Новый подход к сравнительному анализу мультибелковых комплексов на основе 15 N Метаболический Маркировка и количественный Масс-спектрометрия

Summary

Описанный сравнительный количественный протеомических подход направлен на получение представление в состав мультибелковых комплексов при различных условиях и продемонстрировано сравнением генетически различных штаммов. Для количественного анализа равные объемы различных фракций с градиентом плотности сахарозы, смешивают и анализировали с помощью масс-спектрометрии.

Abstract

Введенный протокол предоставляет инструмент для анализа мультибелковых комплексов в тилакоидной мембраны, путем выявления понимание сложного состава в различных условиях. В этом протоколе подход продемонстрирована сравнением состав белкового комплекса, отвечающего за циклического потока электронов (CEF) в Chlamydomonas reinhardtii, изолированного от генетически различных штаммов. Процедура включает в себя изоляцию тилакоидных мембран, после чего их разделения на мультибелковых комплексов в градиенте плотности сахарозы центрифугирования, SDS-PAGE, иммунологического и сравнительного, количественного масс-спектрометрии (МС) на основе дифференциального метаболического маркировки ⁽¹⁴ Н / ¹⁵ п) проанализированные штаммы. Моющие солюбилизированные тилакоидные мембраны загружаются на градиентах плотности сахарозы при равной концентрации хлорофилла. После ультрацентрифугированием, градиенты разделены на фракции, которые проанализированы масс-spectrometры на основе равного объема. Такой подход позволяет исследование состава в градиентных фракций и, кроме того, чтобы проанализировать миграционного поведения различных белков, который специально разработан для ANR1, CAS, и PGRL1. Кроме того, этот метод продемонстрировано подтверждает результаты иммуноблоттинга с и, кроме того, поддерживая выводы из предыдущих исследований (идентификации и PSI-зависимой миграции белков, которые были ранее описанных быть частью CEF-суперсложные таких как PGRL1, FNR, и цит е). Примечательно, что этот подход применим для решения широкого круга вопросов, для которых этот протокол могут быть приняты и, например, используемых для сравнительного анализа мультибелкового сложного состава, выделенного из различных условиях окружающей среды.

Introduction

Фотосинтетические процессы в тилакоидных мембран растений и водорослей может функционировать в линейном и циклическом режиме. Во линейного электронного потока (LEF) фотосистемы I (PSI), фотосистемы II (ФС) и цитохром б ₆ / _F в конечном счете переноса электронов от воды к НАДФ + ^1, что приводит к генерации НАДФН и АТФ ^2. В противоположность этому, циклический поток электронов (CEF), который, как известно, индуцированный в разнообразных условиях окружающей среды, таких как состояние 2 ³ и ⁴ анаэробных условиях, приводит к уменьшению повторного окисленного PSI инжекцией электронов обратно в цепи транспорта электронов. Этот процесс может происходить либо в стромальных стороне цитохрома Ь ₆ / ж комплекса ¹ или на пластохинона бассейн ⁵ и генерирует АТФ, но не НАДФН ^2.

Целью представленного протокола является продемонстрировать масс-спектрометрии (MS) на основе меню для сравнительного, количественного анализа мультибелковых комплексов в мембранах тилакоидов из Chlamydomonas reinhardtii, чтобы разобраться в состав этих комплексов в различных условиях (на примере сравнения генетически различных штаммов). Этот подход был применен в публикации Terashima и соавт. В 2012 показывая Ca ^{2 +-зависимый} регулирование CEF в С. reinhardtii посредничестве мультибелкового комплекса, включающего белков CAS, ANR1 и PGRL1 ^6. Процедура будет объяснено сравнительно анализа состава в CEF-суперсложные в двух генетически различных штаммов, тем самым воспользовавшись маркировки один из двух штаммов с тяжелой азота (N) ^15. Вкратце, протокол включает в себя подготовку мембран тилакоидов, а затем моющего растворения и фракционирования фотосинтезирующих комплексов в градиентом плотности сахарозы. После фракционирования градиента, выбранный гидроразрываций двух штаммов смешивают на основе равного объема, разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ с последующим в геле пищеварения и последующего количественного анализа MS.

