховой области, где тазобедренный сустав сгибается и тянуть через увлажненную кожу слегка.
  5. Удерживая кожу с пинцетом, вырезать небольшой разрез (<5 мм) через кожу с помощью хирургические ножницы.
  6. Поместите кончик закрытых ножниц в разрез и далее открыть разрез, открыв ножницы, удерживая ее внутри разреза. Это приведет к тому кожу к разрыву и должна производить диаметр менее 10 мм. Примечание: холодный источник света с гибкого световода может быть использован для улучшения видимости. В более старыхмышей, особенно мужчины, идентификация лимфатического узла может быть затруднено из-за большого количества жировой ткани в паховой области.

3. Внутрилимфатическое впрыска

  1. Подготовка шприца (0,5 мл или меньше) с 28-30 G иглы для подкожных инъекций; короткий скос может быть предпочтительным длительного фаски. Аспирируйте 10 мкл вакцины, который будет введен и заверить, что шприц не осталось воздуха.
  2. Локализация паховых лимфатических узла с помощью изогнутых щипцов и кончиком закрытом ножницами. Лимфатических узлов появится серовато в более белесой жировой ткани и может быть дополнительно определены с помощью афферентных и эфферентных капилляров входящих и выходящих из лимфатических узлов.
  3. Остановите лимфатический узел, держа ее между ветвями изогнутых щипцов.
  4. Возьмите шприц и введите иглу в лимфатического узла с фаской, стоящих до; убедившись, что вся коническая входит в лимфатический узел.
  5. Инъекция вакцины (10 мкл). Если лимфа кивоке отек (взорвав), инъекции можно предположить, успешным. Если игла не размещен достаточно глубоко в лимфатическом узле, некоторые или все Вакцина может просочиться и не ввести лимфатический узел. Если игла вставлена ​​слишком глубоко, вводили вакцину выйдет подкожно ниже лимфатического узла. В последнем случае, повторите инъекцию или заменить мышь с новым необработанной мыши.

4. Закрытие Разрез наложением швов

  1. Откройте пачку стерильного хирургического шва.
  2. Завладеть шовной иглы с держателем иглы на дистальном участке корпуса иглы. Затянуть держатель иглы по не сжимая ее до первых храповыми уловов.
  3. Возьмитесь за кожей на одной стороне разреза с помощью пинцета (в зависимости от предпочтений хирурга, зубчатой ​​или снимите зубчатый щипцы или крючки кожи могут быть использованы). Введение иглы ок. 2-3 мм от края разреза, ввод извне кожи.
  4. Лоосан трюме кожи с пинцетом и понять противоположную сторону разреза с пинцетом. Введение иглы ок. 2-3 мм от края разреза, поступающих из внутренней части кожи.
  5. Ослабить держатель иглы и понять конец иглы с пинцетом. Извлеките иглу протектора через кожу, в результате чего удобным длину протектора за пределами первой точке ввода иглы (если несколько мышей, подлежащего лечению, оставить короткий конец; 5-10 мыши могут работать на одной шва иглы / протектора).
  6. Сделать предпочтительный узел соответствии со стандартными протоколами хирурга. Один стежок достаточно, если надрез не превышает 10 мм. Для больших разрезов, сделать вторую строчку.

5. Послеоперационная Лечение

  1. Место мыши в клетке и накрыть тканей, чтобы согреться. При лечении несколько мышей, разместить их рядом друг с другом, чтобы согреться. Также можно разместить мышей в теплый площадку, пока они не проснулисьдо.
  2. Соблюдайте мышей, пока они не проснуться.
  3. Обратите внимание на мышей ежедневно в отношении к заживлению ран, а также другие клинические симптомы, такие как раневых инфекций. Рана, как правило, достаточно закрыты в течение двух дней и исцелил в течение семи дней после процедуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Порядок внутрилимфатическое инъекций у мышей, несмотря на хирургическое природы, является прямым и относительно быстро. Обученный человек может выполнить процедуру в 3-4 мин. Разрез, замкнутое один стежок обычно заживает в течение двух дней (рис. 1)

Внутрилимфатическое вакцинации или иммунизации была выполнена с мРНК, ДНК плазмиды, пептиды, белки, вирусов и бактерий. Рисунок 2 иллюстрирует выработку антител после иммунизации белка фосфолипазы А2 (PLA2), осно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Внутрилимфатическое иммунизации и иммунотерапия как было показано, не подходить для стимуляции обоих реакции антител и Т-клеточных реакций. Как показано в этом видео-статьи, внутрилимфатическое процедура вакцинации является быстрый и простой способ для стимулирования сильный иммунный ответ у мышей. Обученный хирург может выполнить процедуру в течение 3-4 мин. В работе сессии также могут быть разделены между двумя хирургами, где, как правило, делают анестезию и наложение швов и второй хирург делает разрез и инъекции. Эфф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

