Методическая статья

Оценивая изменения в летучих общим наркозом чувствительность мышей после местного или системного фармакологического вмешательства

DOI:

10.3791/51079

⸱

16 октября 2013 г.

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Pharmacology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Neuroscience, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 4Center for Sleep and Circadian Neurobiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потеря рефлекса выпрямления долгое время служил в качестве стандартного поведенческого суррогата бессознательности, которая также называется гипноз, у лабораторных животных. Изменения в летучее анестезирующее чувствительности, вызванные фармакологических вмешательств могут быть обнаружены с тщательно контролируемой системы оценки высокой пропускной, которые могут быть адаптированы для доставки любого ингаляционного терапевтического.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Один желательно конечной общей анестезии является состояние бессознательности, также известный как гипноз. Определение гипнотическое состояние у животных менее очевидно, чем это у больных людей. Широко используется поведенческая суррогатом гипноза у грызунов является потеря рефлекса (Lorr), или точку, в которой животное не реагирует на их врожденной инстинкта, чтобы избежать уязвимости спинной лежачее положение. Мы разработали систему оценки Lorr в 24 мышей одновременно, тщательно контролировать для потенциальных путает, в том числе колебания температуры и различных газовых потоков. Эти камеры позволяют достоверно оценить анестетика чувствительности как измеряется латентность вернуться из рефлекса выпрямления (RORR) после фиксированной анестетика воздействия. Кроме того, с помощью ступенчатых увеличивается (или уменьшается) в анестезиологической концентрации, камеры также позволяют определять чувствительность населения к индукции (или появление) как измереноЕС 50 и Хилл склон. Наконец, контролируемые климатические камеры, описанные здесь, могут быть адаптированы для различных альтернативного использования, в том числе вдыхаемого поставки других наркотических средств, токсикологических исследований, и одновременного мониторинга в режиме реального времени жизненно важных функций.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общие анестетики определяются их способностью вызывать обратимое состояние гипноза в самых разнообразных видов, все же объяснения относительно того, как такой разнообразной класс препаратов может все вызвать особая конечная точка пока не удается. Ряд теорий были положены на протяжении многих лет, начиная с корреляцией Майер-Овертон между анестетика потенции и растворимости, который предложил общие мембранные нарушения в качестве основы для гипноза 1,2. Более поздние данные свидетельствуют о том, что белковые мишени, влияющие нейронного сигнала способствовать обезболивающий эффект. Мыши оказались незаменимым модель для изучения этих теорий из-за гомологии между мышиных и обезболивающий отзывчивости человека. Хотя мышь не может быть задан вопрос о его субъективной осведомленности под общим наркозом, некоторые примитивные рефлексы служат в качестве полезных суррогатные меры грызунов гипноза. В первые несколько дней после рождения, мыши разработать рефлексивный выпрямления соотвОНСЕ, что предотвращает их пассивно в лежачем положении 3. Доза наркоза, при котором мышь теряет рефлекса хорошо коррелирует с человека гипнотических дозах 4.

Оценка потери рефлекса (Lorr) стала широко использоваться лаборатория стандарт для тестирования обезболивающий чувствительность у мышей, а также целый ряд других видов, включая крыс, морских свинок, кроликов, хорьков, овец и собак 5-8. Доза данного анестетика, при которой будет происходить Lorr для представителей вида чрезвычайно последовательно, но она может быть сдвинута значительно экологическими факторами. Например, лишенные сна крыс более чувствительны к обоим летучих и внутривенных анестетиков 9 и крыс с высокой аэробной способности менее чувствительны к изофлураном 10. Переохлаждение также было показано, чтобы уменьшить дозу многочисленных анестетиков, необходимых для гипнозом в большом спектра видов 11-14. В порядкенадежно идентифицировать обезболивающий дозы, при которой Lorr происходит в группе подопытных животных, очень важно, чтобы окружающая среда оценка тщательно контролировать, чтобы минимизировать стресс, поддерживать euthermia, и доставить равное количество препарата для всех субъектов. Не удивительно, что генетические факторы, как известно, изменить чувствительность обезболивающий 15-18. Следовательно, серьезное внимание также должно быть уделено управления для генетического фона 19.