Как упоминалось выше, CEF индуцируется в различных экологических условиях и публикация с 2010 демонстрирует изоляцию функциональной CEF-сверхсложных от государства 2 заблокированные клетки C. reinhardtii ^7, который был выполнен путем разделения растворенные тилакоидных мембран на градиент плотности сахарозы в течение ультрацентрифугирования. В отличие от Иваи и соавт. ^7, представленный протокол описывает изоляцию CEF-сверхсложных от анаэробной выращенного С. reinhardtii культуры, следуя альтернативную процедуру. Это включает в себя изменения в протокол изоляции тилакоидной а также различия в отношении стадии солюбилизации и разделение белковых комплексов посредством ультрацентрифугирования. В настоящем Протоколе, тилакоидные мембраныизолированы с помощью процедуры, опубликованный Чуа и Bennoun ^8, в то время как буферы используются для тилакоидной подготовки по Иваи и др.. содержится 25 мМ MES, 0,33 М сахарозы, 5 мм MgCl _2, 1,5 мМ NaCl (рН 6,5), как описано ^9. Растворение проводили с 0,7-0,8% моющего средства (н-тридецил-β-D-мальтозид) в течение 30 мин на льду в случае Iwai с соавторами, а метод солюбилизации описано здесь основана на использовании 0,9% моющего средства (п -додецил-β-D-мальтозид (β-DM)) и выполняется в течение только 20 минут на льду. Обе группы использовали 0,8 мг на мл хлорофилла для солюбилизации с соответствующим моющим средством. Для разделения фотосинтезирующих комплексов от растворенных мембран тилакоидов Иваи и др.. Применяется концентрации сахарозы между 0.1-1.3 M, в то время как авторы этого протокола используется концентрациях от 0,4-1,3 М. последняя разность скорость центрифугирования, что ниже по сравнению к еаrlier публикации.

Солюбилизация мембран тилакоидов с неионогенных моющих средств с последующим градиент плотности сахарозы фракционирования уже применяется в многочисленных исследованиях не начиная с 1980-х до сегодняшнего дня ^{7, 9-14,} а также применение метаболического маркировки белков является распространенным методом в области протеомики. Описанный подход применяет ¹⁵ N метаболизма маркировки для одного из двух сравниваемых штаммов при культивировании ее в присутствии тяжелого азота в качестве единственного источника азота в виде ¹⁵ N NH ₄ Cl, который включен во все аминокислоты, ведущих к массе сдвиг в зависимости от аминокислотной последовательности пептида. При анализе смесь ¹⁴ N и ¹⁵ Н в течение одного MS работать, этот сдвиг массы могут быть использованы для определения образца происхождение для каждого пептида и пептида относительной распространенности можно рассчитать относительное содержание представляющий для соответствуютING белок ^15.

Многочисленные количественные протеомики исследования по С. reinhardtii доступны, которые сравнивают определенное количество белка для анализа изменений в протеоме между экспериментальных условиях (например, изменения в протеоме из-за питательной ^16-19 или светло стресса ^20,21). По сравнению с теми исследований, в настоящее время, представленного подхода равные объемы образцов объединены и проанализированы. Эта установка позволяет изучить поведение миграции белков внутри градиента и, кроме того, чтобы проанализировать состав различных комплексов по отношению к исследованных штаммов.

Этот метод будет объясняется главным образом сосредоточиться на трех белков: Первым кандидатом является кальций белка датчик CAS хлоропластов локализованные, который был показан принять участие в фото-акклиматизации в С. reinhardtii ^22. Кальций считается важным сигналомING ион для путей, которые активируются в силу различных биотических и абиотических стрессов, наконец, приводит к изменениям в экспрессии генов и клеточной физиологии ^23, и было предложено, что хлоропласты могут способствовать сотовой Са ^{2 +} сигналов посредством белка CAS ^22,24,25. Второй белок ANR1 (анаэробная реакция 1 ^6), белок, который был показан быть вызван в бескислородных условиях выращивания в С. reinhardtii ^26. В частности, CAS а также ANR1 были идентифицированы как субъединиц CEF-суперсложные и кроме того, с помощью обратного генетические подходы, было показано, что оба белка способствовать функционально CEF в естественных условиях ^6, поддерживая их роли в качестве функциональных субъединиц этого белкового комплекса. Третий белок тилакоидной белок PGR5-Как 1 (PGRL1), который был показан принять участие в CEF в хламидомонады ^4,27, а также в Arabidopsis ^5,28 и был также идентификаторentified в работе Иваи и соавт. ⁷

