Методическая статья

Автоматизированная Разделение С. Элеганс Переменно колонизирована бактериальным патогеном

DOI:

10.3791/51090

⸱

21 марта 2014 г.

 ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сортировщик червей облегчает генетический скрининг у Caenorhabditis elegans, сортируя червей в соответствии с экспрессией флуоресцентных репортеров. В этой статье мы описываем новое применение: сортировку в соответствии с колонизацией GFP-экспрессирующим патогеном, и мы используем ее для изучения плохо изученной роли распознавания патогена в инициировании иммунных реакций.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wormsorter является инструментом аналогично машине FACS, который используется в исследованиях Caenorhabditis Элеганс, как правило, для сортировки червей на основе экспрессии флуоресцентного репортера. Здесь мы выделяем альтернативный использование этого инструмента, для сортировки червей в соответствии с их степенью колонизации в GFP-экспрессирующих патогена. Эта новая использование позволило нам рассмотреть вопрос о взаимосвязи между колонизации червячного кишечника и индукции иммунного ответа. В то время как С. Элеганс иммунные ответы на различных патогенов были зарегистрированы, это еще неизвестно, что инициирует их. Два основных возможностей (которые не являются взаимоисключающими) являются признание патоген-ассоциированных молекулярных моделей, и обнаружение повреждений, вызванных инфекцией. Чтобы различать две возможности, воздействие патогена должны быть отделены от ущерба, который он вызывает. Wormsorter включен разделение червей, которые были широко-колонизирована Грама-нegative возбудитель синегнойная палочка, с ущербом, вероятно, вызванной патогеном нагрузки, от червей, которые были так же, подвергающихся, но не так, или незначительно, колонизировали. Эти различные группы населения были использованы для оценки взаимосвязи между возбудителя нагрузки и индукции транскрипции иммунных реакций. Полученные результаты свидетельствуют о том, что два разобщены, подтверждающие возможность признания патогена.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автоматическая сортировка червей очень похожа на FACS, работая путем измерения флуоресцентного сигнала в черве (обычно обеспечиваемого трансгенной экспрессией репортерных белков) при его прохождении в выпрямленном виде в трубке, что позволяет перенаправлять его либо в сборную трубу/колодец, либо в контейнер для отходов в соответствии с параметрами стробирования, установленными исследователем1. Сортировщик червей может облегчить исследования во многих отношениях; Примером использования его в качестве аналитического инструмента является исследование, в котором отслеживались пространственно-временные закономерности активности промотора для почти 1000 генов2,
Тем не менее, основное применение сортировщика червей заключается в генетическом скрининге, отслеживании целевых уровней экспрессии генов или локализации флуоресцентного белка вдоль оси червя3-5.

Здесь мы описываем новое применение для сортировщика червей, которое следует за колонизацией червя флуоресцентно помеченным патогеном. Используя этот инструмент в качестве инструмента, мы сосредоточились на взаимосвязи между колонизацией/нагрузкой патогена и иммунным ответом, чтобы получить новое представление о механизмах, ответственных за инициацию иммунных реакций у червя.

Практически у всех организмов, изученных на сегодняшний день, инициация врожденных иммунных реакций на микробные патогены зависит от распознавания патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) и/или связанных с опасностью/повреждением молекулярных паттернов (DAMP)6,7. Первые представляют собой консервативные микробные структуры, которые включают компоненты клеточной стенки микроба, ее жгутик или липидный бислой6; вторые включают как высвобожденные молекулы (например, АТФ8), так и измененные белки или другие маркеры измененных клеточных процессов9,10. Оба типа сигналов распознаются белками, обозначенными как рецепторы распознавания образов (PRR), которые при специфическом связывании молекулы паттерна активируют цепочку событий, приводящих к защитной реакции. C. elegans был чрезвычайно полезен в качестве податливой модели для анализа различных аспектов взаимодействия хозяина и патогена, но одна вещь, которая не совсем понятна, заключается в том, как инициируются иммунные реакции у червя. Ни один из предполагаемых рецепторов, которые являются ортологичными по отношению к рецепторам распознавания образов (PRR) у других организмов, не связывает PAMP, и многие из ортологов PRR, которые играют ключевую роль в иммунных реакциях у других организмов, демонстрируют удивительно ограниченный вклад в реакцию и резистентность патогенов червей. Например, рецептор Drosophila Toll, который необходим для противостояния грамположительным патогенам, представлен у C. elegans единственным гомологом, тол-1, который способствует защите от грамотрицательного патогена Salmonella Typhimurium11, но не от других тестируемых грамотрицательных, или -положительных патогенов11,12 .Эти наблюдения в сочетании с данными, указывающими на то, что иммунные реакции могут быть вызваны нарушением трансляции клеточных белков, привели некоторых к предположению, что C. elegans в первую очередь обнаруживает DAMPs9,13,14. Тем не менее, сообщения, описывающие способность мертвых патогенов вызывать иммунные реакции, позволяют предположить, что связывание PAMP может играть важную роль в распознавании патогенов у C. elegans15,16. Предыдущая работа, посвященная иммунным реакциям в генетически идентичных популяциях C. elegans с синхронизацией по возрасту, продемонстрировала большую индивидуальную изменчивость колонизации кишечника бактериальным грамотрицательным патогеном Pseudomonas aeruginosa.

Однако, исследования транскрипционного профилирования рассматривали эти популяции с различными колониями как единое целое17,18. Воспользовавшись этой изменчивостью, мы разработали протокол, ориентированный на автоматизированный сортировщик червей для разделения дифференциально колонизированных популяций Caenorhabditis elegans, подвергшихся воздействию Gfp-экспрессирующей P. aeruginosa. Изучение экспрессии генов в по-разному колонизированных популяциях облегчило оценку взаимосвязи между патогенной нагрузкой (и связанным с ней повреждением) и иммунными реакциями и дало новые представления о распознавании патогенов у C. elegans19. Ниже мы опишем протокол, который может быть применен для сортировки червей, зараженных любым флуоресцентно меченным патогеном.

Потенциальным пользователям следует отметить, что количество червей, которые необходимо отсортировать, зависит от характера последующих анализов и используемых протоколов. Например, в случае анализа экспрессии генов на микрочипах потребуется >1000 червей, чтобы получить достаточное количество РНК, если используются стандартные протоколы, но ~100 червей будет достаточно, если используется амплификация, что позволяет быстро собирать материал и, таким образом, минимизировать стресс для червей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение синхронизированной культуры молодых взрослых животных

  1. Выращивайте червей на нескольких планшетах NGM, засеянных бактериями OP50-1 E. coli (в 10 раз концентрированными из насыщенной культуры), пока многие черви не достигнут стадии гравида.
  2. Обрабатывайте прикормленных животных раствором для приготовления яиц для получения синхронизированной культуры (яиц).
  3. Пластинчатые яйца на нескольких 60-мм пластинах NGM засеяны 10-кратным концентрированным OP50-1 с плотностью примерно 150-200 яиц на пластину.
  4. Инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение 2 дней (до тех пор, пока черви не достигнут стадии L4 - Young Adult).

2. Приготовление пластин Pseudomonas aeruginosa и заражение червей

  1. В день подготовки яиц (шаг 1.1) инокулируйте культуру PA14::GFP в 2 мл среды King's B, содержащей рифампицин в конечной концентрации 100 мкг/мл. Инкубируйте культуру при 37 °C с перемешиванием O/N.
  2. Нанесите культуру PA14::GFP на столько пластин медленного убийства (SKP), сколько необходимо для анализа. На каждую 150 мм СКП чашку Петри наносят пипеткой 75-100 мкл насыщенной культуры и равномерно распределяют с помощью разбрасывателя стерильного стекла. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение 20-24 часов.
  3. Выньте тарелки из инкубатора и дайте им остыть до RT (~20 мин). Используя буфер M9, промойте червей из шага 1.4 на пластины PA14::GFP в минимальном объеме жидкости. При использовании пластин 150 мм на одной пластине можно разместить несколько сотен червяков.
  4. Инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение 18-21 ч. Для молодых взрослых червей, подвергшихся воздействию P. aeruginosa, это временное окно, показывающее оптимальное распределение колонизированных и неколонизированных животных.

3. Настройка сортировщика червей

Перед выполнением сортировки образцов убедитесь, что машина работает правильно. Подробную информацию можно получить на сайте http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, а основные шаги изложены ниже.

  1. Установите давление клапана оболочки примерно на 5 фунтов на квадратный дюйм (диапазон 4,5-5,5).
  2. Чтобы убедиться в правильности расхода жидкости в оболочке, поместите коническую трубку объемом 15 мл под дозатор, включите клапан оболочки и выключите клапан сортировщика. Подержите тюбик под диспенсером в течение 60 секунд. Объем в тюбике должен составлять 9-10 мл. Если оно выходит за пределы этого диапазона, отрегулируйте давление клапана оболочки соответствующим образом.
  3. Чтобы убедиться, что скорость потока жидкости оболочки (заданная как в шаге 3.2) обеспечивает точную сортировку, проверьте скорость сортировки с использованием контрольных частиц размером 40 мкм:
  4. Закройте клапан оболочки. Добавьте в резервуар около 25 мл раствора контрольных частиц.
  5. Откройте клапан оболочки и клапан для отбора проб.
  6. В компьютерном программном обеспечении перейдите в «режим управления частицами» и нажмите «Получить».
  7. Убедитесь, что скорость потока частиц составляет ~5-8 частиц/сек, при этом TOF (время полета) приблизительно соответствует ширине частицы, 40 мкм. Такой TOF указывает на то, что в каждый момент времени проходит только один объект размером 40 мкм. Если значения выходят за пределы этого диапазона, отрегулируйте настройки (следуя указаниям выше) соответствующим образом.

4. Сортировка колонизированных и неколонизированных червей

  1. С помощью М9 промойте червей в конические пробирки объемом 15 мл. Дайте взрослым червям опуститься на дно трубки под действием силы тяжести и удалите надосадочную жидкость. Заполните тюбик свежим М9. Повторите этот процесс 3-4 раза. При этом удаляется большая часть личинок, а также избыток бактерий и занимает около 10 минут.
  2. Добавьте червей в резервуар червесортера с помощью аккуратно перемешивающей мелкой мешалки.
  3. Отрегулируйте усиление начального сигнала, установив для зеленого ФЭУ значение 600, а для красного и желтого ФЭУ — значение 200.
  4. Начните сбор данных для настройки параметров.
  5. Стремитесь к частоте сортировки 25-30 событий (червей) в секунду. Если норма численности слишком высока, разведите червей в резервуаре с М9 соответственно. Если ставка слишком низкая, добавьте больше червей в небольшом объеме M9.
  6. Если эксперимент требует очень строгого разделения колонизированных и неколонизированных червей, установите «проверку совпадений» на «чистый». Это гарантирует, что в случае, если два объекта окажутся слишком близко друг к другу или в одном и том же падении, машина отбракует каплю, а не соберет ее.
  7. Чтобы отсортировать интересующую популяцию, нарисуйте ворота вокруг осей, указывающие на размер (чтобы получить взрослых червей) и интенсивность флуоресценции (т.е. высокую для колонизированных, низкую для неколонизированных). Значения для флуоресцентного стробирования должны быть определены опытным путем.
  8. Поместите многолуночную тарелку или чашку Петри под дозатор для сбора червей, затем откройте сортировочный клапан, чтобы начать сортировку червей.
  9. Соберите небольшую популяцию животных, чтобы проверить под микроскопом, что отсортированная популяция является популяцией, представляющей интерес. Если нет, отрегулируйте параметры стробирования соответствующим образом и продолжите сбор образцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Когда генетически идентичные C. elegans соответствующего возраста подвергаются воздействию P. aeruginosa, наблюдается широкое распределение уровней колонизации (Рисунок 1A). С помощью описанного здесь протокола можно добиться эффективного отделения неколонизированных червей от колонизированных (рис. 1B). В отличие от неколонизированных червей, колонизированные черви проявляют признаки повреждения, такие как вялость и снижение дефекации. Последнее может быть п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, который мы описываем, использует преимущества флуоресцентного мечения объектов вне червя, чтобы проследить взаимодействие между червем и окружающей его средой. В рассматриваемом нами случае разделение было основано на мечении патогена и использовалось для отделения червей с большой нагрузкой патогена от червей без (или с легкой) нагрузкой. Последующий анализ экспрессии генов не обнаружил различий в иммунных реакциях между двумя группами, что позволяет предположить, что они не зависят от патогенной нагрузки. В друг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Медицинский фонд Эллисона за их поддержку. Мы также хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории Эбби Дернбург за помощь в использовании червячного сортировщика.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
M9 Буферсобственного приготовленияРецепт в wormbook.org
РифампицинSigmaR3501
Раствор для приготовления яицприготовлен в доме50 мл воды; 40 мл отбеливателя; 10 мл 10 Н гидроксид
натрия NGM тарелкиприготовлен в домеРецепт в wormbook.org
пластинах SKPприготовлен в домеРецептура такая же, как и NGM, только 0,35% пептона вместо 0,25%Контрольные
тестовые частицыUnion Biometrica310-5071-001

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
  2. Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans. Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).
  3. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans. J. Vis. Exp. (60), (2012).
  4. Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans. Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).
  5. Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).
  7. Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).
  8. Mariathasan, S., et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
  9. Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149, 452-466 (2012).
  10. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  11. Tenor, J. L., Aballay, A. A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity. EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).
  12. Pujol, N., et al. A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).
  13. McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans. Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).
  14. Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling. Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).
  15. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, (2010).
  16. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. , (2011).
  17. Shapira, M., et al. A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).
  18. Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. , 183 (2006).
  19. Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans. PLoS One. , 7 (2012).
  20. Jakobsen, H., et al. The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response. PLoS One. 8, (2013).
  21. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiol. 12, 49 (2012).
  22. Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).
  23. Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Pseudomonas aeruginosaNGMGFP

Похожие статьи