Мы разработали устройство, которое обеспечивает одинаковую газообразного доставки анестетика для каждой из 24 мышей при поддержании постоянной 37 ° С окружающей среды. Прозрачная цилиндрическая конструкция наших камер воздействия позволяет для оценки быстро Lorr и легкой интеграции телеметрических физиологических измерений. Эта система, как было показано, чтобы точно измерить изофлурана, галотан и севофлурана индукции EC 50 и время к появлению в дикого типа мышей 20. Мы также использовалиэта система наблюдать изменения анестетика чувствительности у мышей с генетическими мутациями и целевых поражении гипоталамуса 21-23. Здесь мы опишем два способа, в котором анестетик чувствительность может быть оценена после фармакологического вмешательства с помощью нашего аппарата контролируемой среде. Стационарное фенотипирование летучих индукции анестезии и чувствительности появления требуется 8-10 часов и, следовательно, лучше приспособлены для исследований, в которых условия эксперимента не меняются, например, при хронических или длительного действия фармакологических вмешательств. Тем не менее, для короткого действия лечения, последствия которых значительно со временем исчезнет мы также представляем простую процедуру, чтобы оценить изменения в рефлекса следующие стереотаксически-целевых микроинъекций или внутривенных наркотиков лечения, что значительно повлиять обезболивающий появление. Эти тесты представляют собой небольшое подмножество потенциальных приложений для этой управляемой системы окружающей среды, которые могут быть адаптированы для любого количества выполнения надECTS из множества видов, чтобы получить любой тип вдыхаемого терапевтического.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с участием животных, изложенные в настоящем документе были одобрены Университета комитета Институциональная уходу и использованию животных в Пенсильвании.

1. Обзор устройства для тестирования

  1. Устройство для испытаний состоит из 24 Прозрачный акриловый цилиндрических камерах 10 см в длину и 5 см в диаметре (общий объем 200 мл). Этот размер подходит для типичного 25 г взрослой мыши. Камеры имеют порты на каждом конце для впуска и выпуска газа. Выходной конец является съемным, так что животные могут быть легко загружены в камеру. Отверстия газовый порт тщательно герметизируют тефлоновой ленты, в то время как резиновое кольцо прокладки используются для уплотнения съемный конец цилиндрического камер.
  2. Каждая камера установлена ​​на стойке, которая находится внутри водяной бане. Стойка установлена ​​так, что только нижняя часть камер (ниже газовых впускных отверстий) погружен в воду. Для устойчивости, задняя часть камеры опирается на поддержку так, чтобы вся Chambэ сидит горизонтально. Это обеспечивает равномерное контакт всей камере с ванной.
  3. Полиэтиленовый шланг соединяет кислородный резервуар для анестезирующего испарителем, и затем проходит через 10 л / мин расходомера. Трубка расщепляется на 25 резисторов малого диаметра равной длины, чтобы обеспечить равный поток поступает в каждой из камер 24 и к анализатору агента.
  4. Вакуумные линии выхода каждую камеру на противоположном конце впускное отверстие для газа. Это способствует однонаправленный поток, который устраняет возвратное дыхание выдыхаемого углекислого газа. Вакуумные линии сочетают в многообразии подключиться к в доме линии всасывания. Поп-кран вдоль главной вакуумной линии обеспечивает условия атмосферном давлении в каждой камере.
  5. Ванна заполнена достаточно воды, чтобы полностью связаться дно каждой камеры. Вода циркулирует через ванну и поддерживается на постоянном 37 ° С с помощью насоса.