Этот подход будет представлен, показывающий результаты двух разных экспериментов: дикого типа (WT) по сравнению с (по сравнению) штамм ΔPSI ^29, демонстрируя делецию гена psab, кодирующую существенной фотосистемы I-субъединицы, которая также является частью CEF-сверхсложные и WT против pgrl1 нокаут нагрузку ^4. Для каждого из этих экспериментов количественный состав CEF-суперсложные между ¹⁵ и ^N-14 N-меченого штамм был по сравнению.

Protocol

1. Культивирование хламидомонады

1. В следующем С. reinhardtii штаммы были использованы в данном исследовании: WT cc124, WT cw15-arg7 (клеточной стенки дефицитных и аргинин ауксотроф), ΔPSI мутантный штамм ²⁹ и pgrl1 нокаут штамм ^4.
2. Все штаммы выращивали в Трис-ацетат-фосфат (TAP)-средних ^30, при 25 ° С с непрерывным интенсивности света 20-50 мкЕ / м ² сек и встряхивании при 120 оборотах в минуту. Культура ΔPSI должны быть обернуты с некоторым папиросной бумаги для освещенности <5 мкЕ / м ² сек.
3. Культуры меченых штаммов (ΔPSI и WT cc124 соответственно) содержится 7,5 мм ¹⁵ N NH ₄ Cl, тогда как культуры для nonlabeled штаммов (WT cw15-arg7 и pgrl1 соответственно) содержится 7,5 мм ¹⁴ N NH ₄ Cl. Клетки должны расти, по крайней мере четыре порождающимионы по достижению полного маркировку и должны храниться при экспоненциальной фазе роста.
4. За день до начала рассчитывать эксперимент и разбавить клетки до плотности 1 х 10 ⁶ клеток / мл в объеме не менее 750 мл / деформации.

Обратите внимание, что два типа разрывных градиентах плотности сахарозы описаны в следующей методике. В плотности фотосистемы сахарозы градиенты в соответствии с Такахаши и др.. ⁹ используются для разделения различных фотосинтеза белковые комплексы из изолированных и солюбилизированных тилакоидов во время в течение ночи центрифугирования и должны быть готовы за день до (см. Протокол 2) и тилакоидной градиентах плотности сахарозы ⁸ применяются в процессе выделения тилакоидной (см. протокол 3).

2. Подготовка Фотосистема плотности сахарозы градиенты

1. Для заливки градиенты необходимы три растворы:
   1. 2 М сахарозы
   2. 10% β-ДМ в Н ₂ О
   3. 0,5 М Трицин, рН 8,0 (NaOH)
2. Используя эти запасы, подготовить следующие решения:

   Концентрация:	1,3 М	1,0 М	0,85 М	0,7 М	0,65 М	0,4 М
   2 М сахарозы	13 мл	10 мл	8,5 мл	7 мл	6,5 мл	4 мл
   10%46;-DM	100 мкл	100 мкл	100 мкл	100 мкл	100 мкл	100 мкл
   0,5 М Трицин	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл
   H 2 O	6,7 мл	9,7 мл	11,2 мл	12,7 мл	13,2 мл	15,7 мл

3. Используйте 14 мм х 89 мм центрифужные пробирки и залить градиенты очень медленно, начиная с самой высокой плотностью сахарозы решения нижнего решения плотности.
4. Налейте только на 1 мл каждого 1,3 и 1,0 М растворов и 2 мл для остальных решений.
5. Оставьте градиенты на ночь в холодной комнате.