ТМК назван как изобретатель патентов, связанных с внутрилимфатическое иммунотерапии в человеке. ТМК была научным консультантом и получил командировочные расходы из ImVisioN GmbH, Cytos биотехнологии, MannKind Corporation, и XBiotech США Инк PJ не имеет конфликта интересов раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность за помощь в экспериментальной разработке метода внутрилимфатическое иммунизации у мышей из Iris Эрдмана, Барбара фон Бейста, и Юлия Мария Мартинес-Гомес. Спасибо также Мэгги Аррас и Никола Cesarovic за разрешение использовать их хирургическое театр для этого видео производства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кетамин (кетазол-100)Graeub AG, ШвейцарияАнестетики
Ксилазин (Ромпун)Bayer, ГерманияАнестетики
Viscotears Eye-GelNovartis, ШвейцарияДля предотвращения пересыхания глаз во время анестезии.
BD Micro-Fine 0,5 млBD Medical, Франция29 г Инсулиновые шприцы с постоянно прикрепленными иглами
6-0 Dermalon Monofilament NylonCovidien, MA, СШАДля швов (0,7 метрических, 18 G, 45 см, синий)
Изогнутые щипцы, 4,5 inPolymed, ШвейцарияДля разреза и удержания лимфатических узлов
Прямые хирургические ножницы, 4,5 inPolymed, ШвейцарияДля разреза
Иглодержатель, 5.5 вPolymed, ШвейцарияДля закрытия разреза швом

Ссылки

  1. Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
  2. Maloy, K. J., et al. Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3299-3303 (2001).
  3. Smith, K. A., et al. Enhancing DNA vaccination by sequential injection of lymph nodes with plasmid vectors and peptides. Vaccine. 27, 2603-2615 (2009).
  4. Kreiter, S., et al. Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity. Cancer Res. 70, 9031-9040 (2010).
  5. Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
  6. Smith, K. A., et al. Lymph node-targeted immunotherapy mediates potent immunity resulting in regression of isolated or metastatic human papillomavirus-transformed tumors. Clin. Cancer Res. 15, 6167-6176 (2009).
  7. Johansen, P., et al. Toll-like receptor ligands as adjuvants in allergen-specific immunotherapy. Clin. Exp. Allergy. 35, 1591-1598 (2005).
  8. Johansen, P., et al. Heat denaturation, a simple method to improve the immunotherapeutic potential of allergens. Eur. J. Immunol. 35, 3591-3598 (2005).
  9. Martinez-Gomez, J. M., et al. Intralymphatic injections as a new administration route for allergen-specific immunotherapy. Int. Arch. Allergy Immunol. 150, 59-65 (2009).
  10. Martinez-Gomez, J. M., et al. Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy. Allergy. 64, 172-178 (2009).
  11. Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Control Release. 147, 342-349 (2010).
  12. Waeckerle-Men, Y., et al. Lymph node targeting of BCG vaccines amplifies CD4 and CD8 T-cell responses and protection against Mycobacterium tuberculosis. Vaccine. 31, 1057-1064 (2013).
  13. von Beust, B. R., et al. Improving the therapeutic index of CpG oligodeoxynucleotides by intralymphatic administration. Eur. J. Immunol. 35, 1869-1876 (2005).
  14. Senti, G., et al. Intralymphatic immunotherapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections. J. Allergy Clin. Immunol. 129, 1290-1296 (2012).
  15. Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
  16. Lesterhuis, W. J., et al. Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients. Clin. Cancer Res. 17, 5725-5735 (2011).
  17. Fadul, C. E., et al. Immune response in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccination after radiation chemotherapy. J. Immunother. 34, 382-389 (2011).
  18. Eizenberg, P., et al. Acceptance of Intanza(R) 9 mug intradermal influenza vaccine in routine clinical practice in Australia and Argentina. Adv. Ther. 28, 640-649 (2011).
  19. Durando, P., et al. Adjuvants and alternative routes of administration towards the development of the ideal influenza vaccine. Hum. Vaccin. 7, 29-40 (2011).
  20. Barth, R. J., et al. A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
  21. Schwaab, T., et al. Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients. Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).
  22. Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. Intralymphatic immunotherapy. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 9, 537-543 (2009).
  23. Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen. Immunity. 21, 341-347 (2004).
  24. Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).
  25. Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. M., Gander, B. Lympho-geographical concepts in vaccine delivery. J. Control Release. 148, 56-62 (2010).
  26. Johansen, P., von Moos, S., Mohanan, D., Kundig, T. M., Senti, G. New routes for allergen immunotherapy. Hum. Vacc. Immunother. 8, 1525-1533 (2012).
  27. Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. Intralymphatic immunotherapy: from the rationale to human applications. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 352, 71-84 (2011).
  28. Duthie, M. S., Windish, H. P., Fox, C. B., Reed, S. G. Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines. Immunol. Rev. 239, 178-196 (2011).
  29. Ribas, A., et al. Intra-lymph node prime-boost vaccination against Melan A and tyrosinase for the treatment of metastatic melanoma: results of a phase 1 clinical trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
  30. Bedrosian, I., et al. Intranodal administration of peptide-pulsed mature dendritic cell vaccines results in superior CD8+ T-cell function in melanoma patients. J. Clin. Oncol. 21, 3826-3835 (2003).
  31. Lesimple, T., et al. Injection by various routes of melanoma antigen-associated macrophages: biodistribution and clinical effects. Cancer Immunol. Immunother. 52, 438-444 (2003).
  32. Brown, K., et al. Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys. J. Immunol. 171, 6875-6882 (2003).
  33. Fong, L., Brockstedt, D., Benike, C., Wu, L., Engleman, E. G. Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. J. Immunol. 166, 4254-4259 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

интралимфатическая инъекциявакцинация лимфатических узловиммунизация мышейхирургическое ушивание раныпаховый лимфатический узелметоды доставки вакцинизмерение иммунного ответасравнение с подкожной инъекциейанализ продукции антителцитотоксический Т-клеточный ответ
Внутрилимфатическое иммунотерапия и вакцинации у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.