2. Проверьте систему перед воздействием

  1. Счерта, что температура водяной бане составляет 37 ° С в течение всего бане.
  2. Поток кислорода со скоростью 5 л / мин (200 мл / мин в камере + анализатора агента). Погрузите каждую камеру под водой и отыскать пузырьков или проникновения воды в камеру, оба из которых являются показателем утечек. Уплотнение любые утечки перед началом эксперимента.
  3. Для каждой камеры, подключить счетчик мл / мин 500 в соответствии после камеры, чтобы убедиться, что потоки сбалансированы по каждому из газопроводов 25. Это гарантирует, что вход 5 л / мин потоки будут равномерно распределены таким образом, что каждая камера получает 200 мл / мин. Любая камера не получает ожидаемого потока должна иметь свой приток и отток труб проверяется на наличие препятствий.
  4. Анализатор калибруется риэлтор, чтобы обеспечить чтение 0.00% изофлураном когда 100% кислород течет.

3. Имплантат Температура транспондера

  1. За неделю до привыкания, обезболить каждый мышь с 2% изофлураном.
  2. Стерилизовать шеи спинной бетадином.
  3. Введите температурный транспондера подкожно между лопатками, используя стерильный, расфасованный иглу форсунки.
  4. Монитор место инъекции в день в течение инфекции и миграции транспондера.

4. Приучить животных к испытанию палат

  1. За четыре дня до первой оценки, разместить все мыши в отдельных камер в течение 2 часов с 100% кислорода течет.
  2. Повторите шаг 4.1 в день в течение четырех дней до оценки, чтобы избежать смешанное воздействие стресса из-за новой среде.

5. Выполните фармакологического вмешательства, что вы хотите проверить по воздействию на обезболивающий Чувствительность

  1. Это вмешательство может быть стереотаксической инъекции в определенной части мозга 24 внутривенного или внутрибрюшинного введения 25 или доставки лекарственного средства к определенной области мозга с помощью канюли 26.
  2. Потому что сами эти процедуры могут изменить обезболивающий чувствительность по сравнению с наивной животного, надлежащий контроль группы должны пройти ту же процедуру с инъекциями транспортных средств.
  3. Убедитесь, что фармакологические вмешательства имеет надлежащим образом большую продолжительность действия, если вы планируете сделать поэтапно все большее и / или уменьшения определение анестетика чувствительности, как показано в шаге 6 ниже, в противном случае, перейдите к шагу 7.

6. Оценка обезболивающий чувствительность с помощью Поэтапное ЕС 50 Определение для индукции и появление

  1. Поместите каждое животное в отдельных камер со 100% кислорода течет.
  2. Установите концентрацию ИФ до 0,4% * в течение 15 мин. В течение последнего 2 мин этого периода, оценить каждого животного рефлекса на покатых камеру, пока мышь не находится на его спине. Рефлекса считается неизменным, если и только если мышь находится в состоянии восстановить всеего лапы на полу камеры в течение 2 мин.
    1. * Обратите внимание, что на 0,4% изофлуран является subhypnotic доза в мышей C57BL/6J. Если какие-либо мышей теряют рефлекса на первом шаге, начальная доза слишком велика и должна быть уменьшена на последующие дни.
  3. Запишите состояние рефлекса для каждой мыши и сканировать каждый мышь для температурных данных. Запись шаблона показано в таблице 1.
  4. Увеличение концентрации изофлуран на ~ 0,05% в течение 15 мин и повторить шаг 7,2. Продолжайте делать это, пока все животные не потеряли свою рефлекса.
  5. Дополнительно: повторите эту же процедуру для уменьшения ступенчатых изофлураном дозы, пока все животные не обрели рефлекса (см. шаг 6.3).
  6. Для завершения эксперимента, выключите изофлуран и промойте всю систему со 100% кислородом в течение 15 мин. Это поможет предотвратить гипоксию как мыши восстановить, прежде чем вернулся в их клетки и будет защищать experimeГюнтер из любого анестетика воздействия.
  7. Дополнительно: если количество животных или количество анестезирующих концентрации ограничены из-за ресурсов или временных ограничений, оценки, особенно параметров кривой посадки наклон-может Хилл есть недооцененным, ложно заниженным ошибке. В таких случаях может возникнуть необходимость повторить обезболивающий измерение чувствительности, описанную в шагах 6.1-6.6 на срок до двух дополнительных экспериментальных дней, чтобы полностью получить параметр истинного склоне холма и его соответствующий оценку ошибке.