3. Анаэробные Индукционная и выделение мембран тилакоидов ⁸

1. Перед началом изоляции тилакоидных мембран, индуцируют анаэробных условий барботированием аргоном в течение 4 часов. Выделение пузырьков может быть выполнена с помощью стеклянной пипетки в культивирования колбы при постоянном перемешивании культуры с магнитной мешалкой.
2. Начнем с выделением тилакоидных мембран по гранулирования клеток в течение 5 мин при 2500 х г, ресуспендируют в буфере H1 (0,3 М сахарозы, 25 мМ HEPES (рН 7,5), 5 мМ MgCl _2).
   (Обратите внимание, что, когда, начиная с выделения мембран тилакоидов образцов шульд быть на льду, чтобы избежать деградации белка, все стадии центрифугирования осуществляются при 4 ° С и работает в перчатках, настоятельно рекомендуется, чтобы избежать кератина загрязнения.)
3. Гранул клетки в течение 5 мин при 2500 мкг, ресуспендируют в H1 буфера.
4. Перерыв клетки с двумя проходами через распылитель с давлением азота 1500 гПа (для штаммов без клеточной стенки сделать только один проход).
5. Спином вниз клетки для 7 мин при 2500 х г.
   (После этого шага супернатант должен быть светло-зеленый, если нет, то клетка поломка не была успешной.)
6. Ресуспендируют клеток в H2 буфера (0,3 М сахарозы, 5 мМ HEPES (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА (рН 8,0)) и гранул клеток течение 10 мин при 32800 х г.
7. Ресуспендируют клеток в H3 буфера (1,8 М сахарозы, 5 мМ HEPES (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА (рН 8,0)) и гомогенизируют гранул с гончара (нет зеленого частицы не должны оставаться в конце этого рабочего этапа).
8. Подготовка тилакоидных градиентов плотности сахарозы в ваннойэс (25 мм х 89 мм) по начиная с нижней слоем 12 мл H3 буфер с клетками, залить средний слой 12 мл H4 буфера (1,3 М сахарозы, 5 мМ HEPES (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА ( рН 8,0)) и на верхней 12 мл H5 буфера (0,5 М сахарозы, 5 мМ HEPES (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА (рН 8,0)). Будьте осторожны при заливке градиенты и избежать смешивания из трех слоев.
9. Весы с H5 буфер и центрифуги тилакоидные сахарозы градиенты плотности течение 1 часа при 70700 х г.
10. Удалить тилакоидных полосы от тилакоидных градиенте плотности сахарозы и разбавить их с соответствующим буфером объем H6 (5 мМ HEPES (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА (рН 8,0)).
11. Спином вниз клетки в 37900 мкг в течение 20 мин. Если гранулы не плотно, более H6 буфер необходим для этой стадии центрифугирования.
12. Ресуспендируют тилакоиды в небольшом объеме H6 буфера и заполните определения концентрации хлорофилла.

4. Определение хлорофилла концентрации ³¹

1. Определение количества хлорофилла осуществляется с 80%-ным ацетоном.
2. Смешайте 995 мкл 80% ацетона и 5 мкл тилакоидов в H6 буфера (разведение 1:200).
3. Vortex в течение нескольких секунд, пока не зеленые частицы остаются и затем спина вниз на 14,1 мкг в течение 5 мин.
4. Возьмите супернатант и измерить вымирание на 663,6 и 646,6 нм и 750 нм, соответственно.
5. Рассчитайте количество хлорофилла по следующим формулам:
   1. С _Хл [мг / мл] = (0,01225 * E _663,6 - 0,00255 * E _646,6) * коэффициент разбавления
   2. С _{Хл б} [мг / мл] = (0,02031 * E _646,6 - 0,00491 * E _663,6) * коэффициент разбавления
   3. С _Хл [мг / мл] = С _Хл + C _{Хл б}

5. Загрузка Фотосистема плотности сахарозы градиенты

1. Рассчитайте количество тилакоидов, β-DM и H6 буфера, которые необходимыдля каждого градиента:
   1. Каждый градиент должен быть загружен с общим объемом 700 мкл с 0,8 мг / мл хлорофилла в 0,9% β-DM (растворить β-DM в Н ₂ О), заполнить оставшийся объем с H6 буфера.
2. Для растворения готовить различные аликвоты с тилакоидов, β-DM и H6 буфера для каждого градиента.
3. Оставьте образцы в течение 20 мин на льду с регулярно смешивания (обращения) каждые несколько минут (растворение шаг).
4. Центрифуге при максимальной скорости (14000 мкг) в течение 10 мин при 4 ° С.
   (После центрифугирования осадок должен быть небольшим и беловатый в то время как супернатант темно-зеленого цвета.)
5. Загрузите супернатант от градиентов.
6. Весы с H6 буфер и спин помощью ультрацентрифугу на 134470 мкг в течение ночи (14 ч) при 4 ° С
   (Обратите внимание, что успешное разделение фотосинтезирующих комплексов с использованием градиентов плотности фотосистемы сахароза, представленные в этом протоколе достигается только при условии Усинг свежевыделенные тилакоиды, так как предсказание для растворения и сложной разделения трудно сделать при работе с мембранах тилакоидов, которые были заморожены до.)

6. Фракционирование Фотосистема плотности сахарозы градиенты

1. Сфотографируйте градиентов.
2. Прокол отверстие в нижней части трубки с помощью иглы и фракционирования градиенты в 500 мкл труб. В качестве альтернативы, фракционирование может также быть осуществлена ​​с использованием 96-луночного планшета (микропланшет).
3. При использовании микропланшет, определяют оптическую плотность разных градиентных фракций при 675 нм.
   (На этом этапе образцы могут храниться при температуре -80 ° С в течение нескольких недель.)

7. SDS-PAGE и Иммунологический

(Обратите внимание, что только для сравнения WT против ΔPSI вестерн-блот анализ был проведен, чтобы выбрать фракций для последующего MS-анализа. Для эксперимента WT против pgrl1 птДействия были выбраны посредством оптической плотности в различных фракциях.)

1. Отдельные 30 мкл каждой фракции от WT и ΔPSI градиента на 13% SDS полиакриламидном геле ^32.
2. Выполните Вестерн-блоттинга ^33, используя следующие антитела: ANR1 (TEF7) ^26, PGRL1 ^34, CAS ^6, PSI субъединицы PSAD ³² и ФС II ядро субъединицы D1. Используйте все антитела при разведении 1:1000 (для улучшенного метода обнаружения хемилюминесценции), для антитела D1, который должен быть использован при разведении 1:10000 исключением.
3. На основании результатов иммунологического, взять пиковые фракции ANR1, PGRL1 и PSAD для WT и ΔPSI (здесь фракции 6 и 13, соответственно), смешать 30 мкл фракции 6 из WT и ΔPSI и сделать то же самое с фракцией 13 от оба препарата и разделить их снова на 13% SDS полиакриламидном геле.
4. Для количественного сравнения WT против pgrl1 принять СEF-сверхсложные фракции, как это определено путем измерения оптической плотности в различных градиентных фракций и смешать 30 мкл обоих образцов с последующим разделением на 13% SDS полиакриламидном геле.
5. Пятно белковых полос с раствором Кумасси (85% фосфористой кислоты, 757 мМ сульфат аммония, 1,2% кумасси бриллиантовым голубым, 20% метанол) в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
6. Для удаления неспецифическую окрашивание, мыть несколько раз DDH ₂ O.
7. Нарежьте полосы в 1 мм гелевых кусочки и приступить к перевариванию в геле.
   (С другой стороны, образцы можно сушить несколько минут в вакуумной центрифуге и хранить в течение нескольких недель, прежде чем продолжить пищеварения в геле.)

8. В геле Пищеварение (изменения от Шевченко и др. ^35.)

Пожалуйста, обратите внимание, чтобы подготовить все буферы и решения непосредственно перед применением и принять стеклянные бутылки для буферов, содержащих ацетонитрил (ACN). <бр /> ВНИМАНИЕ! Работа с ACN может быть вредным; более подробную информацию можно скачать с сайта: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

1. Вымойте кусочки геля с> 10 объемов DDH ₂ O (~ 200 мкл) в течение 30 сек.
2. Инкубируйте геля штук 300 мкл 25 мМ NH ₄ HCO ₃ в течение 15 мин при встряхивании, удалить жидкость.
3. Инкубируйте кусочки геля с 300 мкл 25 мМ NH ₄ HCO ₃ в 50% ACN (приготовить путем смешивания ACN и 50 мМ NH ₄ HCO ₃ в соотношении 1:1) в течение 15 мин при встряхивании удалить жидкость.
4. Если кусочки геля все еще ​​синий, повторяю NH ₄ HCO ₃ и NH ₄ HCO ₃ / ACN моет, пока большая часть Coomassie не будет удален.
   (Хотя большая часть окрашивания кумасси должны быть удалены, это не является необходимым для destain на кусочки геля полностью.)
5. Добавить 100 мкл ACN для обезвоживания куски геля в течение 5 мин. Куски геля должны сокращатьсяй выглядеть совершенно белый.
6. Удалить столько ACN, насколько это возможно и заполните трипсина пищеварения. Кроме того, образцы можно хранить при -20 ° С в течение нескольких недель.
7. Добавить 10-20 мкл на полосе 20 нг / мкл трипсина в 10% ACN / 25 мм NH ₄ HCO ₃ (недавно разбавленный), держать образцы на льду.
8. Через 30 мин проверить, все раствор абсорбировали и добавить больше трипсина буфер, если это необходимо. Гель части должны быть полностью покрыты трипсина буфера. Хранить образцы на льду.
9. Оставьте гель куски еще на 90 мин на льду, чтобы насытить их трипсином.
   (Критический шаг: выход триптических пептидов значительно возрастает с увеличением времени инкубации на льду, вероятно, из-за медленной диффузии фермента в полиакриламидном матрицы Надо иметь небольшой избыток раствора покрытия гель части, чтобы избежать, что куски. падать сухой во время инкубации в течение ночи.)
10. Дайджест при 37 ° С в течение 4-6 часов. Для проведения экспериментов, требующихмаксимальная восстановления пептид, переварить в одночасье.
11. После переваривания спин вниз сгущенное буфер.
12. Соникатные трубы для 5 мин для элюирования пептидов и центрифуги снова.
13. Сбор супернатант и перенести его в новую пробирку.
14. Выполните извлечение пептида с 80 мкл 30% ACN / 1% муравьиной кислоты (FA) в звуковой бане в течение 15 мин.
15. Выполнение экстракции 80 мкл 30% ACN / 1% FA в звуковой бане в течение 15 мин.
16. Выполнение экстракции 80 мкл 70% ACN / 1% FA в звуковой бане в течение 15 мин.
17. Центрифуга снова и бассейн супернатант с предварительного элюата.
    (ФА служит для инактивации трипсина и увеличить пептидной растворимости.)
18. Сухой раствор пептида полностью в вакуумной центрифуге.
    (На этом этапе образцы могут храниться в течение нескольких недель в -20 ° С, до того как MS-анализа).
19. Ресуспендируйте пептиды в 6 мкл MS буфера (5% ACN, 0,1 об / об FA, воды) и ультразвуком в течение 2-5 мин.
20. Центрифуга образцов при MaximuСкорость м в течение 5 мин, чтобы удалить материал в виде частиц.
21. Используйте 4 мкл супернатанта для масс-спектрометрического анализа.

9. MS-анализа данных с "Proteomatic"

Анализ данных проводили с открытым исходным кодом программного обеспечения "Proteomatic" (который может быть загружен в http://www.proteomatic.org/), платформе, которая позволяет генерировать и завершение MS / MS оценки данных трубопроводов, с помощью свободные и несвободные программы ^36. Коротко, настройки описаны ниже и более подробную информацию можно найти в ^6,26.

1. Идентификации и количественной оценки MS-данных
   Идентификация и количественное определение белков из экспериментов WT против ΔPSI были сделаны с OMSSA (версия 2.1.4 ³⁷⁾ и qTrace ^26, соответственно, как описано ^6,26. Для анализа МС-данных от эксперимента WT против pgrl1 следующих обновленный трубопровод был использован:
   1. В дополнение к OMSSA ^37, белки также были определены с X! Тандем (версия 2013.02.01 ^38). Оба алгоритма были применены с помощью функции поиска в базе данных генерируется путем объединения JGI хламидомонады ген модель базы данных версии 4.3 с базой данных Огастес версии 10.2, а также против объединенной базе данных NCBI базы данных BK000554.2 и NC_001638.1.
   2. MS ² идентификации пептидов проводили с использованием мишени приманки подхода ^39. Манок для каждого белка был создан случайно перетасовки триптических пептиды, сохраняя при этом избыточность nonproteotypic пептидов.
   3. Статистическая проверка пептидов проводили с qvality программного обеспечения (версия 0.3.3 ⁴⁰⁾ с использованием ошибке задней вероятность (PEP) пороговое менее 0,01 и результаты были отфильтрованы с предшественника массового допуском 5 частей на миллион.
   4. Пептиды из OMSSA и X! Тандем работает присоединились и количественно с qTrace ^{26 применяя следующие шаги фильтра: требуют MS 2 идентификацию, добавить имена белка / информацию о группе и требуют обе сестры пептиды.}

Чтобы исследовать ли соотношение белка значительно отличались друг к другу в смешанных CEF-сверхсложные фракций из WT и pgrl1, Статистический анализ проводили с применением программы SPSS программного обеспечения (версия 21). В субъединицы цитохром б ₆ / _F комплекса были испытаны против друг друга, а также белков FNR, FTSH2 и HCF136 против PSI субъединиц. Пептидные отношения каждого сканирования подсчета на белка всех четырех повторах были протестированы на нормального распределения с теста Шапиро-Wilks. Так как популяция пептидные не нормально распределены (р <0,001), были выполнены непараметрические статистики. Во-первых, критерий Крускала-Уоллиса был применен оценки значительное расхождение между группами. Только если этот тест предсказал существенное различиес между группами, дальнейший анализ проводили предсказать значимых различий между двумя независимыми группами с Mann-Whitney U-тест.

Results

Введенный количественный подход протеомика стремится охарактеризовать состав мультибелковых комплексов в мембранах тилакоидов показывает сравнительный анализ CEF-сверхсложных компонентов в генетически различных C. reinhardtii штаммов. Описанный метод был успешно применен на Terashima соавт. ⁶ и включает в себя изоляцию мембран тилакоидов из анаэробных вырос культур, а затем моющего растворения. Впоследствии образцы загружаются градиента плотности сахарозы на основе равного количества хлорофи...

Discussion

Различные количественные протеомные исследования с использованием стабильным изотопом маркировки были опубликованы в последние годы. В этих экспериментах обычно два различных образцов сравниваются, из которых один образец помечен стабильного изотопа. После этого белки или пептиды из двух образцов объединены в равном соотношении и дополнительно обрабатываются вместе ^48. Такие исследования часто намерены сравнить определенные изолированные клеточные отсеков (например, хлоропласты, митохондрии, или мемб...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильно>Химикаты
уксусная кислота	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
Ацетон	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
Ацетонитрил Optigrade fü r LC-MS	Diagonal	9340	Вредно, работать в перчатках. Дополнительные меры предосторожности см. в тексте протокола. https://www.diagonal.de/
Хлорид аммония 15	N Cambridge Isotope Laboratories	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Хлорид аммония 14N	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
Гидрофосфат аммония	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
сульфат аммония	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250	Fisher Scientific	10041653	http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-мальтозид	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
Муравьиная кислота	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
Хлорид магния	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
Метанол	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
Фосфористая кислота	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
Гидрофосфат дикалия	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
Дигидрофосфат калия	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
Гидроксид натрия	AppliChem	A1551
http://www.applichem.com/home/ Сахароза	AppliChem	A1125	http://www.applichem.com/home/
Tricine	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
Трипсин (модифицированный класс секвенирования) и буфер для трипсина	Promega	V5111
http://www.promega.de/Оборудование
			http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Центрифужные пробирки (14 мм x 89 мм)	Beckman Coulter	331372	для приготовления градиентов в стиле Такахаси http://www.beckmancoulter.de/
Центрифужные пробирки 25 мм x 89 мм	Beckman Coulter	344058	для получения тилакоидных градиентов изоляции. <>http://www.beckmancoulter.de/
Коултер Avanti Centrifuge J-20 XP	Beckman Coulter		http://www.beckmancoulter.de/
Камера для соотнесения ячеек Фукса-Розенталя	Диагональ	449/72	https://www.diagonal.de/
Гомогенизатор (Поттер) 50 мл&nbл;	Fisherbrand	10618242	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
пестик для гомогенизатора	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
ультрацентрифуга (ультрацентрифуга Optima XPN-80)	Beckman Coulter		веб-сайт: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Антитела	Агрисара		http://www.agrisera.com/en/index.html