Количественный метод исследования спонтанной миграцию клеток в одномерном замкнутом микросреды описано. Этот метод использует микроизготовленном каналов и может быть использован для изучения миграции большого числа клеток при различных условиях в отдельных экспериментах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Исследование клеточной миграции в микроизготовленном каналов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Описанный здесь метод позволяет изучать миграцию клеток в ограниченном объеме в одном измерении. Он основан на использовании микроизготовленном каналов, которые налагают поляризованный фенотип в клетках физическими ограничениями. После того, как внутри каналов, клетки имеют только две возможности: двигаться вперед или назад. Эта упрощенная миграция, в которой направленность ограничена облегчает автоматическое отслеживание клеток и извлечение количественных параметров для описания движения клеток. Эти параметры включают скорость клеток, изменения в направлении и паузы во время движения. Микроканалы также совместимы с использованием флуоресцентных маркеров, поэтому подходят для изучения локализации внутриклеточных органелл и сооружений во время миграции клеток в высоком разрешении. И, наконец, поверхность каналов могут быть функциональными с различными субстратами, что позволяет контролировать адгезионных свойств каналов или изучении haptotaxis. Таким образом, система чпрежде чем описано предназначен для анализа миграции больших количествах клеток в условиях, в которых как геометрия и биохимический характер среды находящимися под контролем, способствуя нормализации и воспроизводимость независимых экспериментов.
Введение
Миграция представляет собой комплекс клеточные функции, что имеет важное значение для многих физиологических процессов в многоклеточных организмов, в том числе развития, иммунного ответа и регенерации тканей. Кроме того, некоторые патологические состояния, такие как опухолевой инвазии и метастазирования полагаться на клеточной подвижности 1. По этим причинам, миграции клеток стала одним из основных области исследования в контексте фундаментальных и трансляционных исследований. В естественных условиях, большинство тканей характеризуются богатой внеклеточного матрикса и высокой плотности клеток. Миграция клеток таким образом, в физиологических услов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Важное примечание: Этот протокол предполагает, что формы, содержащий форму для требуемых микроканалов уже сделан. Дополнительная информация о подготовке пресс-формы уже опубликованы 10. Этот протокол также предполагает, что ДК костного мозга культура известна.
1. Чип Изготовление
- Смешайте PDMS масло и отвердитель при массовом соотношении 10:01 в пластмассовой чашке. Смешайте оба соединения тщательно.
- В ролях микс над опорными микроканалов плесени. Общая высота должна быть от 0,5-1 см.
- Удалить пузырьки воздуха в вакуумном банку колокол в течение 1 часа.
- Харден PDMS в форм....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В каждом эксперименте поверхность PDMS покрыта молекулы, адаптированной к интересам исследования. Рисунок 2 показывает каналы, покрытые флуоресцентной молекулой, PLL-г-PEG, до и после мытья (шаг 2.4). Такой эксперимент позволяет контролировать однородности покрытия в каналах.
После нагрузки сотовой ячейки, видео микроскопия может быть выполнена следовать миграцию клеток. Фиг.3А показывает пример DC миграции в микроканалов с плотностью, соответствующей отслеж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы опишем устройство состоит из микроканалов в качестве метода изучения миграционных свойств большого количества клеток в отдельных экспериментах. Эта экспериментальная система имитирует замкнутые экологические ограничения, найденные в тканях эндогенными перелетных клеток. Однако, заставляя миграции в одном измерении, это облегчает автоматическое отслеживание клеток и извлечение measurables (рис. 5). Мы также показываем, что наш прибор совместим с флуоресцентной микроскопии и поэтому может быть ад.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы значительно признать платформу PICT IBiSA в Институте Кюри (CNRS UMR144). Эта работа финансировалась за счет грантов от: Европейского исследовательского совета в AM.LD (Strapacemi 243103), Ассоциация Nationale Pour La Recherche (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), основой InnaBiosanté (Micemico) многоцелевой и AM. LD и ERC Strapacemi молодой грант следователя AM.LD.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Полидиметилсилоксан (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Упаковка 90% силиконовой основы и 10% отвердителя |
| Резак для образцов | керна Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Диаметр 2,5 мм |
| Чашка со стеклянным дном | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ультразвуковая очиститель | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Плазменная очиститель | Harrick Plasma | PDC 32 G | Для небольших образцов (35 тарелок). Также доступна более крупная версия: |
| Фибронектин из плазмы крупного рогатого скота | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
Ссылки
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008). <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