7. Оценка краткосрочных изменений в обезболивающий Чувствительность со временем, чтобы Появление

  1. Поместите каждое животное в отдельных камер со 100% кислорода течет.
  2. Установите концентрацию изофлуран до 1,2%, что соответствует индукции ED 99 для C57BL/6J мышей дикого типа 20. Поддерживать в течение 30-60 мин в зависимости от ожидаемой продолжительности действия острой вмешательства.
  3. Подтвердите Lorr ввсе животные, осторожно не прокатки каждую камеру, пока мышей помещают на своих спинах.
  4. Выключите изофлурана и расхода 100% кислорода. Измерьте время, пока каждое животное не восстанавливает свою рефлекса. Это определяется путем размещения всех четырех лапах на полу камеры и подтверждается наличием трех последовательных тестов с неповрежденной рефлекса выпрямления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 демонстрирует полезность поэтапного Lorr анализа для определения долгосрочных последствий фармакологического вмешательства. Иботеновая кислоты (МБА) является агонистом глутаматэргическую N-метил-D-аспарат (NMDA) рецепторов, который часто используется в качестве excitotoxin вызывать постоянные нейронные повреждения. Здесь мы вводили 10 NL 1% МБА двусторонней основе в вентролатеральной преоптической области (VLPO) от мышей C57BL/6J за неделю до тестирования. Большинство нейронов в этом ядре обна...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя оценка Lorr в одном мыши, казалось бы, простая задача, тем не менее важное значение для поддержания одинаковых физиологических условий между субъектами с целью сбора достоверных данных от группы животных. Жестко регулируется, высокой емкости Lorr аппарат, представленные здесь предлагает способ стандартизировать эксперименты и максимальной эффективности. Соблюдая основные принципы терморегуляции и равномерного распределения потока, эта система может быть легко воссоздать и настроены с учетом потребностей отдельных э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана R01 GM088156 и T32 HL007713-18. Мы хотели бы поблагодарить Билла Пенни и Майкл Carman из Университета Пенсильвании исследовательского инструментария магазин за помощь в сборке нашу рефлекса аппарат.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наименование реагентаНомер в каталогеКомментарии
КислородВоздушный газOX300
ИзофлуранБатлер ШайнЛюбой летучий анестетик может быть заменен
Название материалаНомер вкаталогеНомер компании Комментарии
Массовый расходомер - 10 SLPMOmega EngineeringFMA-A2309
Массовый расходомер 500SCCM Omega EngineeringFMA-A2305
Анализатор анестетиков/индикатор газаAM BickfordFI-21 Riken
Нагревательный водяной насосFisherScientific 13-874-175
Транспондерытемпературы BMDSIPTT-300
RF считыватель температурыBMDSDAS-6007

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
  2. Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
  3. Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
  4. Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
  5. Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
  6. Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
  7. Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R. Medetomidine sedation in sheep. Zentralblatt für Veterinärmedizin. Reihe A. 40 (5), 328-331 (1993).
  8. Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
  9. Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
  10. Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
  11. Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
  12. Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
  13. Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
  14. McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
  15. Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
  16. Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
  17. Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
  18. Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
  19. Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
  20. Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13(2006).
  21. Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
  22. Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
  23. Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
  24. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079(2012).
  25. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771(2012).
  26. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880(2008).
  27. Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
  28. Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
  29. Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
  30. Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903(2010).
  31. Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
  32. Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
  33. Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200(2002).
  34. Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
  35. Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи