Способы выделения и подготовки дрозофилы яичек образцов (жить и фиксированной) для работы с изображениями на фазе контраста и флуоресцентной микроскопии описаны здесь.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дрозофилы является мощным модель системы, которая широко используется для выяснения различных биологических процессов. Например, исследования обоих женского и мужских половых линий дрозофилы внесли большой вклад в современное понимание мейоза, а также биологии стволовых клеток. Отлично протоколы доступны в литературе для выделения и визуализации Drosophila яичников и яичек 3-12. При этом методы вскрытия и подготовки дрозофилы яичек для микроскопического анализа описаны с сопровождающим видео демонстрации. Протокол для выделения семенников из брюшной полости взрослых мужчин и подготовки слайды живой ткани для анализа с помощью фазово-контрастной микроскопии, а в качестве протокола для фиксации и иммунного окрашивания яички для анализа с помощью флуоресцентной микроскопии представлены. Эти методы могут быть применены в характеристике Drosophila мутантов, которые обладают Dвидеоэффекты в сперматогенеза, а также в визуализации внутриклеточных локализаций белков.
Введение
Drosophila яички являются идеальным модельной системой для изучения многих биологических процессов, включая регуляцию стволовых клеток, мейоза и развития сперматозоидов 13-18. В сперматоциты и их мейотические шпиндели большие и, следовательно, удобным для цитологического анализа и расслабленной контрольно-пропускные пункты клеточного цикла во время сперматогенеза облегчить изучение мутаций в генов клеточного цикла. Различные типы клеток можно наблюдать в упорядоченной прогрессии по длине яичек, и любое нарушение сперматогенеза может привести к изменениям в этой общей договоренности. Эти характеристики в сочетании с Drosophila генетических....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Семенники Рассечение
- Обезболить мух в бутылку или флакон с помощью потока СО 2 и трансфер в лету площадку.
- Сортировать летает под микроскопом рассекает используя маленькую кисть, и собрать соответствующее количество (в зависимости от эксперимента) от дрозофилы самцов желаемых генотипов. Молодые самцы (0-2 дней) идеально подходят для изучения клеток по всему ранних стадиях сперматогенеза (например сперматогенов, сперматоциты, и в начале пост-мейотические сперматид), в то время как немного старшего мужчины (2-5 дней) идеально подходят для изучения клеток в завершающей стадии сперматогенеза (в частности, созревают спе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Пример правильно расчлененного пары дрозофилы мужских половых органов показано на рисунке 2А. Семенники удалены из брюшной полости взрослого мужского лету, как правило, прилагается к эякуляции протока (коричневый, рис. 2А ") и парой придаточных желез (зеленый, рис. 2А ') через пару семенных пузырьков (синий, рисунок 2А") . Чтобы отделить яички от большинства сопроводительном соматических тканей, в эякуляции протока и придаточных ж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя яички мух дикого типа могут быть легко идентифицированы за счет их желтого цвета (в отличие соседних белых тканей), яички белых мутантных мух белые и таким образом может иногда путать с кишечнике. Большинство трансгенных линий, которые обычно в белом фоне, также есть белые яички, потому что мини-белый ген найден в P-элементов не способствуют накоплению пигмента в яичках. Когда Drosophila яички нельзя отличить по цвету, другие легко узнаваемые черты включают их спиральный.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Андерсона для установления в лаборатории Ли эти принятые методы изучения сперматогенез с экспертным советом из Карен Хейлзом. Х. Ода и Y. Акияма-Ода любезно предоставили γ-тубулина-GFP летать запас. Эта работа была поддержана грантом NIH R01 в LAL (GM074044).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Двухкомпонентный силиконовый эластомер для изготовления силиконовой чашки для препарирования из чашки Kimax Petri |
| PAP ручка | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Прозрачный защитный крем для ногтей | Wet n Wild | 7780235001 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Мышиное антитело к гамма-тубулину (клон GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure козье антимышиное антитело IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Этанол | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Метанол | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% формальдегид | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Использовать в соответствии с инструкцией производителя для силиконизации покровных чеков |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0,5 мг/мл в 75% этаноле; хранить при температуре -20°С; С |
| NaCl | Ресерч Продактс Интернэшнл Корп. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| 2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Kimwipes деликатные салфетки | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Класс молекулярной биологии |
| Стеклянная банка для окрашивания Coplin, завинчивающаяся крышка | Электронная микроскопия Sciences | 70315 | |
| Предметные стекла для одиночного матового микроскопа | Corning | 2948-75X25 | |
| Предметные стекла для микроскопа с поли-L-лизиновым покрытием | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Опционально (для замены необработанных предметных стекол микроскопа) |
| Квадратное защитное стекло | Corning | 2865-22 | |
| Лезвия бритвы | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax чашка Петри | Fisher | Scientific S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
| Щипцы | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
| Стереоскоп | Stemi 2000-CSCarl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Plan-Fluor 40X объектив | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40X объектив | Carl Zeiss |
Ссылки
- McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Bonacc....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
